自噬標志物LC3的節(jié)律表達破壞參與β1-AA誘導的H9c2大鼠心肌細胞死亡*

賈微微， 寧 娜， 孫 聰， 李朋佳， 陸潔蓓， 張 晟，原 媛 ， 王 麗 ，3， 王曉暉 ，3△

（山西醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院 1病理教研室，2形態(tài)學實驗室，3基礎醫(yī)學研究中心，山西太原030001）

心功能不全是多種心臟疾病的終末階段，是重要的全球公共健康問題，但發(fā)病機制尚未完全闡明［1］。研究表明，在40%～60%心功能不全患者血清中可檢測到針對自身β1-腎上腺素受體（β1-adrenergic receptor，β1-AR）產(chǎn)生的自身抗體（β1-AR autoantibodies，β1-AA）［2］。β1-AA 可以持續(xù)激活 β1-AR 導致心肌細胞死亡，從而參與心功能不全的發(fā)生發(fā)展［3］。然而，β1-AA引起心肌細胞死亡的機制尚不明確。

自噬是一種細胞自主的防御機制，可將細胞質內(nèi)的一些物質運輸?shù)饺苊阁w內(nèi)進行消化降解［4］。自噬被認為是細胞死亡和存活之間的交匯點，可以保護心肌細胞免于凋亡和其他重大傷害［5］。早在1970年，Pfeifei［6］在電鏡下就觀察到小鼠心肌、視網(wǎng)膜和胰腺等多種組織細胞中存在自噬體數(shù)量的節(jié)律性波動。自噬標志蛋白微管相關蛋白1 輕鏈3（microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3）的表達水平在小鼠肝臟中也呈現(xiàn)出顯著的震蕩節(jié)律［7-8］。

特異性敲除小鼠心肌自噬相關基因ATG5可以使自噬的節(jié)律喪失，誘導心功能下降［9］，提示自噬震蕩節(jié)律的異?？梢杂绊懶募〖毎?。然而，β1-AA 對心肌細胞自噬標志物LC3 的節(jié)律表達是否有影響及其對心肌細胞死亡的作用目前尚不清楚。因此，本研究用β1-AR 細胞外第二環(huán)（the second extracellular loop of β1-AR，β1-AR-ECII）抗原肽段主動免疫大鼠，再將從大鼠血清中提純的β1-AA作用于H9c2大鼠心肌細胞，觀察LC3 的節(jié)律性表達，探究自噬節(jié)律的破壞是否參與β1-AA 誘導的心肌細胞死亡，以期為β1-AA陽性心功能不全患者的治療提供實驗參考資料。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1 動物及細胞 清潔級8 周齡雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠12只，體質量180～200 g，由山西醫(yī)科大學動物中心［許可證號：SCXK（晉）2015-0001］提供。H9c2細胞系由中國科學院上海細胞庫提供。

1.2 主要試劑 β1-AR-ECII 抗原肽段（吉爾生化上海有限公司）；抗LC3 抗體和抗Per2 抗體（Abcam）；抗GAPDH 抗體、辣根過氧化酶標記的山羊抗小鼠IgG 和辣根過氧化酶標記的山羊抗兔IgG（中杉金橋公司）；RNAiso Plus、PrimeScript RT Master Mix 和SYBR Premix Ex TaqTMII（TaKaRa）；胎牛血清（中喬新舟公司）；Cell Counting Kit-8（CCK-8；Dojindo）；地塞米松（索萊寶科技有限公司）；慢病毒（lentivirus，LV）-shPer2 和LV-NC（中國漢恒生物科技有限公司）。

1.3 主要儀器 Heracell 150i CO2恒溫細胞培養(yǎng)箱（Thermo Scientific）；酶聯(lián)免疫檢測儀（SoftMax）；LR56495 低溫高速離心機（Thermo Fisher）；PCR 擴增儀（Stratagene）；熱循環(huán)儀（MJ Research）；垂直電泳儀和半干轉轉膜儀（BIO-RAD）；BioSpectrum 810 凝膠成像系統(tǒng)（UVP）。

2 實驗方法

2.1 建立主動免疫大鼠模型 參照文獻進行大鼠主動免疫［10］，誘導其血清中產(chǎn)生β1-AA，具體實驗設計見圖1A。選取12 只8 周齡雄性SD 大鼠按隨機數(shù)字表法分為免疫組（β1-AR 組）和對照（control）組，每組6 只。使用Na2CO3溶液溶解β1-AR-ECII 抗原肽段，按1∶1的比例與完全弗氏佐劑乳化混勻后，于SD大鼠背部皮下多點注射法進行首次免疫（0.4 μg/g），隨后將已稀釋的β1-AR-ECII 抗原肽段與不完全弗氏佐劑1∶1乳化，采用單點背部皮下注射，每隔2周加強免疫 1 次，共免疫 8 周；control 組用等量 Na2CO3溶液替代抗原溶液，實驗方案同免疫組。隨后從血清中檢測并提純β1-AA。

2.2 鏈霉抗生物素蛋白（streptavidin，SA）-酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）檢測β1-AA 使用β1-AR-ECII 抗原肽段（10 mg/L）包被空白ELISA 板，加入磷酸鹽緩沖液、待測血清、生物素標記的Ⅱ抗和辣根過氧化物酶標記的SA，且以上各步驟均在37℃水浴1 h；底物顯色30 min；最后檢測405 nm 處吸光度（A），計算P/N 值判定結果。P/N=（標本A值-空白對照A值）/（陰性對照A值-空白對照A值），P/N≥2.1 定為抗體陽性，P/N≤1.5定為抗體陰性。

2.3 純化β1-AA 冰箱取出層析柱放置室溫30 min，三蒸水沖洗保存在柱子中的乙醇，用結合緩沖液沖洗柱子，使用含有β1-AA 的血清濾過柱子并用洗脫緩沖液沖洗柱子，使β1-AA 隨同洗脫緩沖液一起滴到EP管中。

2.4 細胞培養(yǎng)及處理 培養(yǎng)H9c2 細胞至匯合度達80%左右時用終濃度0.1 μmol/L［11］的地塞米松溶液同步化處理3 h，同步化結束時間記為CT0。細胞隨機分為 4 組：control 組（1 μmol/L 陰性 IgG 處理細胞）、β1-AA組（1 μmol/L β1-AA處理細胞）、LV-NC組（LV-NC 感染細胞，MOI=30）和 LV-shPer2 組（LV-shPer2 感染細胞，MOI=30）。各組細胞分別在同步化并給藥誘導之后于不同時點（CT0、CT4、CT8、CT12、CT16和CT20）收樣，用于后續(xù)研究。

2.5 通過慢病毒感染敲減Per2基因 參照文獻［12］，采用慢病毒感染H9c2 細胞以敲減Per2基因，進而得到LC3 節(jié)律異常的細胞。由上海漢恒生物科技有限公司協(xié)助構建含shPer2 質粒同時帶有GFP 的慢病毒。采取1/2小體積感染法：前一日進行細胞計數(shù)和傳代，次日細胞換液后加入1/2 體積培養(yǎng)基，根據(jù)最佳MOI加入適宜體積的慢病毒，感染4 h后加入另外1/2 體積新鮮培養(yǎng)基，12～16 h 后將含病毒的培養(yǎng)基換為普通完全培養(yǎng)液。

2.6 Western blot 實驗 采用Western blot 法檢測各時點LC3 和Per2 蛋白的表達。同2.4 處理后于各時點收集細胞，BCA法測蛋白濃度，定量的蛋白經(jīng)SDSPAGE分離后，轉至PVDF膜，奶粉室溫封閉2 h，相應抗體4℃孵育過夜，TBST 洗膜后加入相應Ⅱ抗室溫孵育2 h。利用凝膠成像系統(tǒng)曝光，使用ImageJ 軟件對圖像進行灰度分析。

2.7 real-time PCR 實驗 采用 real-time PCR 檢測Per2 mRNA 表達和各時點LC3 mRNA 表達。將各組細胞處理，充分裂解后收集細胞，提取總RNA 并反轉錄為cDNA，使用SYBR Green 試劑盒擴增cDNA 產(chǎn)物。引物設計如下：LC3 的上游引物序列為5′-AGCTCTGAAGGCAACAGCAACA-3′，下游引物序列為 5′-GCTCCATGCAGGTAGCAGGAA-3′；GAPDH 的上游引物序列為5′-GGCACAGTCAAGGCTGAGAATG-3′，下游引物序列為 5′-ATGGTGGTGAAGACGCCAGTA-3′；Per2 的上游引物序列為 5′-AGCAACACCACCTTTCACAA-3′，下 游引 物序 列為 5′-CGTAGGCTTAGACCACCATC-3′。所有結果用control組 CT0 時 GAPDH 的表達進行標化，采用 2-ΔΔCt法進行相對定量。

2.8 CCK-8 法檢測細胞活力 將密度為每孔（2～3）×104的細胞懸液接種于96 孔板，待細胞貼壁后更換培養(yǎng)基并對各組細胞進行加藥處理；藥物作用24 h 后每孔加入CCK-8 溶液10 μL，混勻后繼續(xù)孵育1.5 h；最后檢測450 nm 處A值，對各組A值進行處理分析得到其相較于control 組細胞的相對活力。計算公式為：細胞相對活力（%）=（實驗組A值-空白對照組A值）/（陰性對照組A值-空白對照組A值）×100%。

3 統(tǒng)計學處理

實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0 軟件進行分析，以均數(shù)±標準誤（mean±SEM）表示。兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析，多重比較采用LSD法。檢驗水準α=0.05。

采用R 統(tǒng)計軟件包2.10.0 版進行JTK_CYCLE算法［13-15］來識別數(shù)據(jù)的循環(huán)變量，以查看24 h 節(jié)律。JTK_CYCLE 算法是一種可以從微陣列數(shù)據(jù)中檢測循環(huán)記錄的非參數(shù)測試程序，提供每個循環(huán)記錄的基于置換的P值（校正的P值），其所需的置信區(qū)間為95%。

結 果

1 主動免疫大鼠血清中β1-AA的A值顯著升高

SA-ELISA 結果顯示，與 control 組（0.65±0.02）相比，β1-AR 組大鼠血清中 β1-AA 的A值（2.47±0.07）顯著升高（P＜0.05），進一步采用親和層析法提純β1-AA，用于后續(xù)細胞實驗，見圖1。

2 β1-AA顯著降低H9c2細胞活力

CCK-8 結果顯示，與 control 組相比，1 μmol/L 的β1-AA 作用于H9c2心肌細胞24 h后細胞活力顯著下降（P＜0.05），見圖2。

3 β1-AA破壞H9c2細胞LC3的節(jié)律表達

real-time PCR 及 Western blot 結果顯示，control組LC3 mRNA 和蛋白表達水平均在CT8～CT12 時升高，CT12 以后開始下降；經(jīng)β1-AA 處理后，LC3 的表達高峰前移至CT8，見圖3。

使用JTK_CYCLE 算法對所得數(shù)據(jù)進行分析，可得到 control 組 LC3 的 JTK_CYCLEP值小于 0.05，經(jīng)β1-AA 處理后，LC3 的 JTK_CYCLEP值大于 0.05，見表1。

4 β1-AA破壞H9c2細胞Per2蛋白的節(jié)律表達

Western blot 結果顯 示 ，control 組 Per2 蛋白在CT8 和 CT16 時表達較高，其中以 CT16 時最高；經(jīng) β1-AA 處理后，Per2 蛋白的生成高峰前移至CT12，見圖4。

使用JTK_CYCLE 算法對所得數(shù)據(jù)進行分析，結果表明 control 組 Per2 蛋白的 JTK_CYCLEP值小于0.05，經(jīng)β1-AA 處理后，JTK_CYCLEP值大于0.05，見表1。

Figure 1.Detection and purification of β1-AA from rat serum.A：diagram of detection and purification of β1-AA；B：serum β1-AA level in control group and β1-AR active immunization group was determined by SA-ELISA.Mean±SEM. n=6. *P＜0.05 vs control group.圖1 β1-AR主動免疫后檢測及提純β1-AA

Figure 2.β1-AA decreased the viability of H9c2 cells.Mean±SEM. n=6. *P＜0.05 vs control group.圖2 β1-AA顯著降低H9c2細胞活力

5 敲減Per2 基因破壞H9c2 細胞LC3 節(jié)律表達后細胞活力顯著降低

5.1 慢病毒感染成功敲減H9c2 細胞的Per2基因采用LV-shPer2感染H9c2細胞，MOI=30時熒光強度較高且與MOI=50 時差異不大（圖5A），故選定MOI為30用于后續(xù)實驗。隨后檢測病毒對目的基因Per2的敲減效果，結果顯示，與LV-NC 感染的H9c2 細胞（3.69±0.26）相比 ，LV-shPer2 感 染 使 H9c2 細胞Per2 mRNA 表達水平（1.98±0.37）顯著降低（P＜0.05），見圖5B；Per2 蛋白表達也顯著降低（1.22±0.25vs0.56±0.09，P＜0.05），見圖5C。

5.2 慢病毒感染敲減Per2基因破壞H9c2 細胞LC3的節(jié)律表達 Western blot 結果顯示，LV-NC 組LC3節(jié)律表達與control 組類似，且JTK_CYCLE 算法分析的P值 小 于 0.05，而 LV-shPer2 組 LC3 的 JTK_CYCLEP值大于0.05，見圖6及表1。

5.3 LC3 節(jié)律表達破壞可引起H9c2 細胞活力下降 CCK-8 結果顯示，LV-NC 組 H9c2 細胞活力（96.90%±6.42%）與 control 組（97.50%±1.43%）相比無顯著差異，而破壞LC3 節(jié)律表達后，細胞活力顯著下降（37.95%±3.76%，P＜0.05），見圖7。

討 論

本研究觀察到，β1-AA 可以誘導H9c2 心肌細胞自噬標志物LC3 的節(jié)律表達破壞。研究表明，自噬節(jié)律表達受生物鐘基因調控，于是本研究采用LV-shPer2 敲減生物鐘基因Per2以破壞細胞自噬標志物LC3 的節(jié)律表達，觀察到心肌細胞活力顯著下降，提示自噬標志物LC3 的節(jié)律表達破壞促進β1-AA 誘導的H9c2心肌細胞死亡。

β1-AA 是一種針對β1-AR-ECII 產(chǎn)生的自身抗體［16］，可以持續(xù)激活β1-AR導致心肌細胞死亡［3］。β1-AA可以通過結合β1-AR的構象表位而影響受體的構象和下游cAMP 信號傳導，進而誘導MCP-1 蛋白產(chǎn)生，引起心肌細胞死亡［17］。β1-AA 還可以通過誘導CD4+T 細胞增加，導致心肌細胞凋亡和心力衰竭［18］。本研究也觀察到β1-AA作用H9c2心肌細胞24 h可顯著降低心肌細胞活力，與之前的研究一致。

我們前期研究結果表明，β1-AA 可顯著抑制心肌細胞自噬功能，繼而導致線粒體膜電位下降，參與心功能不全的發(fā)生發(fā)展［19］。自噬在生理過程中起著“管家”的作用，可以清除長壽、錯誤折疊的蛋白質和受損的細胞器，參與細胞生長和衰老的調節(jié)［20］。已有研究表明，細胞自噬存在節(jié)律性震蕩［21］；早在1970年就觀察到大鼠某些組織自噬空泡的豐度在一日中具有節(jié)律性波動［6］；另有研究表明，LC3-II 蛋白表達在小鼠肝臟、骨骼肌及腎臟中也具有節(jié)律性［22］。LC3作為自噬的分子標記物位于細胞質中，自噬發(fā)生時LC3-I 與磷脂酰乙醇胺共價結合，形成LC3-II 并定位于自噬體膜上參與自噬小體的形成［23］。在本研究中，我們重點關注自噬標志物LC3 的節(jié)律表達情況。為了對相關蛋白在24 h 的節(jié)律變化進行分析，我們采用的是公認的晝夜節(jié)律震蕩性分析軟件JTK_CYCLE［24-25］。JTK_CYCLE 是一種新穎的非參數(shù)統(tǒng)計算法，采用R 語言來識別樣本的循環(huán)變量。而且本研究以H9c2 大鼠心肌細胞系為研究對象，細胞系的節(jié)律不會被環(huán)境變化所加強，所以節(jié)律性震蕩較低，但是經(jīng)過與其他算法相比較，JTK_CYCLE 算法能很好識別這些數(shù)據(jù)中的循環(huán)轉錄本。而且JTK_CYCLE算法對于24 h內(nèi)的樣本數(shù)據(jù)較其他算法相比具有更高的特異性和準確性［13-15］。我們的結果顯示，control組LC3 的表達確實存在顯著節(jié)律性震蕩，LC3 在CT8～CT12時升高，CT12開始下降，提示在主觀白天LC3 的生成處于較低狀態(tài)，心肌細胞產(chǎn)生的衰老、損傷的蛋白質會出現(xiàn)累積，主觀夜間LC3 的生成增多，自噬開始發(fā)揮吞噬降解衰老損傷的蛋白質及細胞器的作用，維持心肌細胞的正常狀態(tài)。由此可見，自噬節(jié)律的正常運轉對于心肌細胞穩(wěn)態(tài)的維持至關重要。而給予β1-AA 處理后LC3 生成的最高點由CT12提前至CT8，JTK_CYCLE 算法分析得出其節(jié)律性震蕩被破壞。這提示β1-AA可以引起H9c2心肌細胞自噬標志物LC3的節(jié)律表達破壞。

Figure 3.Autophagy marker LC3 rhythm was disrupted in H9c2 cardiomyocytes by β1-AA.The samples were collected every 4 h within 24 h.A：real-time PCR demonstrated that the LC3 mRNA rhythmic expression in the H9c2 cardiomyocytes was disrupted by β1-AA（1 μmol/L）；B，C：Western blot showed that the LC3 protein rhythmic expression in the H9c2 cardiomyocytes was disrupted by β1-AA（1 μmol/L）.Mean±SEM. n=6.*P＜0.05 vs control group.圖3 β1-AA破壞H9c2心肌細胞自噬標志物LC3的節(jié)律表達

Figure 4.The rhythmic expression of Per2 protein in H9c2 cardiomyocytes was disrupted by β1-AA（1 μmol/L）.The samples were collected every 4 h within 24 h.Mean±SEM. n=6.*P＜0.05 vs control group.圖4 β1-AA破壞H9c2心肌細胞Per2蛋白的節(jié)律表達

Figure 5.H9c2 cells were infected with LV-shPer2 to knock down the expression of Per2.A：GFP fluorescence images with MOI of 5，10，30 and 50（scale=1 mm）；B：real-time PCR showed that the mRNA expression of Per2 was reduced by LV-shPer2（MOI=30）in the H9c2 cardiomyocytes；C：Western blot showed that the protein expression of Per2 was reduced by LV-shPer2（MOI=30）in the H9c2 cardiomyocytes.Mean±SEM. n=6.*P＜0.05 vs LV-NC group.圖5 LV-shPer2感染H9c2心肌細胞敲減Per2的表達

Figure 6.The expression of LC3 rhythm was disrupted after LV-shPer2 infection.The samples were collected every 4 h within 24 h.A：real-time PCR demonstrated that the LC3 mRNA rhythmic expression in the H9c2 cardiomyocytes was disrupted by LV-shPer2（MOI=30）；B，C：Western blot showed that the LC3 protein rhythmic expression in the H9c2 cardiomyocytes was disrupted by LV-shPer2（MOI=30）Mean±SEM. n=6.*P＜0.05 vs LV-NC group.圖6 LV-shPer2敲減Per2使心肌細胞自噬標志物LC3節(jié)律破壞

研究表明，人類清醒時，饑餓增加胰島素水平，進而激活心臟mTOR 信號通路，導致自噬節(jié)律異常，從而發(fā)生心功能不全［9，26］。FoxO3 誘導心肌細胞中幾種自噬相關基因節(jié)律性異常表達，導致心肌細胞變小，心功能下降［27］。這些研究表明，自噬節(jié)律異常可能會對心肌細胞和心功能產(chǎn)生影響。因此，我們需要進一步探究β1-AA誘導的H9c2心肌細胞自噬標志物LC3的節(jié)律表達破壞是否參與其細胞死亡。

自噬的震蕩節(jié)律受生物鐘調控［28］。生物晝夜節(jié)律是地球上所有生物體以太陽作為參考點將生物周期調整為近似24 h 的震蕩節(jié)律。轉錄-翻譯反饋環(huán)路（transcriptional translation feedback loop，TTFL）是目前公認的節(jié)律維持機制［29］。其中，β-AR活化能夠顯著改變 Per2 蛋白和 mRNA 的節(jié)律性表達［30］，即 β-AR 的激活會引起生物鐘基因Per2的變化。而且本研究也觀察到，H9c2心肌細胞control組的Per2蛋白通過JTK_CYCLE 算法分析表現(xiàn)出顯著的晝夜節(jié)律性震蕩，其表達量于CT8 和CT16 時相對較高，其中以CT16 時最高；而β1-AA 能夠顯著破壞 Per2 蛋白的晝夜節(jié)律性震蕩，使其生成最高峰前移至CT12。有研究表明，成纖維細胞Per2基因沉默后，LC3蛋白表達顯著下降，節(jié)律也出現(xiàn)顯著異常［31］。因此，本研究使用LV-shPer2 感染H9c2 心肌細胞，降低Per2表達，進而破壞自噬標志物LC3 的節(jié)律表達，結果細胞活力出現(xiàn)顯著下降，表明β1-AA 誘導的H9c2 心肌細胞自噬標志物LC3 的節(jié)律表達破壞了參與其細胞死亡。

表1 JTK_CYCLE 算法分析LC3 mRNA、LC3 蛋白和Per2蛋白表達的晝夜節(jié)律參數(shù)Table 1.The circadian parameters of LC3 mRNA，LC3 protein and Per2 protein using JTK_CYCLE algorithm analysis

Figure 7.The viability of H9c2 cardiomyocytes was reduced after the rhythm of LC3 was destroyed by LV-shPer2.Mean±SEM. n=6.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs LV-NC group.圖7 LV-shPer2 敲減Per2 基因使心肌細胞LC3 節(jié)律表達破壞后心肌細胞的活力顯著降低

綜上所述，β1-AA 可引起H9c2 心肌細胞自噬標志物LC3 的節(jié)律表達破壞和細胞活力降低；敲減生物鐘基因來破壞H9c2 心肌細胞LC3 節(jié)律表達后，細胞活力顯著下降。由此可見，自噬標志物LC3 節(jié)律表達的破壞在β1-AA 誘導的心肌細胞死亡過程中發(fā)揮重要作用；早期合理調控自噬標志物LC3 的節(jié)律表達有望成為β1-AA 陽性心功能不全患者的治療策略。