BMP-4對甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響及其分子機(jī)制

孟曉梅，巴茂文，王紹光，于歲，李寧，唐與曉

青島大學(xué)附屬煙臺毓璜頂醫(yī)院，山東煙臺264000

甲狀腺癌是最常見的內(nèi)分泌器官來源的惡性腫瘤，近年來其發(fā)病率呈逐漸上升趨勢。甲狀腺乳頭狀癌（PTC）是甲狀腺癌中最常見的類型，部分PTC具有較高的侵襲性，導(dǎo)致生存率及生存質(zhì)量下降。研究顯示，上皮—間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）在甲狀腺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移中起重要作用［1］。細(xì)胞通過EMT獲得轉(zhuǎn)移和侵襲能力，多個因子如Snail、Slug、Twist 等參與調(diào)節(jié)EMT［2］。骨形態(tài)發(fā)生蛋白4（BMP-4）是骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMPs）家族成員之一，其在多種類型的腫瘤中有表達(dá)，對腫瘤細(xì)胞生長的影響呈現(xiàn)多樣性，可促進(jìn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤、前列腺癌及肝癌細(xì)胞增殖［3-5］，抑制乳腺癌和肺癌細(xì)胞生長［6-7］，對惡性黑色素瘤和卵巢癌細(xì)胞生長則沒有影響［8-9］。研究發(fā)現(xiàn)，BMP-4 與腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT 有關(guān)，BMP-4能夠通過誘導(dǎo)EMT 促進(jìn)肝癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移，沉默BMP-4 基因可阻止EMT 的發(fā)生及腫瘤轉(zhuǎn)移［10］。BMP-4 可通過Smad 依賴性信號通路發(fā)揮促進(jìn)腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的作用［11］，其中Smad1參與BMPs信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，在信號由細(xì)胞膜傳遞至細(xì)胞核的過程中起關(guān)鍵性作用。目前關(guān)于BMP-4 在PTC 中作用的研究尚未見報(bào)道。2018 年11月—2019年10月，我們通過觀察BMP-4對PTC細(xì)胞增殖、凋亡和侵襲能力的影響，并探討其與Smad1信號通路的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、試劑與儀器 PTC 細(xì)胞株TPC-1、K1、B-CPAP 購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。凋亡試劑盒購自eBioscience 公司，侵襲試劑盒及RMPI1640 購自Corning 公司，ECL 檢測試劑盒購自北京天根生化科技公司。胎牛血清購自Ausbian 公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Promega 公司，聚丙烯酰胺購自Bio-Rad 公司。兔抗人GAPDH 多克隆抗體、兔抗人E-Cadherin多克隆抗體、兔抗人Vimentin 單克隆抗體及兔抗人Smad1 單克隆抗體均購自Chemicon Millipore 公司。過表達(dá)及干擾BMP-4 重組慢病毒、引物由上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司合成。

1.2 BMP-4 mRNA 高表達(dá)和低表達(dá)PTC 細(xì)胞的篩選 取B-CPAP、TPC-1、K1 細(xì)胞，加入含10%FBS 的RMPI1640 培養(yǎng)液，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)，每天在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的密度、形態(tài)以及貼壁情況，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%～90%時用于實(shí)驗(yàn)。采用qPCR 法檢測細(xì)胞中BMP-4 mRNA表達(dá)水平。TRIzol 法提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，以此為模板進(jìn)行qPCR 擴(kuò)增。引物序列：BMP-4 上 游5"-CCTGGGCACCTCATCACA-3"，下 游5"-CATAGTTTGGCTGCTTCTC-3"。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)熱30 s；95 ℃5 s，60 ℃30 s，共40 個循環(huán)。以GAPDH 作為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算BMP-4 mRNA 的相對表達(dá)量。結(jié)果顯示，B-CPAP 細(xì)胞BMP-4 mRNA表達(dá)量最低，TPC-1細(xì)胞BMP-4 mRNA表達(dá)量最高。

1.3 細(xì)胞分組與病毒感染 取B-CPAP、TPC-1 細(xì)胞，加入胰酶消化，用完全培養(yǎng)基制成（3～5）×104/mL的細(xì)胞懸液，接種到培養(yǎng)板中。培養(yǎng)至鋪板量達(dá)到15%～30%后，將B-CPAP 細(xì)胞分為陰性對照組和過表達(dá)組，分別感染陰性片段、過表達(dá)BMP-4 重組慢病毒；TPC-1 細(xì)胞分為陰性對照組和干擾組，分別感染無效干擾片段和干擾BMP-4 重組慢病毒。病毒滴度：B-CPAP陰性對照組為1×109TU/mL，過表達(dá)組為5×108TU/mL；TPC-1 陰性對照組為6×108TU/mL，干擾組為8×108TU/mL。加入病毒后10 h 換為常規(guī)培養(yǎng)基培養(yǎng)。感染后72 h，熒光顯微鏡觀察感染率達(dá)到70%以上，表明感染有效，可進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

1.4 細(xì)胞增殖能力觀察 采用MTT 法。感染5 d后收集各組細(xì)胞，加入胰酶消化。加入含10% FBS的DMEM 培養(yǎng)液并中和、離心收集，重懸后獲得細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為5×104/mL，接種于96 孔板中培養(yǎng)5 d。從鋪板后次日開始，培養(yǎng)終止前4 h 加入20 μL 5 mg/mL MTT，作用4 h 后吸去培養(yǎng)液，加100 μL DMSO 溶解甲瓚顆粒，振蕩2～5 min。上酶標(biāo)儀，于490 nm波長處檢測光密度（OD）值。

1.5 細(xì)胞凋亡檢測 采用Annexin V-APC 單染法。感染5 d 后收集各組細(xì)胞，胰酶消化，完全培養(yǎng)基重懸成細(xì)胞懸液，接種于6 孔板中，每組設(shè)3 個復(fù)孔（為保證上機(jī)細(xì)胞數(shù)足夠，細(xì)胞數(shù)目≥5×105/L）。1 300 r/min 離心5 min，棄上清，4 ℃預(yù)冷的D-Hanks（pH=7.2～7.4）洗滌細(xì)胞沉淀，1×binding buffer 洗滌細(xì)胞沉淀，1 300 r/min 離心3 min，收集細(xì)胞，200 μL 1×binding buffer 重懸細(xì)胞沉淀，加入10 μL Annexin V-APC 染色，室溫避光10～15 min，根據(jù)細(xì)胞量，補(bǔ)加400～800 μL 1×binding buffer，上機(jī)檢測。使用流式細(xì)胞儀分析軟件Guava InCyte進(jìn)行分析。

1.6 細(xì)胞侵襲能力觀察 采用Corning 實(shí)驗(yàn)。上室中培養(yǎng)基加入500 μL細(xì)胞懸液，下室內(nèi)加入750 μL 30% FBS 培養(yǎng)基，同時使用該細(xì)胞懸液鋪一塊MTS 96 孔板，每孔接種5×103個細(xì)胞，接種后即測定OD570，作為侵襲參照。37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)B-CPAP 細(xì)胞18 h，培養(yǎng)TPC-1 細(xì)胞48 h，移去小室內(nèi)非侵襲細(xì)胞，染色轉(zhuǎn)移細(xì)胞3～5 min 后，將小室浸泡沖洗數(shù)次，晾干，顯微鏡拍照計(jì)數(shù)。

1.7 細(xì) 胞E-Cadherin、Vimentin、Smad1 mRNA 檢測 感染后72 h 采用qPCR 法進(jìn)行檢測，實(shí)驗(yàn)步驟同“1.2.2”。引物序列：E-Cadherin 上游：5"-AACGCATTGCCACATACA-3"，下游：5"-CGGGCTTGTTGTCATTC-3"；Vimentin 上 游 ：5"-AATGGCTCGTCACCTTCG-3"，下游：5"-CTAGTTTCAACCGTCTTAATCAG-3"；Smad1 上 游：5"-ATGCCGAATGCCTTAGTG-3"，下 游：5"-ACATCCTGGCGGTGGTA-3"；GAPDH 上游：5"-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3"，下游：5"-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3"。

1.8 細(xì)胞E-Cadherin、Vimentin、Smad1蛋白檢測 采用Western blotting法。感染72 h 后收集細(xì)胞，提取蛋白，每孔道上40 μg 蛋白樣品，聚丙稀酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉，一抗孵育（兔抗人E-Cadherin 多抗、兔抗人Vimentin 單抗，兔抗人Smad1 單 抗，兔抗人GAPDH 多 抗，均1∶1 000 稀釋），4 ℃過夜共孵育，次日洗膜，二抗孵育（辣根過氧化物酶標(biāo)記的相應(yīng)二抗，1∶5 000 稀釋），洗膜，顯像。采用Image J 軟件分析蛋白條帶灰度值，以目標(biāo)蛋白與內(nèi)參灰度值比值表示目標(biāo)蛋白的相對表達(dá)量。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS20.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以±s 表示，兩組間比較采用配對t 檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞增殖能力比較 B-CPAP 細(xì)胞中，過表達(dá)組和陰性對照組OD 值分別為2.96 ± 0.05、2.55±0.01，過表達(dá)組高于陰性對照組；TPC-1 細(xì)胞中，干擾組和陰性對照組OD 值分別為2.26±0.10、4.04±0.06，干擾組低于陰性對照組（P均＜0.01）。

2.2 各組細(xì)胞凋亡率比較 B-CPAP細(xì)胞中，過表達(dá)組和陰性對照組的細(xì)胞凋亡率分別為1.63%±0.10%、3.60% ± 0.21%，兩組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；TPC-1細(xì)胞中，干擾組和陰性對照組的細(xì)胞凋亡率分別為16.29%±0.78%、4.52%±0.19%，干擾組高于陰性對照組（P＜0.01）。

2.3 各組細(xì)胞侵襲能力比較 B-CPAP 細(xì)胞中，過表達(dá)組和陰性對照組細(xì)胞轉(zhuǎn)移數(shù)分別為（58 ± 5）、（53±3）個，兩組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；TPC-1 細(xì)胞中，干擾組和陰性對照組的細(xì)胞轉(zhuǎn)移數(shù)分別為（14 ± 1）、（21 ± 3）個，干擾組少于陰性對照組（P＜0.05）。

2.4 各組E-Cadherin、Vimentin、Smad1 mRNA 及蛋白表達(dá)比較 B-CPAP細(xì)胞中，過表達(dá)組和陰性對照組E-Cadherin、Vimenin、Smad1 mRNA 及蛋白表達(dá)比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P 均＞0.05），見表1；TPC-1細(xì)胞中，干擾組和陰性對照組E-Cadherin、Smad1 mRNA 及蛋白表達(dá)量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P 均＞0.05），Vimenin mRNA 及蛋白表達(dá)量干擾組低于陰性對照組（P＜0.01），見表2。

表1 兩組B-CPAP細(xì)胞E-Cadherin、Vimentin、Smad1 mRNA及蛋白表達(dá)比較（±s）

表1 兩組B-CPAP細(xì)胞E-Cadherin、Vimentin、Smad1 mRNA及蛋白表達(dá)比較（±s）

注：與陰性對照組比較，P均＞0.05。

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表2 兩組TPC-1細(xì)胞E-Cadherin、Vimentin、Smad1 mRNA及蛋白表達(dá)比較（±s）

表2 兩組TPC-1細(xì)胞E-Cadherin、Vimentin、Smad1 mRNA及蛋白表達(dá)比較（±s）

注：與陰性對照組比較，*P＜0.01。

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3 討論

大部分PTC患者經(jīng)過有效合理的治療后預(yù)后良好，但部分PTC 具有較高的侵襲性，出現(xiàn)腫瘤進(jìn)展、轉(zhuǎn)移和術(shù)后復(fù)發(fā)等，導(dǎo)致患者的生存率及生存質(zhì)量下降。因此，研究PTC 細(xì)胞的生長、浸潤和轉(zhuǎn)移過程，尋找PTC 中差異性表達(dá)、預(yù)測腫瘤侵犯、轉(zhuǎn)移的生物學(xué)標(biāo)記和干預(yù)治療的分子，對于進(jìn)一步改善患者預(yù)后具有重要意義。BMP-4 是骨形態(tài)發(fā)生蛋白BMPs 家族成員之一，表達(dá)于多種類型的腫瘤，且對不同腫瘤細(xì)胞生長的影響不同。我們前期對PTC患者的研究顯示，BMP-4蛋白在腫瘤直徑＞1 cm患者中的高表達(dá)率高于腫瘤直徑≤1 cm 者，在有包膜浸潤患者中的高表達(dá)率高于無包膜浸潤者，在TNM 分期Ⅲ+Ⅳ期患者中的高表達(dá)率高于Ⅰ+Ⅱ期者。這提示高表達(dá)BMP-4的PTC患者更容易發(fā)生腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移，BMP-4 可能在PTC 的侵襲和轉(zhuǎn)移中起重要作用［12］。

腫瘤共性的生物學(xué)特征是失控性生長，其主要分子機(jī)制是細(xì)胞周期紊亂導(dǎo)致細(xì)胞增殖過多和調(diào)亡過少。MA等［13］報(bào)道，BMP-4可通過加速G1/S細(xì)胞周期進(jìn)展而促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖。本研究結(jié)果顯示，PTC細(xì)胞系B-CPAP、TPC-1、K1 中均可檢測到BMP-4 表達(dá)，B-CPAP細(xì)胞感染過表達(dá)BMP-4慢病毒后增殖能力增加，TPC-1 細(xì)胞感染干擾BMP-4 慢病毒后增殖能力下降而凋亡率增加，表明BMP-4 可促進(jìn)PTC 細(xì)胞增殖、抑制其凋亡。

上皮細(xì)胞喪失極性、黏附性下降，且細(xì)胞骨架重塑，轉(zhuǎn)化為具有活動能力的間質(zhì)細(xì)胞，這個過程被稱為EMT。EMT 與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。KNAUF 等［14］報(bào)道，PTC 進(jìn)展至低分化癌過程中癌細(xì)胞發(fā)生了EMT。VASCO 等［15］研究顯示，與腫瘤中心區(qū)域比較，PTC 侵襲性區(qū)域中EMT 相關(guān)基因表達(dá)升高。BMP-4 對腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移及EMT 有調(diào)節(jié)作用，且在不同腫瘤中的表現(xiàn)不同。DENG等［16］報(bào)道，BMP-4通過誘導(dǎo)EMT 促進(jìn)胃癌轉(zhuǎn)移；FEELEY 等［17］報(bào)道，BMP-4 對前列腺癌細(xì)胞系的細(xì)胞轉(zhuǎn)移沒有影響；ZHAO 等［18］報(bào) 道，BMP-4 可 促 進(jìn) 膠 質(zhì) 瘤 細(xì) 胞ECadherin 表達(dá)從而抑制腫瘤轉(zhuǎn)移；在乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231 和MCF-7 中，BMP-4 高表達(dá)可抑制腫瘤細(xì)胞增殖、促進(jìn)侵襲和轉(zhuǎn)移，具有抑制腫瘤及促進(jìn)腫瘤的雙重作用［6，19］。KETOLAINEN 等［20］對9 個乳腺癌細(xì)胞系給予外源性BMP-4 后，所有細(xì)胞系都表現(xiàn)出細(xì)胞增殖能力下降，而細(xì)胞轉(zhuǎn)移的變化在不同的細(xì)胞系表現(xiàn)不同。MDA-361 細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力顯著增加，T-47D細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力下降，而HCC38、SK-BR-3、ZR-75-30 細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力無明顯變化。以上研究表明，腫瘤細(xì)胞對BMP-4 作用的反應(yīng)各異，存在細(xì)胞特異性。本研究結(jié)果顯示，B-CPAP細(xì)胞過表達(dá)組與陰性對照組的細(xì)胞侵襲能力無明顯差異，TPC-1 細(xì)胞干擾組的侵襲能力較陰性對照組下降，表明BMP-4可增加TPC-1細(xì)胞的侵襲能力，對B-CPAP細(xì)胞侵襲能力則沒有產(chǎn)生影響。兩個細(xì)胞系表現(xiàn)不同，可能是細(xì)胞系特異性所致。

E-Cadherin 是上皮細(xì)胞標(biāo)志物，抑制E-Cadherin表達(dá)或阻斷其功能可致細(xì)胞間質(zhì)形態(tài)改變，有利于細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移［21］。Vimentin 是間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物，除了參與構(gòu)成細(xì)胞支架、維持細(xì)胞的完整性外，還與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移關(guān)系密切［22］。RODRIGUEZ 等［23］報(bào)道，Vimentin 可能是EMT 的上游調(diào)節(jié)因子，沉默Vimentin 基因后，EMT 過程可出現(xiàn)逆轉(zhuǎn)。本研究結(jié)果顯示，雖然B-CPAP 細(xì)胞兩組間E-Cadherin 及Vimentin mRNA 及蛋白表達(dá)無明顯差異，但TPC-1細(xì)胞干擾組Vimentin 的表達(dá)低于陰性對照組，提示BMP-4在該細(xì)胞系與EMT的發(fā)生有關(guān)。

BMPs 發(fā)揮作用主要是通過Smad 依賴性及非Smad依賴性兩條信號通路［24］。Smad蛋白是Smad依賴性通路中細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)的樞紐［25］，其中Smad1參與BMPs 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，在信號由細(xì)胞膜傳遞至細(xì)胞核的過程中起到了關(guān)鍵性的作用。此外，BMPs還可通過其他信號通路來發(fā)揮作用，包括細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶、p38 絲裂原活化蛋白激酶通路［18］。研究發(fā)現(xiàn)，BMP-4可通過Smad依賴性信號通路發(fā)揮促進(jìn)腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的作用，還可通過非Smad依賴性信號通路發(fā)揮作用［26］。本研究結(jié)果顯示，B-CPAP細(xì)胞過表達(dá)BMP-4 及TPC-1 細(xì)胞干擾BMP-4 表達(dá)后，與陰性對照組相比Smad1 均無明顯變化，提示在PTC 細(xì)胞系中BMP-4 發(fā)揮作用不是通過Smad1 通路，可能是通過其他通路。

綜上所述，BMP-4 在PTC 細(xì)胞中存在表達(dá)且具有促進(jìn)細(xì)胞增殖和抑制細(xì)胞凋亡的作用，干擾BMP-4 表達(dá)可抑制細(xì)胞發(fā)生EMT 及細(xì)胞轉(zhuǎn)移，提示BMP-4 可能成為預(yù)測PTC 侵襲轉(zhuǎn)移的生物學(xué)標(biāo)記，但關(guān)于BMP-4 發(fā)揮作用經(jīng)由的信號通路及調(diào)控機(jī)制還需要進(jìn)一步的研究。