KLF5 介導(dǎo)p27kip1表達(dá)對膠質(zhì)瘤U87 細(xì)胞增殖和侵襲的影響

方松，唐國強(qiáng)，陳加貝，李斌

郴州市第一人民醫(yī)院，湖南郴州423000

膠質(zhì)瘤是由腦神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞引起的惡性腫瘤，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤。由于膠質(zhì)瘤的多灶性發(fā)展和復(fù)發(fā)特點(diǎn)，患者預(yù)后較差，平均生存時(shí)間僅11～15 個(gè)月［1］。因此，闡明膠質(zhì)瘤增殖和侵襲的內(nèi)在機(jī)制對尋找新的治療靶標(biāo)具有重要意義。Kruppel 樣因子5（KLF5）是KLF 家族的關(guān)鍵成員，在不同類型腫瘤中發(fā)揮的作用不同。研究顯示，KLF5在前列腺癌和宮頸癌組織中表達(dá)缺失或下調(diào)，發(fā)揮抑癌基因的作用［2-3］，在非小細(xì)胞肺癌、胃癌、胰腺癌等腫瘤中具有促進(jìn)細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的作用［4-6］。YANG 等［7］報(bào) 道，MCM3AP-AS1/miR-211/KLF5/AGGF1 軸對膠質(zhì)瘤血管生成具有調(diào)控作用，可作為膠質(zhì)瘤抗血管生成治療的新靶標(biāo)，提示KLF5可能與膠質(zhì)瘤的增殖和侵襲有關(guān)。研究顯示，p27kip1是腫瘤惡性進(jìn)展的抑制因子［8-9］，在乳腺癌中KLF5可抑制p27kip1的表達(dá)而發(fā)揮促癌作用［10］。2019 年7 月—2020 年6 月，我們采用小干擾RNA（siRNA）抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87中KLF5表達(dá)，觀察其對膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和侵襲能力的影響，并探討p27kip1在此過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 人膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87 購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫；DMEM 培養(yǎng)基和胎牛血清購于美國Hyclone 公司；KLF5 siRNA 和p27kip1siRNA 購于廣州銳博生物技術(shù)有限公司；Lipofectamine2000 轉(zhuǎn)染試劑、蛋白裂解液和Giemsa 染液購于北京索萊寶試劑公司；BCA 蛋白濃度檢測試劑盒和細(xì)胞周期檢測試劑盒購于上海碧云天生物試劑有限公司；細(xì)胞周期蛋白D1（Cyclin D1）、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶4/6（CDK4/6），上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化蛋白Snail1，以及KLF5、GAPDH 抗體購自英國Abcam 試劑公司；ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒購于美國Thermo 公司；MTS 試劑購自中國北京百奧萊博科技有限公司；Transwell 小室購自美國Coring試劑公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 取U87細(xì)胞，加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置于37 ℃、5%CO2、飽和濕度細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。觀察細(xì)胞生長狀態(tài)，及時(shí)更換細(xì)胞培養(yǎng)基。顯微鏡下觀察細(xì)胞長滿時(shí)，采用胰酶按照1∶3的比例進(jìn)行細(xì)胞傳代。

1.3 KLF5對膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和侵襲能力的影響及機(jī)制觀察

1.3.1 細(xì)胞分組與轉(zhuǎn)染 收集細(xì)胞，加入胰酶消化，制備單細(xì)胞懸液。以1.0×105/孔鋪至6 孔板中，將細(xì)胞分為si-NC 組、si-KLF5 組，放置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁后，si-NC 組加入10 pmol NC siRNA和含5 μg Lipofectamine2000 的無血清培養(yǎng)基混合液，si-KLF5 組加入10 pmol KLF5 siRNA 和含5 μg Lipofectamine2000 轉(zhuǎn)染試劑的無血清培養(yǎng)基混合液，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。6 h后更換新鮮完全培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染48 h用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 細(xì)胞增殖能力觀察 采用MTS 法。收集兩組細(xì)胞，加入胰酶消化，離心收集細(xì)胞，加入培養(yǎng)基制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為2×106/L。以2×103/孔接種至96 孔板，每組設(shè)5 個(gè)復(fù)孔，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。以細(xì)胞貼壁時(shí)計(jì)為0 h，于0、24、48、72 h取細(xì)胞加入MTS試劑孵育2 h，按照說明書采用全波長掃描儀檢測490 nm處各孔光密度（OD）值。

1.3.3 細(xì)胞周期檢測 收集兩組細(xì)胞（每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔），加入胰酶消化。每管1.0×106個(gè)細(xì)胞，PBS洗3 次，加入1 mL 80%乙醇4 ℃固定細(xì)胞2 h。PBS洗1 次后，加入500 μL 的細(xì)胞周期染色緩沖液、25 μL碘化丙啶（PI）染液和10 μL RNA酶，混勻后37 ℃避光孵育30 min。采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞在不同細(xì)胞周期的比例。

1.3.4 細(xì)胞侵襲能力觀察 采用Boyden 實(shí)驗(yàn)。將基質(zhì)膠稀釋后加入Transwell 小室中，制備Boyden 小室。收集兩組細(xì)胞，加入胰酶消化，無血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞后計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106/mL。每組設(shè)3 個(gè)復(fù)孔，采用無血清培養(yǎng)基洗3 次，取100 μL 細(xì)胞加至Boyden 小室的上室中，500 μL 完全培養(yǎng)基加至Boyden 小室的下室中，放置細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。顯微鏡下觀察，Boyden 小室下室中有穿膜掉落的細(xì)胞時(shí)終止培養(yǎng)，用PBS 將Boyden 小室上室面未穿過的細(xì)胞洗去，甲醇固定小室15 min，并采用Giemsa 染色，干燥后顯微鏡下計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)目。

1.3.5 細(xì)胞Cyclin D1、CDK4、CDK6、Snail1 蛋白檢測 采用Western blotting 法。收集兩組細(xì)胞，加入蛋白裂解液，4 ℃、14 000 r/min 離心30 min。取蛋白上清液，BCA法檢測蛋白濃度，加入蛋白上樣緩沖液，煮沸變性。取蛋白樣品，加入凝膠，100 V電泳2 h分離目的蛋白，350 mA轉(zhuǎn)膜2 h將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，加入5%脫脂牛奶常溫孵育1 h 封閉非特異性蛋白。依次加入目的蛋白的一抗（稀釋濃度均為1∶500）4 ℃孵育過夜，二抗室溫孵育2 h。TBST 沖洗3 次，采用ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒顯示蛋白條帶，Image J 軟件分析蛋白條帶灰度值。以目標(biāo)蛋白與內(nèi)參GAPDH 條帶灰度值的比值表示目標(biāo)蛋白的相對表達(dá)量。

1.4 干擾p27kip1表達(dá)對KLF5 作用下膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和侵襲能力的影響觀察 采用Western blotting 法檢測si-NC 組和si-KLF5 組p27kip1蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示兩組p27kip1蛋白相對表達(dá)量分別為0.21 ± 0.03、0.59 ± 0.08，si-KLF5 組p27kip1蛋白表達(dá)高于si-NC組（P＜0.01）。取培養(yǎng)后的U87 細(xì)胞，分為si-NC 組、si-KLF5 組 和si-KLF5+si-p27kip1組，si-NC 組 加 入10 pmol NC siRNA 和含5 μg Lipofectamine2000 的無血清培養(yǎng)基混合液，si-KLF5 組加入10 pmol KLF5 siRNA 和含5 μg Lipofectamine2000 的無血清培養(yǎng)基混合液，si-KLF5+si-p27kip1組加入10 pmol KLF5 siRNA+10 pmol p27kip1siRNA 和 含 5 μg Lipofectamine2000 的無血清培養(yǎng)基混合液，按照“1.3.2”和“1.3.4”的方法檢測細(xì)胞增殖能力和侵襲能力。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以±s 表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，三組間比較采用方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 KLF5對膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和侵襲能力的影響

2.1.1 兩組細(xì)胞增殖能力比較 細(xì)胞培養(yǎng)48、72 h時(shí)，si-KLF5 組OD 值較si-NC 組降低（P 均＜0.01）。見表1。

表1 兩組不同時(shí)間點(diǎn)OD值比較（±s）

表1 兩組不同時(shí)間點(diǎn)OD值比較（±s）

注：與si-NC組比較，*P＜0.01。

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2.1.2 兩組細(xì)胞周期比較 si-KLF5 組G1期細(xì)胞比例較si-NC組增加（P＜0.05）。見表2。

表2 兩組細(xì)胞周期比較（%，±s）

表2 兩組細(xì)胞周期比較（%，±s）

注：與si-NC組比較，*P＜0.05。

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2.1.3 兩組細(xì)胞侵襲能力比較 si-KLF5 組和si-NC 組的穿膜細(xì)胞數(shù)分別為（39.67 ± 6.94）、（85.33± 10.54）個(gè)，si-KLF5 組穿膜細(xì)胞數(shù)較si-NC 組減少（P＜0.01）。

2.1.4 兩組細(xì)胞Cyclin D1、CDK4、CDK6、Snail1 蛋白表達(dá)比較 與si-NC 組相比，Cyclin D1、CDK4、CDK6、Snail1蛋白表達(dá)水平均降低（P 均＜0.01）。見表3。

表3 兩組細(xì)胞Cyclin D1、CDK4、CDK6、Snail1蛋白表達(dá)比較（±s）

表3 兩組細(xì)胞Cyclin D1、CDK4、CDK6、Snail1蛋白表達(dá)比較（±s）

注：與si-NC組比較，*P＜0.01。

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2.2 干擾p27kip1表達(dá)對KLF5 作用下的膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和侵襲能力的影響

2.2.1 三組細(xì)胞增殖能力比較 si-KLF5+si-p27kip1組細(xì)胞增殖能力較si-NC 組降低，較si-KLF5 組增加（P均＜0.05）。見表4。

表4 三組不同時(shí)間點(diǎn)OD值比較（±s）

表4 三組不同時(shí)間點(diǎn)OD值比較（±s）

注：與si-NC組比較，*P＜0.05；與si-KLF5組比較，#P＜0.05。

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2.2.2 三組細(xì)胞侵襲能力比較 si-NC 組、si-KLF5組、si-KLF5+si-p27kip1組的穿膜細(xì)胞數(shù)分別為（91.67± 13.20）、（40.67 ± 8.11）、（69.33 ± 6.08）個(gè)。si-KLF5+si-p27kip1組穿膜細(xì)胞數(shù)較si-NC 組減少（P＜0.01），較si-KLF5組增加（P＜0.05）。

3 討論

膠質(zhì)瘤也稱為神經(jīng)外胚層或神經(jīng)上皮腫瘤，發(fā)生在神經(jīng)外胚層中，通常表現(xiàn)出包括廣泛、快速和侵略性進(jìn)展等一系列惡性特征，導(dǎo)致患者對手術(shù)、放療和化療的抵抗，致使大多數(shù)患者預(yù)后不良，并影響患者的身心健康。因此，探索膠質(zhì)瘤進(jìn)展的分子機(jī)制，對開發(fā)可改善患者預(yù)后的新療法至關(guān)重要。

KLF5 基因位于13q21 號染色體上，其蛋白包含富含脯氨酸的反式激活結(jié)構(gòu)域和3 個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)域。大量研究表明，KLF5與人類惡性腫瘤之間存在密切關(guān)聯(lián)，可調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、血管生成、多能性、炎癥和遷移等許多關(guān)鍵細(xì)胞過程［11-12］。KLF5 通過調(diào)節(jié)DNA損傷檢查點(diǎn)蛋白抑制DNA 損傷反應(yīng)，促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌患者對順鉑的耐藥性，抑制KLF5 可能是治療腫瘤的潛在靶點(diǎn)［4］。在甲狀腺癌中，干擾KLF5 表達(dá)可抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力［13］。在膠質(zhì)瘤中，KLF5 通過參與MCM3AP-AS1/miR-211/KLF5/AGGF1 軸促進(jìn)膠質(zhì)瘤的血管生成，敲低MCM3AP-AS1 可通過上調(diào)miR-211 表達(dá)降低KLF5、AGGF1表達(dá)，從而抑制血管生成［7］。這表明KLF5能夠促進(jìn)膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展。本研究結(jié)果顯示，干擾KLF5 表達(dá)后，U87 細(xì)胞的增殖和侵襲能力降低，與KLF5 在前列腺癌和肝細(xì)胞肝癌中的研究［14-15］結(jié)果一致。

細(xì)胞增殖與細(xì)胞周期密切相關(guān)。Li 等［6］報(bào)道，KLF5 能夠促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞中細(xì)胞周期的G1/S 期進(jìn)程，從而抑制胰腺癌細(xì)胞的增殖。本研究結(jié)果顯示，干擾KLF5 表達(dá)后，U87 細(xì)胞周期阻滯在G1期，這表明KLF5 促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的作用機(jī)制與調(diào)控細(xì)胞周期相關(guān)。

KLF5 作為一種重要的轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮多種作用機(jī)制。KLF5可通過促進(jìn)核因子κB 從細(xì)胞質(zhì)至細(xì)胞核的易位過程，促進(jìn)甲狀腺癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力［13］。KLF5 可通過調(diào)控Snail1 基因的表達(dá)，抑制宮頸癌細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程，降低宮頸癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力［3］。在乳腺癌中KLF5 調(diào)控的長鏈非編碼RNA RP1 通過抑制p27kip1發(fā)揮致癌作用［10］。p27kip1屬于細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑，被視為腫瘤抑制因子。p27kip1通過穩(wěn)定Cyclin D1-CDK4/6復(fù)合物中止細(xì)胞周期G1～S 期相變進(jìn)程［10］。同時(shí)研究顯示，p27kip1與腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移相關(guān)，p27kip1陽性表達(dá)與食管癌患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)［16］，RP1 通過抑制p27kip1蛋白表達(dá)調(diào)控Snail1 蛋白來維持乳腺癌細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化［10］。本研究結(jié)果顯示，干擾KLF5 表達(dá)后，U87 細(xì)胞p27kip1蛋白表達(dá)增加，細(xì)胞周期相關(guān)蛋白Cyclin D1、CDK4、CDK6 表達(dá)降低，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化蛋白Snail1 表達(dá)降低，表明干擾KLF5 表達(dá)可能通過促進(jìn)p27kip1表達(dá)抑制Cyclin D1、CDK4、CDK6 和Snail1 的表達(dá)，進(jìn)而抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖和侵襲能力。進(jìn)一步在KLF5 siRNA 干擾組中抑制p27kip1表達(dá)后發(fā)現(xiàn)，減少p27kip1表達(dá)可以增加KLF5 siRNA 組細(xì)胞的增殖和侵襲能力，進(jìn)一步表明KLF5介導(dǎo)p27kip1的表達(dá)促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的進(jìn)展。

綜上所述，干擾KLF5 的表達(dá)抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖和侵襲能力，可能介導(dǎo)p27kip1的表達(dá)調(diào)控細(xì)胞周期蛋白的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化蛋白實(shí)現(xiàn)的，KLF5可能是抗膠質(zhì)瘤治療的潛在分子靶點(diǎn)。但是本文未對KLF5 與p27kip1之間的具體作用機(jī)制進(jìn)行研究，存在不足，有待后續(xù)繼續(xù)深入探討。