馬鈴薯StIgt基因家族的鑒定及其對干旱脅迫的響應分析

秦天元 劉玉匯 孫 超 畢真真 李安一 許德蓉 王一好 張俊蓮 白江平,*

研究簡報

馬鈴薯基因家族的鑒定及其對干旱脅迫的響應分析

秦天元1,2劉玉匯1,2孫 超1,2畢真真1,2李安一3許德蓉1,2王一好1,2張俊蓮1白江平1,2,*

1甘肅省干旱生境作物學重點實驗室 / 甘肅省作物遺傳改良與栽培種創(chuàng)新重點實驗室, 甘肅蘭州 730070;2甘肅農業(yè)大學農學院, 甘肅蘭州 730070;3蘭州大學草地農業(yè)科技學院 / 草地農業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國家重點實驗室, 甘肅蘭州 730020

干旱脅迫是影響馬鈴薯產量和品質的主要非生物脅迫因素之一。馬鈴薯在抵御干旱脅迫的過程中, 根系的生長發(fā)育和構型分布發(fā)揮著重要作用?；蚣易迨瞧毡榇嬖谟谥参镏械囊活惞δ芑? 在調控植物根系構型和提高植株抗逆性等方面效果顯著。本研究以馬鈴薯雙單倍體‘DM-v4.03’高質量基因組為參考, 在全基因組范圍內分析鑒定了基因家族的成員, 并采用多種生物信息學軟件對其進行了系統(tǒng)進化樹構建、染色體定位、保守蛋白結構域、基因結構和順式元件預測。同時, 利用本課題組前期對馬鈴薯四倍體品系在不同干旱條件下的轉錄組測序結果, 分析了響應干旱脅迫的表達譜。結果表明, 在馬鈴薯中共鑒定獲得10個家族成員, 其中由本課題組前期克隆獲得。除位置信息不明外, 其余基因不均勻地分布在1、2、5、7、10和11號染色體上。StIgt家族蛋白長度為110~283個氨基酸, 分子量介于13.136~32.542 kD之間, 預測等電點為3.82~9.86。系統(tǒng)進化樹分析發(fā)現(xiàn), 該基因家族可分為3個亞族, 亞族間的基因結構、蛋白保守域和順式作用元件差別明顯。干旱脅迫下的表達譜分析表明,和響應早期干旱脅迫, 在干旱2 h時即迅速上調表達。這些結果為闡明基因家族的進化關系和進一步研究其成員的功能特性提供了理論基礎。

全基因組; 馬鈴薯;基因家族; 干旱脅迫; 表達譜分析

馬鈴薯(L.), 屬茄科(Solanaceae)龍葵亞屬(), 一年生植物, 是繼玉米、小麥和水稻之后的世界第四大糧食作物[1]。馬鈴薯屬于塊莖類作物, 在塊莖發(fā)育過程中, 干旱脅迫會改變馬鈴薯的庫源關系, 從而影響塊莖的形成, 降低產量和品質[2-4]。植物為了避免在干旱脅迫下的不利影響, 在進化過程中建立了一套自我防衛(wèi)機制[5-8], 其中是普遍存在于植物中的一類與根系發(fā)育和抗逆相關的功能性基因, 主要包括、和3種不同的亞簇[9]。其中,()在作物中的研究相對深入。水稻中的研究發(fā)現(xiàn),受到生長素信號下游關鍵轉錄因子的直接調控, 主要控制植物根細胞的伸長, 影響根系的向地性生長, 可通過減小根系的垂直角度而造成深根效應, 進而提高水稻抗旱性[9-10]; 在小麥、擬南芥和李屬植物中也發(fā)現(xiàn),可通過改變側根角度和初生根長度來影響根系構型[11]。主要調控植物分蘗角度[12-14]。同樣主要參與植物根系角度的調控[15-16]。此外, 還有研究表明,家族在作物應對高鹽和干旱等非生物脅迫中也發(fā)揮著重要作用[10-12]。

目前為止,基因家族僅在模式植物擬南芥和禾本科的少數(shù)作物中有所研究, 在馬鈴薯中基因家族成員尚未被鑒定和克隆, 其在植物地上部分和根系的形態(tài)建成以及抵御干旱脅迫過程中的功能尚有待闡明。隨著馬鈴薯全基因組序列的測序完成, 為研究者更充分地研究馬鈴薯基因家族提供了可能。因此本研究首先通馬鈴薯全基因組范圍內鑒定了該基因家族成員的10個成員, 并對其序列特征、染色體位置、系統(tǒng)發(fā)育關系、順式元件和干旱脅迫響應的表達譜等方面進行了綜合分析。這些結果為進一步研究馬鈴薯基因家族的分化歷程及生物學功能奠定了基礎, 也為馬鈴薯抗逆基因挖掘和種質創(chuàng)新提供了理論參考。

1 材料與方法

1.1 馬鈴薯StIgt基因家族成員的鑒定

從Ensemble數(shù)據(jù)庫下載馬鈴薯參考基因組序列(PGSC, http://plants.ensembl.org/Solanum_tuberosum/Info/ Index)以鑒定馬鈴薯基因組中的基因家族成員。由于馬鈴薯基因沒有隱馬爾可夫模型(HMM), 所以我們采用BLAST方法進行搜索[17]。從NCBI數(shù)據(jù)庫(https:// www.ncbi.nlm.nih.gov/)下載了擬南芥、水稻、桃子、楊樹等物種的基因序列, 并使用它們作為種子序列來搜索馬鈴薯蛋白質序列中基因家族成員。為了盡可能搜索到真正的基因家族成員, 使用e值≤1e?10的條件進行基于blast算法的搜索。將搜索得到的序列分別提交到CDD數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/structure/ bwrpsb/bwrpsb.cgi)和Pfam數(shù)據(jù)庫(http://pfam.xfam.org/)以確認保守結構域[18-19]。同時利用本課題組已有的拼接度較好的馬鈴薯二代Illumina的轉錄組序列進一步確認這些成員。最后將所得成員統(tǒng)稱為, 命名為~。其中(gi|565391246:116-963)基因為本課題組所克隆。

1.2 馬鈴薯StIgt基因的生物信息學分析

將最終鑒定的進行系統(tǒng)發(fā)育分析。所有獲得的序列首先由ClustalX (版本1.83)軟件[20](默認參數(shù))進行對齊, 再利用MEGA7軟件[21]采用鄰接法構建系統(tǒng)進化樹, bootstrap測試1000次, 根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育樹的拓撲結構將馬鈴薯基因家族成員分為不同的類群。所有高置信度序列均提交至ExPASy網(wǎng)站(http://web.expasy.org/ protparam/)計算氨基酸數(shù)量、分子量和理論等電點(pI)。利用meme工具(版本4.11.2,http://alternate.meme-suite. org/tools/meme)來搜索識別序列中的保守基序[22]。通過(PG2C, http://mg2c.iask.in/mg2c_v2.1/)獲得的染色體位置和內含子數(shù)量。利用在線繪圖網(wǎng)站(GSDS, http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)鑒定了基因的外顯子-內含子結構。提取馬鈴薯中得到的基因編碼區(qū)上游1.5 kb序列, 然后提交到PlantCARE (http://bioinformatics.psb. ugent.be/webtools/plantcare/html/)數(shù)據(jù)庫進行順式作用元件鑒定。根據(jù)馬鈴薯基因組數(shù)據(jù)庫中的物理位置信息, 使用Circos軟件將基因定位到馬鈴薯染色體上。

1.3 馬鈴薯StIgt的基因表達模式分析

利用課題組已有的馬鈴薯二代Illumina的RNA-seq數(shù)據(jù), 進一步分析基因基因家族響應干旱的表達譜。將供試馬鈴薯品系C119 (CIP398098.119)的無菌試管苗培養(yǎng)于含有3%蔗糖和0.8%瓊脂的Murashige和Skoog (MS)培養(yǎng)基上, pH 5.9[23]。C119保存在人工氣候室中, 光照時間為16 h光照/8 h黑暗, 培養(yǎng)溫度為 (22±1)℃。待C119長至25 d時, 將幼苗重新移入含有150 mmol L-1甘露醇的MS液體培養(yǎng)基中進行干旱脅迫, 分別于0、2、6、12和24 h時采集植株根部, 用于轉錄組測序。從上述RNA-seq數(shù)據(jù)中提取出在這5個時間點的FPKM值, 運用R軟件中的Heatmap包來繪制其響應干旱脅迫的表達模式熱圖。

2 結果與分析

2.1 馬鈴薯StIgt基因家族的成員鑒定和聚類分析

利用生物信息學方法通過雙向BLAST分析, 從馬鈴薯‘DM-v4.03’全基因組中共篩選到了21個備選序列, 通過局部BLASTP并刪除重復序列后, 保留15個序列, 提交CDD、Pfam確認蛋白結構域。再將這15條序列與已在擬南芥、李屬植物、水稻、玉米等其他作物中報道的基因序列進行同源比對(表1), 最后在馬鈴薯中共確定了10個家族成員(表2)。由表2可知, 馬鈴薯中家族蛋白長度范圍從110 (StIgt10)到283個氨基酸(StIgt1)不等, 分子量介于13.136 kD (StIgt10)和32.542 kD (StIgt1)之間, 預測等電點為3.82 (StIgt4)~9.86 (StIgt10)。大多數(shù)蛋白(90%)的等電點小于7.0, 推測其可能是一類酸性蛋白。為進一步了解基因家族成員之間的同源關系, 本研究利用擬南芥、辣椒、水稻和玉米中已研究的基因共同構建了的系統(tǒng)進化樹, 聚類為3個亞族:(I)、(II)和(III), 分別含有4、4、2個基因(圖1)。

2.2 馬鈴薯StIgt基因家族的結構特征分析

對馬鈴薯基因家族蛋白保守結構域進行分析, 共鑒定出10個保守基序(Motif)。其中, 第I亞族中包含Motif 1、Motif 2、Motif 3、Motif 5、Motif 8、Motif 9和Motif 10, 第II亞族中包含Motif 1、Motif 3、Motif 4、Motif 6、Motif 7、Motif 9和Motif 10, 第III亞族中包含Motif 1、Motif 3、Motif 4和Motif 10 (圖2)。I亞族中的基因相對于其他成員擁有更多的蛋白保守序列, 推測I亞族基因結構可能較II和III亞族更為復雜。此外, 在中普遍存在的保守結構域為Motif 1、Motif 3和Motif 10。從3個亞族的結構來看, I亞族包含除Motif 3、Motif 6和Motif 7之外的其他所有結構域; II亞族主要包含Motif 1、Motif 3、Motif 6和Motif 7, 且Motif多集中于序列前半段和后半段; III亞族則主要含有Motif 1和Motif 3結構域, 其中III亞族基因1相對于同亞族2多了一個Motif 3和Motif 4, 且Motif 1和Motif 3之間的內含子長度不同, 說明這些基因在遺傳進化過程中可能存在遺傳信息的遺失(圖2-A)。同時, 基因結構分析表明,3個亞族的基因結構具有顯著差別, 整體看來, I亞族外顯子數(shù)目為1~4個, II亞族為1~6個, III亞族為2個。同亞族內基因一般都具有類似的外顯子結構, 但從基因全長來看, 相似的CDS長度卻有不同的基因全長, 說明內含子長度具有較大的差異性(圖2-B)。

表1 擬南芥、桃、玉米與水稻Igt基因登錄號

表2 馬鈴薯StIgt基因家族信息

2.3 馬鈴薯StIgt基因家族的染色體定位分析與脅迫相關的順式元件分析

馬鈴薯基因家族共鑒定到10個成員, 其中可能由于參考基因組組裝完整度的問題, 并沒有找到染色體位置信息, 其余9條基因分別分布在1、2、5、7、10和11號染色體上, 其中1號染色體上有3個基因, 7號染色體上分有2個, 其余染色體各有1個。2號染色體上的基因分布在其下端, 7號和11號染色體的基因分布在其中間部位, 5號和10號染色體上基因分布在其上端。通過比較3個亞族基因在染色體上分布情況, 發(fā)現(xiàn)I亞族基因分布于1、2、5和11號染色體上, II亞族基因分布在1、7和10號染色體上, III亞族基因在7號染色體上(圖3-A)。為進一步研究基因是否響應非生物脅迫, 本研究提取基因翻譯起始位點上游1.5 kb的序列提交到PlantCare在線網(wǎng)站進行順式元件檢測。結果如圖3-B所示, 共檢測到6個非生物脅迫響應元件, 分別為脫落酸響應元件(ABRE)、脫水反應元件(MBS), 參與防御和應激反應的作用元件(ERE)、脅迫響應元件(W-box)、水楊酸響應元件(TCA- element)和生長素響應元件(TGA-element)。通過3個亞族基因的順式元件分布情況比較發(fā)現(xiàn), 馬鈴薯基因家族均含有ERE順式作用元件, 其中II亞族基因相對于Ⅲ亞族富含更多逆境響應元件如ABRE、MBS、TCA-element和W-box, 而I亞族基因相對于II亞族富含更多生長素響應的順式作用元件如TGA-element。這表明,基因家族與逆境響應, 尤其是非生物脅迫的響應密切相關。

A: 蛋白結構域特征; B: 基因結構。A: protein structure; B: gene structure.

ABRE:脫落酸作用元件;ERE: 參與防御和應激反應的作用元件; MBS:干旱脅迫反應元件; TCA-element:水楊酸作用元件;TGA-element:生長素響應元件;W-box:脅迫響應元件。

ABRE: cis-acting element involved in the abscisic acid responsiveness; ERE: elements involved in defense and stress response; MBS: MYB binding site involved in drought-inducibility; TCA-element: cis-acting element involved in salicylic acid responsiveness; TGA-element: cis-acting element involved in auxin responsiveness; W-box: cis-acting element involved in the stress responsiveness.

2.4 馬鈴薯StIgt基因家族在響應干旱脅迫的表達譜分析

基于前述生物信息分析結果,基因家族可能響應非生物脅迫。因此, 本研究利用課題組前期的對四倍體馬鈴薯品系C119的轉錄組測序數(shù)據(jù), 提取不同干旱處理時間下的FPKM值, 對其響應干旱脅迫的表達譜進行了分析, 并對其中3個基因進行了qPCR驗證。結果顯示, 該家族的3個亞族間的表達趨勢各不相同, 其中亞族I中的、和均在干旱脅迫2 h時基因表達量升高至最高, 在6 h和24 h時表達量下降;的表達量也呈先升高后降低的趨勢, 但是于6 h時達到峰值。亞族II的和在干旱脅迫2 h時表達量開始降低, 隨后保持較低水平, 直至在脅迫24 h的表達量降至最低。亞族III的和在干旱脅迫早期2 h時表達量呈下降趨勢, 到6 h時降至最低, 隨后在脅迫12 h時基因的表達量開始上升, 到24 h時又表達量升至最高, 這與亞族I和II呈現(xiàn)相反的表達趨勢。綜合來看,和基因在干旱脅迫2 h時表達量均發(fā)生上調且達到峰值, 說明這部分基因可能迅速響應早期干旱脅迫(圖4)。隨后我們重新處理了材料, 選取了3個基因和進行qPCR驗證, 它們分別為擬南芥的、和的直系同源基因。qPCR結果表明, 這3個基因的表達趨勢與轉錄組結果相吻合, 印證了轉錄組數(shù)據(jù)的可靠性, 其中基因表達量在6 h和12 h時相對于對照0 h時差異極顯著,基因表達量在12 h時相對于對照0 h時差異極顯著,基因表達量在2 h和12 h時相對于對照0 h時差異極顯著(圖5)。表明,基因家族可響應干旱脅迫, 且3個亞族的在不同的脅迫條件下響應模式也不同。

3 討論

目前我國60%左右的馬鈴薯種植于干旱和半干旱地區(qū)(年平均降水量小于500 mm, 干燥度在1.5以上)。長期或季節(jié)性的干旱脅迫會嚴重影響馬鈴薯的植株長勢、塊莖產量和商品性質量[24-25]。在禾本科作物中的研究表明, 較深的根系可以明顯提高作物在極端或者季節(jié)性干旱環(huán)境下的產量, 且可作為耐旱作物育種評鑒與篩選的指標之一[26-27]。在塊根塊莖類作物中根系構型也是重要的產量構成因素[28]。深根性狀除了可由主根系的長度增加造成外, 還可由側根系或不定根系的向地性增強造成。而目前在多種植物中的研究發(fā)現(xiàn),基因家族與重力反應相關的向性調控如地上部分支角度、垂直根系角度等密切相關[15-16,29-30]。例如,和, 已被證明可以調控單子葉(水稻和玉米)和雙子葉(擬南芥和李屬植物)物種的各種側枝器官的角度, 包括分蘗、分枝、花梗、葉柄和果柄, 以及垂直根系角度[10-11], 此外, 功能研究較為深入的()已被證實可通過增加根系的向地性生長, 形成深根效應, 進而提高水稻的耐旱性[10]。而在馬鈴薯中,關于根系構型影響抗旱性的基因調控研究還少見報道。本課題組前期克隆了馬鈴薯(), 并在近期的研究中發(fā)現(xiàn),響應干旱脅迫和生長素處理, 并在擬南芥中驗證了其參與調控側根角度和抵御干旱脅迫。因此,基因家族在調控馬鈴薯根系構型和抗旱方面的研究值得深入。

*, **分別表示在0.05和0.01水平上顯著差異。

* and ** mean significant difference at the 0.05 and 0.01 probability levels, respectively.

為進一步研究的其他成員, 本研究利用馬鈴薯‘DM-v4.03’參考基因組, 經過Fgenesh[31]和blast[32]方法對馬鈴薯基因序列進行手動矯正和重新注釋后共鑒定獲得10個成員, 并對其結構、染色體定位、系統(tǒng)發(fā)育和逆境相關順式元件等進行了分析。系統(tǒng)發(fā)育樹顯示,基因家族可分為3個不同的亞族, 不同亞族間的蛋白結構域和基因結構差異顯著, 暗示其進化地位的差異和功能的多樣性。此外, 在的啟動子區(qū)域發(fā)現(xiàn)了多種植物激素和非生物脅迫相關的順式作用元件, 說明的上游可能受到生長素、脅迫相關激素(脫落酸和水楊酸)以及脅迫信號的協(xié)同調控, 從而發(fā)揮調節(jié)植物向地性生長和抵御逆境的功能。

鑒于此, 我們利用本課題組前期的四倍體馬鈴薯品系在不同干旱處理條件下的轉錄組數(shù)據(jù), 提取FPKM值, 分析了各個成員響應干旱脅迫的表達譜。結果表明, 不同的亞族對干旱的響應模式不同, 同一亞族內則有一定的規(guī)律性趨勢。亞族I和亞族II的和可在早期(2 h)迅速響應干旱脅迫, 說明可能直接受到干旱信號的誘導, 但具體的機理有待于進一步研究。而所在的亞族III與其他2個亞族的表達模式差異較大, 對干旱脅迫響應相對滯后, 前人在禾本科作物中的研究也發(fā)現(xiàn),受到生長素的直接調控, 這2種信號通路可能在上游通過未知的機制互作來協(xié)同調控的表達。同時, 本研究也利用q-PCR驗證了轉錄組表達譜的可靠性。綜上所述, 馬鈴薯的10個成員可能在馬鈴薯地上部和根系的分支角度以及響應干旱脅迫中發(fā)揮不同的作用。本研究對基因家族提供了較全面的信息, 為進一步研究馬鈴薯的功能和作用機理提供了基礎支持。

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Identification ofgene family and expression profile analysis of response to drought stress in potato

QIN Tian-Yuan1,2, LIU Yu-Hui1,2, SUN Chao1,2, BI Zhen-Zhen1,2, LI An-Yi3, XU De-Rong1,2, WANG Yi-Hao1,2, ZHANG Jun-Lian1, and BAI Jiang-Ping1,2,*

1Gansu Provincial Key Lab of Aridland Crop Science / Gansu Key Laboratory of Crop Improvement & Germplasm Enhancement, Lanzhou 730070, Gansu, China;2College of Agronomy, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070, Gansu, China;3College of Pastoral Agriculture Science and Technology, Lanzhou University, Lanzhou 730020, Gansu, China

Drought stress is one of the main abiotic stress factors affecting potato yield and quality. The root growth, development and architecture play an important role in potato drought resistance. Thegene family is a functional gene family that are ubiquitous in plants, and has significant effects in regulating root architecture and improving plant stress resistance. In this study, the potato double haploid ‘DM-v4.03’ high-quality genome was used as a reference, and members of thegene family were identified and analyzed on a genome-wide scale. Phylogenetic trees, chromosomal location, conservative protein domains, gene structure and cis element prediction were carried out by bioinformatics software. Meanwhile, the expression profiles ofin response to drought stress were analyzed based on the transcriptome sequencing results of potato tetraploid lines under different drought conditions. The results showed that a total of 10family members were identified in potato, of whichwas obtained and cloned by our research group. Except for the unknown position information ofthe remaining genes are unevenly distributed on chromosome 1, 2, 5, 7, 10, and 11.proteins range in length from 110 to 283 amino acids and have molecular weights ranging from 13.136 kD to 32.542 kD. The predicted isoelectric point is 3.82 to 9.86. Phylogenetic tree analysis revealed that the gene family can be divided into three subfamilies. The gene structure, protein conserved domains and cis-acting elements differ significantly among three subfamilies. The expression profile analysis under drought stress showed that,,andresponded to the early drought stress which rapidly up-regulated at two hours of drought treatment. These results provide a theoretical basis for elucidating the evolutionary relationship of thegene family and further studying the functional characteristics of its members.

genome-wide; potato;gene family; drought stress; gene expression analyses

10.3724/SP.J.1006.2021.04122

本研究由國家自然科學基金項目(31660432), 國家現(xiàn)代農業(yè)產業(yè)技術體系建設專項(CARS-09-P14), 甘肅省馬鈴薯產業(yè)體系(GARS-03- P1), 甘肅省創(chuàng)新能力提升項目(2019B-073), 甘肅省科技計劃項目(19ZD2WA002-02, 18JR3RA174), 甘肅農業(yè)大學國重實驗室開放基金(GSCS-2017-9)和甘肅農業(yè)大學創(chuàng)新基金項目(GAU-XKJS-2018-085)資助。

This study was supported by the National Natural Science Foundation of China (31660432), the China Agriculture Research System (CARS-09-P14), the Gansu Province Potato Industry System (GARS-03-P1), the Gansu Provincial Education Department (2019B-073), the Gansu Provincial Science and Technology Department (19ZD2WA002-02, 18JR3RA174), the Key Laboratory of Arid Land Crop Science of Gansu Agricultural University(GSCS-2017-9), and the Innovation Fund of Gansu Agricultural University (GAU-XKJS-2018-085).

白江平, E-mail:baijp@gsau.edu.cn

E-mail: 1637835362@qq.com

2020-06-04;

2020-10-14;

2020-11-06.

URL: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20201105.1016.002.html