黑木耳發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)HepG2細(xì)胞脂質(zhì)代謝及糖代謝的影響

孫凱峰，包怡紅

（東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院 哈爾濱150040）

隨著現(xiàn)代人們生活水平的不斷提升，高血脂癥及高血糖癥成為威脅人類健康的兩大流行疾病。高血脂癥的出現(xiàn)與脂質(zhì)代謝異常密切相關(guān)，除遺傳因素外，高脂高熱量食物的攝入，過(guò)量飲酒與缺乏鍛煉等不健康的生活方式使得血脂異常癥狀的患病率逐年上升[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)血脂異常人群達(dá)1.6 億以上[2]。由高血脂癥引發(fā)的腦血栓、心肌梗塞以及冠心病等一系列心腦血管疾病，更是威脅人類生命健康的重要因素。而高血糖癥同樣是威脅人類健康的殺手，以高血糖繼發(fā)的脂肪、蛋白質(zhì)、電解質(zhì)紊亂為特征，高血糖癥會(huì)引發(fā)糖尿病。糖尿病患者典型的癥狀為多飲、多食、多尿以及消瘦[3]。糖尿病對(duì)人類健康威脅極大，可導(dǎo)致病人心臟病變，腎功能衰竭進(jìn)而致死、致殘[4]。截至2017年，全世界糖尿病患者數(shù)目共4.25 億，我國(guó)人口基數(shù)較大，糖尿病患者人數(shù)逾4 700 萬(wàn)，據(jù)估計(jì)，到2045年，全世界糖尿病患者數(shù)目將達(dá)7 億，且大部分集中在發(fā)展中國(guó)家[5]。高血脂癥與高血糖癥相互關(guān)聯(lián)，高血糖癥導(dǎo)致的糖尿病會(huì)導(dǎo)致糖尿病人體內(nèi)胰島素含量降低，進(jìn)而導(dǎo)致體內(nèi)脂酶活性降低，血脂增高。糖尿病還會(huì)使病人體內(nèi)游離脂肪酸從脂肪庫(kù)中動(dòng)員出來(lái)，使血液中甘油三酯及游離脂肪酸濃度升高。而高脂血癥除引發(fā)肥胖癥、脂肪肝外，還是引發(fā)糖尿病的關(guān)鍵因素[6]。

黑木耳（Auricularia auricular）具有降血脂，降血糖，抗癌等作用，可作為藥材在臨床中使用，在食品和藥品領(lǐng)域受到廣泛關(guān)注[7]。劉榮等[8]發(fā)現(xiàn)黑木耳中的多糖能夠顯著降低小鼠體內(nèi)TC 與TG的含量。張燕燕等[9]提出黑木耳中含有的多糖及膳食纖維等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)能夠調(diào)節(jié)人體內(nèi)的糖代謝，促進(jìn)肝糖原合成，發(fā)揮降血糖作用。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，雙歧桿菌與面包酵母混合發(fā)酵能夠顯著提升黑木耳的降血脂功能特性[10]，分析發(fā)酵液所含成分，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵液中的主要成分為多糖類物質(zhì)，還含有還原糖、多酚以及黃酮類物質(zhì)。本試驗(yàn)通過(guò)活性跟蹤法，將黑木耳發(fā)酵產(chǎn)物按分子質(zhì)量進(jìn)行分級(jí)，以HepG2 細(xì)胞作為研究載體，對(duì)降血脂與降血糖功能差異進(jìn)行驗(yàn)證，分析HepG2 細(xì)胞中的總膽固醇、總甘油三酯、葡萄糖、肝糖原含量及總脂酶、己糖激酶活性變化，研究不同分子質(zhì)量黑木耳發(fā)酵產(chǎn)物降血脂及降血糖功能特性的變化，為黑木耳功能性產(chǎn)品的開發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑木耳，黑龍江省大興安嶺地區(qū)加格達(dá)奇林業(yè)局提供，經(jīng)黑龍江省科學(xué)院微生物研究所張丕奇研究員鑒定為木耳（Auricularia auricular（L.ex Hook.） Underwi）的干燥子實(shí)體；人肝癌細(xì)胞系HepG2 細(xì)胞株，東北林業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。

DMEM 培養(yǎng)基，通用電氣醫(yī)療集團(tuán)生命科學(xué)部；胎牛血清（FBS），浙江天杭生物科技股份有限公司；二甲基亞砜（DMSO），天津市寰宇精細(xì)化工有限公司；噻唑蘭（MTT）、油紅O、胰蛋白酶、青鏈霉素混合液，北京博奧拓達(dá)科技有限公司；蒽酮，上?；瘜W(xué)試劑采購(gòu)供應(yīng)五聯(lián)化工廠；TC、TG、總脂酶、總蛋白、葡萄糖、HK 測(cè)定試劑盒，南京建成生物工程研究所；其它試劑均為分析純級(jí)。

1.2 儀器與設(shè)備

CKX4 倒置顯微鏡，奧林巴斯工業(yè)有限公司；Spetramax 2e 全自動(dòng)酶標(biāo)儀，美國(guó)MD 公司；超凈工作臺(tái)，北京亞泰科隆儀器技術(shù)有限公司；二氧化碳培養(yǎng)箱，美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司；722 型可見分光光度計(jì)，上海光譜儀器有限公司；TGL-16G 離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；Satorius 超濾離心管Vivaspin 10 mL，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 不同分子質(zhì)量黑木耳發(fā)酵產(chǎn)物的制備 采用雙歧桿菌與面包酵母混合菌發(fā)酵黑木耳，菌種比例為2∶1，接種量為3%，發(fā)酵時(shí)間60 h，發(fā)酵溫度30°C，獲得黑木耳發(fā)酵上清液。采用超濾法分離出不同分子質(zhì)量黑木耳發(fā)酵上清液，80 ℃恒溫干燥，最終獲得0～10，10～50，50～100，100～300 ku以及＞300 ku 分子質(zhì)量的黑木耳發(fā)酵產(chǎn)物，前期研究發(fā)現(xiàn)發(fā)酵產(chǎn)物中的主要成分為多糖類物質(zhì)。

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng) HepG2 細(xì)胞置于含有10%FBS，1%青鏈霉素混合液的DMEM 完全培養(yǎng)基中，37 ℃，5%CO2飽和濕度細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換液。對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期匯合度大于80%可以傳代，4 mL PBS 清洗2 次，0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞10～15 min，至細(xì)胞脫離瓶壁，轉(zhuǎn)移至離心管中，無(wú)菌針頭吹至單細(xì)胞，以1∶3 的比例傳代培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)[11]。

1.3.3 細(xì)胞分組及處理 將1×105個(gè)/mL 的細(xì)胞懸液1 mL 接種到24 孔板中，采用油酸終濃度為1 mmol/mL 的培養(yǎng)基（100 μL 油酸溶于3.06 mL 0.1 mol/L 的NaOH 中，與10%PBS 溶液混合配成油酸濃度為10 mmol/L 的溶液，用含1%FBS 的DMEM 高糖培養(yǎng)基稀釋至1 mmol/mL） 進(jìn)行高脂模型的建立[12]。將HepG2 細(xì)胞分為5 組，分別為對(duì)照組（高脂模型組），0～10 ku 黑木耳發(fā)酵產(chǎn)物處理組（1～4 mL），10～50 ku 黑木耳發(fā)酵產(chǎn)物處理組（1～4 mL），50～100 ku 黑木耳發(fā)酵產(chǎn)物處理組（1～4 mL），100～300 ku 黑木耳發(fā)酵產(chǎn)物處理組（1～4 mL），＞300 ku 黑木耳發(fā)酵產(chǎn)物處理組（1～4 mL），培養(yǎng)24 h 后做后續(xù)的細(xì)胞試驗(yàn)。

1.3.4 細(xì)胞存活率測(cè)定（MTT 法） 小心吸取培養(yǎng)后各孔培養(yǎng)液丟棄，加入含有MTT 的培養(yǎng)液1 mL（5 mg/mL MTT 溶液100 μL，900 μL 培養(yǎng)液），并設(shè)置空白調(diào)零組，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，終止培養(yǎng)。小心吸棄培養(yǎng)液，每孔加入150 μL DMSO，小心振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。全自動(dòng)酶標(biāo)儀于490 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光值，來(lái)判斷活細(xì)胞數(shù)量[13]。細(xì)胞存活率按式（1）計(jì)算。

式中，A0——調(diào)零組的吸光度；A1——樣品組的吸光度；A2——對(duì)照組的吸光度。

1.3.5 油紅O 染色 小心吸棄培養(yǎng)液，2 mL PBS溶液清洗細(xì)胞，并吸棄PBS。加入2 mL 10%福爾馬林溶液，室溫放置10 min。換新的10%福爾馬林溶液，室溫放置1 h，吸棄福爾馬林，以2 mL 蒸餾水清洗細(xì)胞2 次。加2 mL 60%異丙醇，室溫放置5 min，吸棄異丙醇，室溫放置或用電吹風(fēng)小心吹干細(xì)胞。每孔加1 mL 油紅O 工作液，室溫放置10 min，棄去油紅O，用1 mL 蒸餾水清洗細(xì)胞4 次，用顯微鏡觀察染色情況；吸棄蒸餾水后，放置待細(xì)胞干。每孔加1 mL 100%異丙醇，輕柔搖晃10～15 min 使染劑溶解充分，以100%異丙醇調(diào)零，于500 nm 波長(zhǎng)下采用分光光度計(jì)比色[14]。

1.3.6 TG 含量測(cè)定 小心吸棄培養(yǎng)液，2 mL PBS溶液清洗細(xì)胞，并吸棄PBS。0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞5～10 min，至細(xì)胞懸浮，轉(zhuǎn)移至離心管中，1 000 r/min 離心10 min。棄去上清液，留細(xì)胞沉淀。加入0.2 mL PBS，冰水浴條件下超聲破碎[15]。制備好的勻漿液用TG 試劑盒測(cè)定TG 含量。

1.3.7 TC 含量測(cè)定 勻漿液制備操作同1.3.6 節(jié)的方法，將制備好的勻漿液用TC 試劑盒測(cè)定TC含量[16]。

1.3.8 總脂酶（LPL+HL）活性測(cè)定 勻漿液制備操作同1.3.6 節(jié)的方法，制備好的勻漿液用總脂酶試劑盒測(cè)定總脂酶活性。

1.3.9 葡萄糖含量測(cè)定 勻漿液制備操作同1.3.6 節(jié)的方法，制備好的勻漿液用葡萄糖氧化酶法測(cè)定葡萄糖含量[17]。

1.3.10 肝糖原含量測(cè)定 勻漿液制備操作同1.3.6 節(jié)的方法，制備好的勻漿液用BCA 法蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白含量，剩余的細(xì)胞勻漿液進(jìn)行糖原含量測(cè)定，參照文獻(xiàn)[18]，稍加改進(jìn)。細(xì)胞勻漿液以無(wú)水乙醇沉淀過(guò)夜，然后采用蒽酮法測(cè)定糖原含量，計(jì)算肝糖原含量。肝糖原含量按式（2）計(jì)算。

式中，C1——糖原濃度（mmol/mL）；C2——蛋白質(zhì)量濃度（mg/mL）。

1.3.11 HK 活性測(cè)定 勻漿液制備操作同1.3.6節(jié)的方法，制備好的勻漿液用HK 試劑盒測(cè)定HK活性。

1.4 數(shù)據(jù)分析處理

采用Origin 8.6 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理及繪制，試驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差（±s）表示，采用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行相關(guān)性與顯著性分析，P＜0.05 具有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 MTT 試驗(yàn)結(jié)果

不同分子質(zhì)量和質(zhì)量濃度的黑木耳發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)正常HepG2 細(xì)胞存活率的影響如表1所示。由表1可知，黑木耳發(fā)酵產(chǎn)物分子質(zhì)量和質(zhì)量濃度的變化均不影響HepG2 細(xì)胞的活力，與空白組之間無(wú)顯著差異（P＞0.05），對(duì)細(xì)胞增殖無(wú)顯著影響。根據(jù)后續(xù)細(xì)胞試驗(yàn)的要求及安排，發(fā)酵產(chǎn)物作用于HepG2 細(xì)胞時(shí)，既要保證其產(chǎn)生相應(yīng)的功能特性，同時(shí)還應(yīng)當(dāng)不影響細(xì)胞正常的生長(zhǎng)發(fā)育，以免影響試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性[19]。因此選擇表1中的5個(gè)分子質(zhì)量，4 mg/mL 質(zhì)量濃度作為之后試驗(yàn)的條件。

表1 MTT 試驗(yàn)細(xì)胞存活率Table 1 Cell survival rate of MTT experimental

2.2 油紅O 染色與OD 值測(cè)定結(jié)果

圖1為倒置顯微鏡下觀察的細(xì)胞形態(tài)。經(jīng)過(guò)油紅O 染色的HepG2 細(xì)胞呈不規(guī)則的橢圓球型，邊緣較粗糙，細(xì)胞間存在一定間隙，紅色脂滴顆粒清晰，見圖1空白組。通過(guò)添加不同分子質(zhì)量黑木耳發(fā)酵產(chǎn)物作用于HepG2 細(xì)胞后，紅色脂滴在不同程度上有所減少。油紅O 染色OD 值測(cè)定結(jié)果見表2。由表2可知，不同分子質(zhì)量黑木耳發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)HepG2 細(xì)胞模型中脂質(zhì)含量均有下調(diào)效果。下調(diào)模型中脂質(zhì)含量變化較為明顯的分子質(zhì)量集中在100～300 ku 之間，其與10～50 ku 和＞300 ku無(wú)顯著性差異（P＞0.05），與空白組及其它組之間差異顯著（P＜0.05）。由此可見，黑木耳發(fā)酵產(chǎn)物能夠降低高脂細(xì)胞模型內(nèi)的脂質(zhì)含量，調(diào)節(jié)細(xì)胞脂質(zhì)代謝。這可能與黑木耳發(fā)酵產(chǎn)物中的多糖類物質(zhì)有關(guān)，覃玉娥等[20]通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)竹節(jié)參多糖作用于HepG2 高脂模型細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)脂滴數(shù)明顯減少，細(xì)胞腫脹減輕，對(duì)脂肪變性肝細(xì)胞起到了保護(hù)作用。

圖1 油紅O 染色后觀察細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)含量Fig.1 Observation of intracellular lipid content by oil red O staining

表2 油紅O 染色OD 值測(cè)定結(jié)果Table 2 Determination results of OD value by oil red O staining

2.3 不同分子質(zhì)量黑木耳發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)TG 含量的影響

由圖2可知，不同分子質(zhì)量黑木耳發(fā)酵產(chǎn)物作用于HepG2 細(xì)胞24 h 后，細(xì)胞內(nèi)的TG 含量均下降。其中，對(duì)TG 含量影響最為明顯集中在分子質(zhì)量＞300 ku，可達(dá)0.87 mmol/g 蛋白，其與空白組之間差異顯著（P＜0.05），與其它組之間無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。欒淑瑩[21]在黑木耳的研究中發(fā)現(xiàn)，黑木耳多糖能夠有效抑制高脂模型小鼠血清內(nèi)TG 含量的升高，加速水解脂質(zhì)和水溶性底物，調(diào)節(jié)甘油三酯代謝，并與高脂組差異顯著（P＜0.05）。黑木耳發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)TG 含量的影響可能是由于發(fā)酵產(chǎn)物中的多糖組分在起作用，且較高分子質(zhì)量的黑木耳發(fā)酵產(chǎn)物作用于HepG2 細(xì)胞后使TG 含量更低。

圖2 不同分子質(zhì)量黑木耳發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)TG 含量的影響Fig.2 Effect of fermentation products of A.auricular with different molecular weights on TG content

2.4 不同分子質(zhì)量黑木耳發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)TC 含量的影響

圖3 不同分子質(zhì)量黑木耳發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)TC 含量的影響Fig.3 Effect of fermentation products of A.auricular with different molecular weights on TC content

由圖3可知，不同分子質(zhì)量黑木耳發(fā)酵產(chǎn)物作用于HepG2 細(xì)胞24 h 后，細(xì)胞內(nèi)的TC 含量均下降。其中，對(duì)TC 含量影響最為明顯的分子質(zhì)量集中在100～300 ku 之間，可達(dá)0.34 mmol/g 蛋白，其與E 組之間不存在顯著性差異（P＞0.05），與空白組以及其它組之間差異顯著（P＜0.05）。于美匯等[22]研究發(fā)現(xiàn)，黑木耳中的酸性多糖可以明顯降低高血脂癥小鼠的總膽固醇水平，達(dá)到降低小鼠血脂水平的目的。這與黑木耳發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)TC 水平調(diào)節(jié)的研究結(jié)果相吻合，且較高分子的黑木耳發(fā)酵產(chǎn)物作用于HepG2 細(xì)胞后使TC 含量更低。

2.5 不同分子質(zhì)量黑木耳發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)總脂酶活性的影響

由圖4可知，不同分子質(zhì)量黑木耳發(fā)酵產(chǎn)物作用于HepG2 細(xì)胞24 h 后，細(xì)胞內(nèi)的LPL 活性均上升。其中，對(duì)LPL 活性影響最為明顯的分子質(zhì)量集中在100～300 ku 之間，可達(dá)1.81 U/mL，其與空白組之間差異顯著（P＜0.05），與其它組之間無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。LPL 主要在心臟、骨骼肌和脂肪組織中合成，是管理血脂水平的一種關(guān)鍵酶。能夠水解富含TG 的脂蛋白中的核心TG，調(diào)節(jié)細(xì)胞脂質(zhì)代謝平衡[23]。黑木耳發(fā)酵產(chǎn)物通過(guò)作用HepG2 細(xì)胞，提升細(xì)胞中LPL 活性，促進(jìn)脂蛋白中的TG 代謝，降低TG 含量，這與2.3 節(jié)中的研究結(jié)果相吻合。

由圖5可知，不同分子質(zhì)量黑木耳發(fā)酵產(chǎn)物作用于HepG2 細(xì)胞24 h 后，細(xì)胞內(nèi)的HL 活性均上升。其中，對(duì)HL 活性影響最為明顯的分子質(zhì)量集中在100～300 ku 之間，可達(dá)3.77 U/mL，其與空白組和A 組之間差異顯著（P＜0.05），與B，C，E 組之間無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。肝脂酶屬于與血液循環(huán)中內(nèi)源性TG 代謝有關(guān)的酶之一，與LPL 在功能上有相似之處。HL 主要作用于極低密度脂蛋白殘粒中的TG，降低TG 含量[24]，達(dá)到降低血脂的目的，這與上述的研究結(jié)果相吻合。由此可見，黑木耳發(fā)酵產(chǎn)物可能是通過(guò)提升細(xì)胞內(nèi)總脂酶的活性，加速對(duì)TC、TG 的代謝消耗，進(jìn)而調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝，達(dá)到降脂的目的。且對(duì)細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)代謝影響較為明顯的黑木耳發(fā)酵產(chǎn)物的分子質(zhì)量集中在100～300 ku 與＞300 ku 之間。真菌多糖的生物活性與其一級(jí)結(jié)構(gòu)和高級(jí)構(gòu)象密切相關(guān)，多糖分子在溶液中的鏈構(gòu)象又受其分子質(zhì)量的影響，一般具有100～200 ku 的高分子質(zhì)量組分呈較強(qiáng)的活性[25]。

圖4 不同分子質(zhì)量黑木耳發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)LPL 活性的影響Fig.4 Effect of fermentation products of A.auricular with different molecular weights on LPL activity

圖5 不同分子質(zhì)量黑木耳發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)HL 活性的影響Fig.5 Effect of fermentation products of A.auricular with different molecular weights on HL activity

2.6 不同分子質(zhì)量黑木耳發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)葡萄糖含量的影響

由圖6可知，不同分子質(zhì)量黑木耳發(fā)酵產(chǎn)物作用于HepG2 細(xì)胞24 h 后，細(xì)胞內(nèi)的葡萄糖含量均下降。其中，對(duì)葡萄糖含量影響最為明顯的分子質(zhì)量＞300 ku，可達(dá)0.44 mmol/L，其與空白組和C組之間差異顯著（P＜0.05），與A，B，D 組之間無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。研究發(fā)現(xiàn)，百合中所含有的多糖成分能夠顯著促進(jìn)組織對(duì)葡萄糖的利用，抑制肝糖異生及糖原分解，減少肝糖輸出，使血糖下降，達(dá)到降糖的目的[26]。馮雁波等[27]的研究發(fā)現(xiàn)松仁粕膳食纖維能夠延遲葡萄糖的吸收，降低葡萄糖濃度，從而達(dá)到降糖的目的。且較高分子質(zhì)量的黑木耳發(fā)酵產(chǎn)物作用于HepG2 細(xì)胞后使葡萄糖含量更低。

2.7 不同分子質(zhì)量黑木耳發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)肝糖原含量的影響

由圖7可知，不同分子質(zhì)量黑木耳發(fā)酵產(chǎn)物作用于HepG2 細(xì)胞24 h 后，細(xì)胞內(nèi)的肝糖原含量均上升。其中，對(duì)肝糖原含量影響最為明顯的分子質(zhì)量＞300 ku，可達(dá)1.42 μmol/mg，其與E 組之間無(wú)顯著性差異（P＞0.05），與空白組及其它組之間差異顯著（P＜0.05）。張眾一等[28]的研究發(fā)現(xiàn)玉米須多糖能夠明顯促進(jìn)葡萄糖轉(zhuǎn)化為肝糖原，以減少糖原異生作用，減少葡萄糖含量，起到降低血糖的作用。這與2.6 節(jié)的研究中葡萄糖含量降低的結(jié)果相吻合。且較高分子質(zhì)量的黑木耳發(fā)酵產(chǎn)物作用于HepG2 細(xì)胞后使肝糖原含量更高。

圖6 不同分子質(zhì)量黑木耳發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)葡萄糖含量的影響Fig.6 Effect of fermentation products of A.auricular with different molecular weights on glucose content

圖7 不同分子質(zhì)量黑木耳發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)肝糖原含量的影響Fig.7 Effect of fermentation products of A.auricular with different molecular weights on hepatic glycogen content

2.8 不同分子質(zhì)量黑木耳發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)HK 活性的影響

由圖8可知，不同分子質(zhì)量黑木耳發(fā)酵產(chǎn)物作用于HepG2 細(xì)胞24 h 后，細(xì)胞內(nèi)的HK 活性均上升。其中，對(duì)HK 活性影響最為明顯的分子質(zhì)量集中在100～300 ku 之間，可達(dá)5.02 U/g 蛋白，其與空白組之間差異顯著（P＜0.05），與其它組之間無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，多糖類物質(zhì)能夠改善糖脂代謝，調(diào)節(jié)葡萄糖的吸收利用。其中的一條代謝通路便是通過(guò)提高己糖激酶的活性，促進(jìn)周圍組織對(duì)葡萄糖的吸收利用，將葡萄糖轉(zhuǎn)化為肝糖原，達(dá)到降低血糖的目的[29]。王黎明等[30]的研究發(fā)現(xiàn)茶多糖能夠顯著提升己糖激酶的活性，加快糖代謝，使血糖降低，促進(jìn)糖原合成。由此可見，黑木耳發(fā)酵產(chǎn)物可能是通過(guò)調(diào)節(jié)己糖激酶的活性影響細(xì)胞糖代謝，加速葡萄糖的消耗，促進(jìn)肝糖原的轉(zhuǎn)化，達(dá)到調(diào)節(jié)糖代謝的目的。且對(duì)細(xì)胞內(nèi)糖代謝影響較為明顯的黑木耳發(fā)酵產(chǎn)物的分子質(zhì)量集中在100～300 ku 與＞300 ku 之間。薛令坤等[31]在研究中發(fā)現(xiàn)分子質(zhì)量＞100 ku 的杏鮑菇水提物具備更強(qiáng)的生理活性。楊陽(yáng)等[32]的研究中也發(fā)現(xiàn)灰樹花子實(shí)體多糖的活性部位主要位于100～1 000 ku 范圍之間，這與本試驗(yàn)的研究結(jié)果相吻合。

圖8 不同分子質(zhì)量黑木耳發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)HK 活性的影響Fig.8 Effect of fermentation products of A.auricular with different molecular weights on HK activity

3 結(jié)論

前期研究發(fā)現(xiàn)黑木耳發(fā)酵產(chǎn)物中含有多糖、多酚以及類黃酮等活性物質(zhì)，本試驗(yàn)就發(fā)酵產(chǎn)物的降脂功能及降糖功能進(jìn)行研究，結(jié)果表明黑木耳發(fā)酵產(chǎn)物具備降脂降糖功能。孟繁龍[33]對(duì)樺褐孔菌發(fā)酵工藝的研究發(fā)現(xiàn)，樺褐孔菌的胞內(nèi)多糖能夠顯著降低實(shí)驗(yàn)小鼠的血糖水平。尚紅梅[34]對(duì)小刺猴頭菇的發(fā)酵浸膏多糖的研究發(fā)現(xiàn)，小刺猴頭菇的發(fā)酵浸膏多糖能夠減少肉雞體內(nèi)膽固醇的合成，達(dá)到降脂的目的。然而，針對(duì)不同分子質(zhì)量發(fā)酵產(chǎn)物的功能性質(zhì)，國(guó)內(nèi)外的相關(guān)研究較少。因此，本研究通過(guò)超濾法獲得不同分子質(zhì)量黑木耳發(fā)酵產(chǎn)物，并通過(guò)建立體外HepG2 細(xì)胞脂肪累積模型及正常HepG2 細(xì)胞模型，以MTT 值、油紅O染色、TG 值、TC 值、LPL 與HL 活性、葡萄糖含量、肝糖原含量、HK 活性為指標(biāo)，評(píng)價(jià)不同分子質(zhì)量黑木耳發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)HepG2 細(xì)胞脂質(zhì)代謝及糖代謝的影響。結(jié)果表明，100～300 ku 的黑木耳發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)TC 含量以及LPL、HL、HK 活性的影響顯著；＞300 ku 的黑木耳發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)TG、葡萄糖以及肝糖原含量的影響顯著。本研究發(fā)現(xiàn)較高分子質(zhì)量的黑木耳發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)HepG2 細(xì)胞脂質(zhì)代謝及糖代謝的影響顯著，這為黑木耳的開發(fā)應(yīng)用提供了新途徑，更為降脂、降糖藥物與功能性食品的開發(fā)提供了理論基礎(chǔ)，具有應(yīng)用指導(dǎo)意義。