雙（α-呋喃甲酸）氧釩合成方法的改進(jìn)及抗癌作用研究

李 雪，高麗輝，高安麗**，姜 婧，巨少英，余 娟

(1. 昆明貴金屬研究所 稀貴金屬綜合利用新技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650106；2. 昆明醫(yī)科大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)工程研究中心，云南 昆明 650500)

在臨床常用的70多種抗癌藥物中，以順鉑為代表的鉑類藥物占有重要的位置，已廣泛用于肺癌、卵巢癌、結(jié)腸癌等常見(jiàn)腫瘤的一線治療，約占所有癌癥化療方案中的50%[1-4]. 盡管如此，目前鉑類抗癌藥物的臨床應(yīng)用還存在兩大障礙：毒副反應(yīng)和出現(xiàn)耐藥性. 在化療過(guò)程中，癌細(xì)胞對(duì)既往使用過(guò)的鉑類藥物不敏感、產(chǎn)生耐藥性，而耐藥性的產(chǎn)生降低藥物的療效，導(dǎo)致用藥劑量的增加，這又加重了藥物的毒副反應(yīng)，最終造成化療的失敗[5-7]. 因此，尋找能克服或降低癌細(xì)胞耐藥的新型無(wú)機(jī)抗癌藥物一直是抗癌藥物研究的重要方向之一.

釩是人體必需的微量元素，早在1985年加拿大科學(xué)家McNeill發(fā)現(xiàn)釩的化合物在葡萄糖的代謝過(guò)程中起著重要作用，具有多樣化的生物學(xué)效應(yīng)，尤其是類胰島素效應(yīng)[8]. 2005年由加拿大British Columbia 大學(xué)研制的有機(jī)釩抗糖尿病藥物雙（乙基麥芽糖酚）氧釩（BEOV）作為第一個(gè)釩類藥物在英國(guó)進(jìn)入Ⅰ期臨床試驗(yàn)[9]，2007年11月BEOV作為口服胰島素調(diào)節(jié)劑在美國(guó)進(jìn)入Ⅱ期臨床試驗(yàn)[10-12].2008年北京大學(xué)王夔院士團(tuán)隊(duì)和南開(kāi)大學(xué)閆世平教授團(tuán)隊(duì)等在這方面的研究也取得了重要進(jìn)展[13].然而，國(guó)內(nèi)外關(guān)于釩的抗癌作用的研究和報(bào)道較少. 1965年J Kieler等首次研究表明釩鹽具有抗腫瘤作用[14]，2000 年美國(guó) Parker Hughes Institute 提出釩(Ⅳ)配合物和順鉑均能與核DNA相互作用的觀點(diǎn)，研究表明它們的作用位點(diǎn)不同，順鉑通過(guò)共價(jià)鍵配位到DNA上嘌呤環(huán)的第7位氮原子上，而釩和核苷酸磷酸基團(tuán)相互作用而打斷Watson-Crick氫鍵[15-17]. 與此同時(shí)，美國(guó)的其他團(tuán)隊(duì)例如俄亥俄大學(xué)醫(yī)學(xué)院內(nèi)科學(xué)系合成并評(píng)價(jià)了一些釩的化合物，但均未發(fā)現(xiàn)優(yōu)于順鉑的釩類化合物，研究進(jìn)展相對(duì)比較緩慢[18-19].

雙 (α-呋喃甲酸)氧釩（BFOV，圖 1）為筆者項(xiàng)目組合成的一種新型釩配合物，它是以糠醛在人體內(nèi)的代謝產(chǎn)物α-呋喃甲酸為配體的有機(jī)釩配合物，為非離子型配合物. 前期研究表明BFOV對(duì)四氧嘧啶和STZ誘導(dǎo)的1型糖尿病動(dòng)物、高脂高糖+小劑量STZ誘導(dǎo)的2型糖尿病動(dòng)物，均能明顯降低其血糖、促進(jìn)糖原合成和改善脂代謝紊亂，而且雙(α-呋喃甲酸)氧釩的毒性明顯低于國(guó)外正在臨床試驗(yàn)的同類化合物 BEOV，且連續(xù)灌胃給予 20 mg·kg?1(有效劑量)后，大鼠出現(xiàn)毒副反應(yīng)和釩在體內(nèi)的積累明顯低于BEOV，顯示出一定的優(yōu)越性[20-26].

圖 1 VO(C5H3O3)2（BFOV）的結(jié)構(gòu)式Fig. 1 The structure of VO(C5H3O3)2 (BFOV)

基于雙（α-呋喃甲酸）氧釩具有較好的水溶性和較低的毒副作用，我們?cè)谘芯亢驮u(píng)價(jià)其作為糖尿病藥物的成藥性時(shí)，開(kāi)展了抗癌作用研究，并通過(guò)定量加入碳酸鋇、檢查反應(yīng)終點(diǎn)和冷凍干燥除去溶劑（水）等手段對(duì)原來(lái)的合成方法進(jìn)行改進(jìn)，以提高產(chǎn)率和產(chǎn)品的純度，滿足生物學(xué)試驗(yàn)時(shí)靜脈給藥的要求. 本文將報(bào)告雙（α-呋喃甲酸）氧釩合成的新方法、抗癌活性、特別是對(duì)順鉑耐藥細(xì)胞株的活性以及對(duì)癌細(xì)胞的選擇性和初步毒性.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 化學(xué)合成

1.1.1 儀 器 和 試 劑 紫 外 光 譜 用 島 津 MPS 2 2000型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定. 核磁共振氫譜用BRUKER AM 2400超導(dǎo)核磁測(cè)定（四價(jià)釩為d1，屬于順磁性的化合物，會(huì)影響核磁測(cè)定，因此不采用核磁氫譜來(lái)解析其結(jié)構(gòu)）. 紅外光譜用美國(guó)Nicolet 170 SXFT 2 IR 光譜儀測(cè)定，KBr壓片法. 質(zhì)譜用 VG AutoSpec 3000 質(zhì)譜儀測(cè)定. 元素分析：C，H分析采用意大利Carlo 2 Erba1106型元素分析儀測(cè)定；V的含量采用經(jīng)典的EDTA滴定法測(cè)定. 所有試劑均為市售A.R.級(jí).

癌細(xì)胞株 A549、A549/DDP、SKOV3、SKOV3/DDP和肺正常上皮細(xì)胞株Beas-2B均購(gòu)自美國(guó)ATCC. ICR 小鼠，雌雄各半，50 只，體重 18～22 g，由成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(川）2008-24. AL204 電子天平：梅特勒?托利多儀器（上海）有限公司；GL-88B漩渦混合器：海門市其林貝爾儀器制造有限公司.

1.1.2 雙（α-呋喃甲酸）氧釩的制備 稱取 22.4 g（0.2 mol）α?呋喃甲酸，溶于 150 mL 水中，加入碳酸鋇 (19.7 g, 0.1 mol)，在 45 ℃ 下反應(yīng) 5 h，得到無(wú)色的清亮溶液. 準(zhǔn)確取儲(chǔ)備的 1.0 mol/L VOSO4溶液102 mL(相當(dāng)于 0.102 mol，過(guò)量 1%)，與上述溶液在室溫下混合并攪拌反應(yīng)至用硫酸鈉檢查不到有游離的鋇離子存在為止，這步反應(yīng)一般需要3～4 h.過(guò)濾除去生成BaSO4，母液冷凍干燥得到綠色的雙 (α-呋喃甲酸)氧釩晶狀粉末約 30 g，產(chǎn)率 93%.經(jīng)元素分析、紅外光譜、質(zhì)譜鑒定符合確定的結(jié)構(gòu)式 . UV-vis(H2O)λmax(nm): 243(л→л*), 767 (2T2g→2Eg); IR (KBr, cm?1)ν: 1 630 (νas, COO― ), 1 383(νs,COO― ), 996 (V＝ O), 557(V― O); FAB-MS (m/z):289 (M+); 元素分析（w）理論計(jì)算 VO (C5H3O3)2?2H2O: C 36.86%, H 0.01%, V 15.65%; 實(shí)測(cè) C 36.92%,H 0.03%, V, 15.69%. 樣品中殘留的鋇采用電感耦合等離子發(fā)射光譜法(ICP-AES)測(cè)定，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8.5 mg/kg.

1.2 生物活性試驗(yàn)

1.2.1 雙（α-呋喃甲酸）氧釩的抗癌作用的測(cè)定 以水為溶媒、以順鉑（cisplatin）為陽(yáng)性對(duì)照藥品，采用標(biāo)準(zhǔn)MTT法測(cè)定雙(α-呋喃甲酸)氧釩對(duì)人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株A549和人卵巢癌細(xì)胞株SKOV3生長(zhǎng)的抑制作用，平行測(cè)定3次，藥物與癌細(xì)胞的作用時(shí)間分別為48 h和72 h. 計(jì)算藥物抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)的半數(shù)質(zhì)量濃度IC50. 采用同樣的試驗(yàn)方法，測(cè)定雙(α-呋喃甲酸)氧釩對(duì)耐受順鉑的人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株A549/DDP、人卵巢癌細(xì)胞株SKOV3/DDP生長(zhǎng)的抑制作用.

1.2.2 雙（α-呋喃甲酸）氧釩毒性的測(cè)定

（1）對(duì)人正常肺上皮細(xì)胞的毒性測(cè)定. 以水為溶媒、以順鉑（cisplatin）為陽(yáng)性對(duì)照藥品，采用標(biāo)準(zhǔn)MTT法測(cè)定雙(α-呋喃甲酸)氧釩對(duì)人肺支氣管上皮細(xì)胞Beas-2B生長(zhǎng)的抑制作用，計(jì)算半數(shù)抑制濃度IC50，平行測(cè)定3次，藥物與細(xì)胞的作用時(shí)間為 72 h.

（2）對(duì)小鼠的急性毒性測(cè)定. 選擇健康的昆明小鼠50只，雄雌各一半，體重在18～22 g，隨機(jī)分為 5組，每組10只，給藥前動(dòng)物禁食約8 h，雙(α-呋喃甲酸)氧釩（BFOV）用5%葡萄糖溶液溶解，動(dòng)物按0.2 mL/10 g體重進(jìn)行小鼠尾靜脈給藥，給藥后連續(xù)觀察14 d動(dòng)物的中毒反應(yīng)和死亡情況，并計(jì)算藥物的半致死量LD10、LD50.

另外，選擇健康的昆明小鼠50只，雄雌各一半，體重在18～22 g，隨機(jī)分為5組，每組10只，給藥前動(dòng)物禁食約8 h，順鉑（cisplatin）用生理鹽水溶解，動(dòng)物按0.2 mL/10 g體重進(jìn)行小鼠尾靜脈給藥，給藥后連續(xù)觀察14 d動(dòng)物的中毒反應(yīng)和死亡情況，并計(jì)算藥物的半致死量LD10、LD50.

2 結(jié)果與討論

2.1 雙（α-呋喃甲酸）氧釩的制備采用如 1.1所述的方法合成出雙（α-呋喃甲酸）氧釩，因?yàn)殇^離子注射給藥對(duì)動(dòng)物和人均具有高毒性. 與文獻(xiàn)[26]相比，本合成過(guò)程中增加了對(duì)反應(yīng)終點(diǎn)的觀察和鋇殘留量的控制. 同時(shí)，采用冷凍干燥技術(shù)，在低溫下將溶劑（水）升華除去，以避免采用減壓蒸餾時(shí)過(guò)高的溫度使部分釩氧化成+5價(jià). 改進(jìn)后，產(chǎn)品的產(chǎn)率和純度均有所提高，產(chǎn)率由原先的81%提高到了93%，產(chǎn)品中鋇的殘留量小于10 mg/kg.

2.2 雙（α-呋喃甲酸）氧釩的抗癌活性雙（α-呋喃甲酸）氧釩和順鉑對(duì)人肺癌細(xì)胞株A549和人卵巢癌細(xì)胞株SKOV3的生長(zhǎng)均有很好的抑制作用，且呈現(xiàn)良好的量效關(guān)系和時(shí)效關(guān)系. 如表1的結(jié)果所示，在兩個(gè)作用時(shí)間下，BFOV對(duì)SKOV3的半數(shù)抑制質(zhì)量濃度IC50均小于順鉑，對(duì)A549的IC50與順鉑相當(dāng). 特別是它對(duì)耐受順鉑的A549和SKOV3（耐藥指數(shù)約3～4）有更高的抑制活性，72 h作用時(shí)間的 IC50分別是 1.19 μmol/L 和 0.29 μmol/L，可以完全對(duì)抗癌細(xì)胞對(duì)順鉑耐藥，結(jié)果顯示可能存在與順鉑不一樣的抗癌機(jī)制.

表 1 雙（α-呋喃甲酸）氧釩（BFOV）抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)的 IC50Tab. 1 The IC50 of bis (α-furanoic acid) vanadyl (BFOV) inhibiting cancer cell growth

2.3 雙（α-呋喃甲酸）氧釩對(duì)肺癌細(xì)胞和正常肺細(xì)胞之間的選擇性表2為雙（α-呋喃甲酸）氧釩（BFOV）和順鉑對(duì)人肺正常上皮細(xì)胞（Beas-2B）生長(zhǎng)的影響，BFOV和順鉑與Beas-2B作用72 h后半數(shù)濃度IC50分別為16.0 μmol/L 和2.61 μmol/L，BFOV對(duì)正常細(xì)胞的毒性小于順鉑，比較與對(duì)癌細(xì)胞的IC50可知，BFOV對(duì)癌細(xì)胞具有一定的選擇性.

表 2 雙（α-呋喃甲酸）氧釩（BFOV）抑制正常肺細(xì)胞生長(zhǎng)的 IC50（t =72 h，n =3）Tab. 2 The IC50 of bis (α-furanoic acid) vanadyl (BFOV) inhibiting the growth of normal lung cells (t =72 h, n =3)

2.4 雙（α-呋喃甲酸）氧釩的急性毒性表 3 為采用常規(guī)方法測(cè)定的雙(α-呋喃甲酸)氧釩和順鉑對(duì)小鼠的急性毒性數(shù)據(jù)，從LD10和LD50數(shù)據(jù)來(lái)看，BFOV 的數(shù)據(jù)分別為 17.1 mg/kg 和 22.3 mg/kg，這兩組數(shù)據(jù)分別均大于順鉑的對(duì)應(yīng)值，說(shuō)明靜脈注射給藥雙(α-呋喃甲酸)氧釩的急性毒性小于順鉑.

表 3 雙（α-呋喃甲酸）氧釩（BFOV）急性毒性Tab. 3 Acute toxicity of bis (α-furanoic acid) vanadyl (BFOV)

3 結(jié)論

本文提出了改進(jìn)的雙(α-呋喃甲酸)氧釩的合成方法，具有產(chǎn)率高且產(chǎn)品純度好的優(yōu)點(diǎn). 雙(α-呋喃甲酸)氧釩對(duì)人肺癌細(xì)胞A549和人卵巢癌細(xì)胞SKOV3有很強(qiáng)的抑制作用，對(duì)人卵巢癌SKOV3的抑制活性，明顯高于順鉑，并且對(duì)耐受順鉑的肺癌細(xì)胞（A549/DDP）和卵巢癌細(xì)胞（SKOV3/DPP）也具有高的抑制活性. 同時(shí)，它對(duì)人正常細(xì)胞（Beas-2B）的毒性和對(duì)小鼠的急性毒性均小于順鉑，顯示出一定的應(yīng)用前景. 目前，雙 (α-呋喃甲酸)氧釩作為抗癌藥物的用途已獲得國(guó)家發(fā)明專利授權(quán)（CN1035 99107B），下一步我們將在體內(nèi)試驗(yàn)它的抗癌效果和研究其抗癌機(jī)制.