玉米雜交種純度鑒定SNP核心引物的確定及高通量檢測(cè)方案的建立

王 蕊 施龍建, 田紅麗 易紅梅 楊 揚(yáng) 葛建镕 范亞明 任 潔 王 璐 陸大雷 趙久然* 王鳳格*

研究簡(jiǎn)報(bào)

玉米雜交種純度鑒定SNP核心引物的確定及高通量檢測(cè)方案的建立

王 蕊1,**施龍建1,2,**田紅麗1易紅梅1楊 揚(yáng)1葛建镕1范亞明1任 潔1王 璐1陸大雷2趙久然1,*王鳳格1,*

1北京市農(nóng)林科學(xué)院玉米研究中心 / 玉米DNA指紋及分子育種北京市重點(diǎn)研究室, 北京 100097;2揚(yáng)州大學(xué) / 江蘇省作物遺傳生理國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育點(diǎn) / 糧食作物現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心, 江蘇揚(yáng)州 225009

純度是玉米種子質(zhì)量的重要指標(biāo)之一, 尤其雜交種自交株是影響田間產(chǎn)量的關(guān)鍵因素。KASP (kompetitive allele specific PCR)技術(shù)具有高通量、低成本的優(yōu)點(diǎn), 適用于種子純度檢測(cè)。本研究基于12套雜交種及其父母本的三聯(lián)體樣本及335份玉米雜交種國(guó)家審定標(biāo)準(zhǔn)樣品SNP指紋, 從384個(gè)SNP基礎(chǔ)位點(diǎn)篩選獲得60個(gè)候選位點(diǎn), 位點(diǎn)轉(zhuǎn)化為KASP引物的成功率為95%。綜合考慮引物雙親互補(bǔ)率、多態(tài)性、穩(wěn)定性和分型效果等多項(xiàng)指標(biāo), 最終確定20個(gè)引物作為玉米雜交種純度鑒定的核心引物, 能夠有效鑒定99.7%供試樣品純度。對(duì)于待測(cè)樣品京科968通過(guò)SNP-DNA指紋數(shù)據(jù)庫(kù)查詢, 并選擇雙親互補(bǔ)型引物進(jìn)行純度鑒定。在檢測(cè)的110個(gè)個(gè)體中, 共檢出1個(gè)自交苗和2個(gè)異型株, 純度為97.3%。同時(shí), 基于純度核心引物對(duì)批量樣品檢測(cè)建立高通量純度檢測(cè)方案, 具有快捷、準(zhǔn)確、高通量和低成本的特點(diǎn), 為政府監(jiān)管和企業(yè)提供了更多純度鑒定方案的選擇。

純度; SNP; KASP; 玉米雜交種; 核心引物

玉米(L.)是世界上最早且最充分利用雜種優(yōu)勢(shì)進(jìn)行生產(chǎn)的作物, 國(guó)內(nèi)目前90%以上的玉米生產(chǎn)用種是單交種[1]。雜交種的純度高低是影響田間產(chǎn)量、產(chǎn)品品質(zhì)以及農(nóng)民收益的關(guān)鍵因素之一[2]。因此, 玉米雜交種純度鑒定是把控玉米種子質(zhì)量的重要手段, 尤其是對(duì)于雜交種中自交株的檢測(cè), 在企業(yè)質(zhì)量自控、政府市場(chǎng)監(jiān)測(cè)等多個(gè)環(huán)節(jié)提供重要依據(jù)。當(dāng)前常用于玉米雜交種純度鑒定的方法為田間小區(qū)種植鑒定法[3]、鹽溶蛋白法[4]以及SSR (simple sequence repeats)標(biāo)記法[5-6]等。但以上3種方法都存在一些不足, 田間小區(qū)種植鑒定周期長(zhǎng)且結(jié)果易受環(huán)境和人員判斷影響; 鹽溶蛋白法在某些品種上找不到雙親差異或無(wú)法區(qū)分自交苗, 不能鑒定所有品種; SSR分子標(biāo)記等鑒定法無(wú)法滿足樣本高通量的檢測(cè)需求, 尤其是制種到市場(chǎng)銷(xiāo)售期間短期大量品種純度鑒定的需求[7]。因此探索出一套高效準(zhǔn)確且適用于市場(chǎng)上絕大多數(shù)的玉米雜交種純度鑒定方案具有重要意義。

近年來(lái), 隨著分子標(biāo)記的快速發(fā)展, 第三代分子標(biāo)記,即SNP (single nucleotide polymorphism)標(biāo)記, 因其數(shù)量多、集成高、可微型化及自動(dòng)化程度高等優(yōu)勢(shì), 廣泛應(yīng)用于種質(zhì)資源研究、品種身份鑒定、分子輔助育種(marker-assisted selection, MAS)等[8-11]領(lǐng)域。SNP檢測(cè)方法眾多, 包括水解探針?lè)?、高密度基因芯片以及?jìng)爭(zhēng)性等位基因特異性PCR法(kompetitive allele-specific PCR, KASP)等[12-14]。其中KASP平臺(tái)由于具有高效、低成本的特性, 目前已開(kāi)發(fā)大麥[15]、棉花[16]等作物的純度鑒定標(biāo)記。本研究依據(jù)建成的國(guó)家審定玉米品種指紋數(shù)據(jù)[17], 選擇60個(gè)SNP位點(diǎn)作為候選位點(diǎn)設(shè)計(jì)合成KASP引物, 以不同地區(qū)代表性品種為材料, 結(jié)合快速DNA提取法、高通量檢測(cè)平臺(tái)以及數(shù)據(jù)自動(dòng)分析等篩選位點(diǎn)分型效果, 確定一套適用于玉米雜交種純度鑒定的SNP核心引物組合, 形成基于KASP技術(shù)的玉米品種純度鑒定檢測(cè)體系, 并建立玉米純度鑒定高通量檢測(cè)方案。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試材料包括12組玉米雜交種及其親本組成的三聯(lián)體樣品(表1), 用于測(cè)試KASP引物設(shè)計(jì)是否成功, 是否符合親子關(guān)系以及快提法DNA的分型效果; 335份1984—2013年國(guó)家審定玉米雜交種標(biāo)準(zhǔn)樣品[17], 用于構(gòu)建SNP指紋數(shù)據(jù)并篩選候選位點(diǎn); 市場(chǎng)購(gòu)買(mǎi)玉米雜交種京科968種子若干及本實(shí)驗(yàn)室收集母本京724、父本京92, 用于純度測(cè)試。

1.2 DNA提取

采用改良CTAB法混株提取建庫(kù)樣品及參照樣品DNA, 并用1%瓊脂糖凝膠電泳及Nanodrop 2000檢測(cè)DNA濃度及質(zhì)量, 統(tǒng)一稀釋到20 ng μL–1備用, 每份樣品2個(gè)重復(fù)。純度檢測(cè)采用改良DNA快提法(K-Mate DNA提取試劑盒, LGC Genomic)單株提取。

1.3 SNP純度候選位點(diǎn)及引物設(shè)計(jì)

根據(jù)335份國(guó)家審定玉米雜交種標(biāo)準(zhǔn)樣品的SNP指紋數(shù)據(jù)[17]統(tǒng)計(jì)384基礎(chǔ)位點(diǎn)的雙親互補(bǔ)率、最小等位基因頻率(minimum allele frequency, MAF)、多態(tài)性信息含量(polymorphic information content, PIC)等參數(shù), 挑選出在染色體上分布均勻, 多態(tài)性好的60個(gè)位點(diǎn)作為純度候選位點(diǎn), 并設(shè)計(jì)合成KASP引物(表2) (LGC Genomic, 英國(guó)), 在2條正向引物序列的5′端加上FAM或HEX熒光基團(tuán)的接頭序列[18], 并按照上游引物12 μmol L–1, 下游引物30 μmol L–1混合制備成引物工作液備用。

表1 玉米三聯(lián)體樣品信息表

(續(xù)表2)

(續(xù)表2)

1.4 PCR體系與程序

反應(yīng)體系: 1.5 μL DNA (烘干), 0.5 μL 2×KASP PCR預(yù)混液(LGC Genomic, 1536格式, 標(biāo)準(zhǔn)含量ROX, 英國(guó)), 0.486 μL去離子水, 0.014 μL引物工作液。反應(yīng)程序: 61~55℃梯度循環(huán)程序: 第1步: 94℃ 15 min, 94℃ 20 s, 第2步: 61~55℃10個(gè)循環(huán), 每循環(huán)遞減0.6℃, 第3步: 94℃ 20 s, 55℃ 60 s, 26個(gè)循環(huán), 在高通量水浴鍋PCR儀(Hydrocycler 64, LGC Genomic)上進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。

1.5 熒光檢測(cè)及基因型數(shù)據(jù)采集

利用Pherastar熒光掃描儀采集原始熒光信號(hào), 利用Kraken (V16.3.16.16288)軟件進(jìn)行基因分型, 將分型結(jié)果導(dǎo)入SNP-DNA數(shù)據(jù)庫(kù)管理系統(tǒng)(V1.0.0, 軟件登記號(hào): 2018SR043088, 北京市農(nóng)林科學(xué)院玉米研究中心研發(fā))分析待測(cè)樣品純度。

1.6 數(shù)據(jù)分析

使用SNP比對(duì)統(tǒng)計(jì)工具軟件(V1.0, 軟件登記號(hào): 2018SR026743, 北京市農(nóng)林科學(xué)院玉米研究中心研發(fā))計(jì)算引物雙親互補(bǔ)率、MAF和PIC等參數(shù)。引物雙親互補(bǔ)率為該引物具有雙親互補(bǔ)基因型的品種數(shù)與總品種數(shù)的百分比, 樣品雙親互補(bǔ)基因型比率為該樣品上具有雙親互補(bǔ)基因型的引物數(shù)與總引物數(shù)的百分比。待測(cè)樣品純度計(jì)算為正常個(gè)體數(shù)目(待測(cè)樣品總數(shù)減去非典型個(gè)體數(shù)目)與待測(cè)樣品總數(shù)的百分比。

2 結(jié)果與分析

2.1 適于玉米雜交種純度鑒定核心引物的篩選與確定

基于玉米384個(gè)SNP基礎(chǔ)位點(diǎn), 根據(jù)位點(diǎn)雙親互補(bǔ)區(qū)分能力、試驗(yàn)分型效果、染色體均勻分布等條件篩選確定1套適于玉米雜交種純度鑒定的核心引物組合。具體篩選過(guò)程為: (1) 確定候選位點(diǎn)組合: 基于335份國(guó)審品種基礎(chǔ)位點(diǎn)的指紋數(shù)據(jù)計(jì)算位點(diǎn)雙親互補(bǔ)率、多態(tài)性等參數(shù), 基礎(chǔ)位點(diǎn)雙親互補(bǔ)率介于24.2%~65.6%之間, MAF值介于0.32~0.50之間, PIC值介于0.34~0.38之間。候選位點(diǎn)的篩選條件為位點(diǎn)雙親互補(bǔ)率高于40%, MAF≥0.33, PIC≥0.35, 從而優(yōu)選60個(gè)候選位點(diǎn)。(2) KASP引物評(píng)估: 將候選位點(diǎn)設(shè)計(jì)合成KASP引物, 使用12組玉米雜交種及其親本三聯(lián)體材料進(jìn)行測(cè)試。其中57個(gè)引物都能分成緊密的三群, 分型結(jié)果與預(yù)期結(jié)果一致, 符合孟德?tīng)栠z傳定律, 并且試驗(yàn)重復(fù)結(jié)果一致(圖1-A); 3個(gè)引物不能正常分型或與預(yù)期結(jié)果不一致或擴(kuò)增失敗(圖1-C, F), 從芯片位點(diǎn)轉(zhuǎn)化為KASP引物的成功率為95%。(3) 快速DNA提取法評(píng)估: 為縮短DNA制備時(shí)間, 提高純度鑒定效率, 進(jìn)一步使用快提法對(duì)CTAB法分型表現(xiàn)好的位點(diǎn)進(jìn)行測(cè)試, 選擇CTAB法和快提法均能清晰的分成3個(gè)緊密的分型, 且與預(yù)期分型結(jié)果一致的位點(diǎn)(圖1-D), 共有48個(gè)位點(diǎn)進(jìn)入下一步的位點(diǎn)篩選; 9個(gè)引物使用CTAB法能夠正常分型, 但使用快提法無(wú)法正常分型(圖1-B, E), 不再進(jìn)行純度核心引物篩選。(4) 確定純度鑒定核心引物: 綜合位點(diǎn)區(qū)分能力及染色體均勻分布等, 篩選出20個(gè)KASP引物作為純度鑒定核心引物(表3)。

A, B, C, F為CTAB法分型效果; D, E為快提法分型效果。A, D為引物MG279, 在CTAB法和快提法均具有清晰、緊密的分型效果; B, E為引物MG304, 該位點(diǎn)使用CTAB法能夠正常分型, 但快提法無(wú)法正常分型; C為引物MG262, KASP引物分型效果為單態(tài); F為引物MG067, 分型效果較散且數(shù)據(jù)缺失率較高。圖中每1個(gè)點(diǎn)代表1個(gè)反應(yīng)孔的結(jié)果, 其中藍(lán)色和紅色點(diǎn)分別代表2種純合基因型, 綠色點(diǎn)代表雙親互補(bǔ)基因型, 粉色點(diǎn)代表未采集基因分型, 黑色點(diǎn)代表空白對(duì)照。

A, B, C, and F are the genotyping of CTAB method; D and E are the genotyping of fast extraction method. A and D are primer MG279, which have clear and close genotyping effect both by CTAB method and rapid extraction method; B and E are primer MG304, which has normal genotyping by CTAB method, but abnormal genotyping by rapid extraction method; C is primer MG262, of which KASP primer genotyping effect is monomorphic; F is primer MG067, of which KASP primer genotyping effect is wide and has high missing data rate. Each point represents the result of one reaction well, of which blue and red points represent two homozygous genotype, green points represent parental complementary genotype, pink points represent unused genotype and black points represent non-template control.

表3 玉米雜交種純度鑒定SNP核心引物信息表

MAF: minimum allele frequency; PIC: polymorphic information content.

2.2 適于玉米雜交種純度鑒定核心引物的特征分析

由于在進(jìn)行純度引物篩選時(shí), 我們更加關(guān)注雙親互補(bǔ)引物, 因此在純度鑒定核心引物篩選過(guò)程中雙親互補(bǔ)率是重要指標(biāo)之一。篩選的20個(gè)核心引物的雙親互補(bǔ)率介于46.9%~65.6%之間, 平均雙親互補(bǔ)率為55.2%, 相比較于基礎(chǔ)位點(diǎn)和候選位點(diǎn)的平均雙親互補(bǔ)率46.4%和53.8%, 核心引物的平均雙親互補(bǔ)率有所提高。83.6%的樣品雙親互補(bǔ)基因型比率在核心引物上高于基礎(chǔ)位點(diǎn)(圖2-A)。核心引物MAF值介于0.33~0.50之間, 平均值為0.43, PIC值介于0.35~0.38之間, 平均值為0.37, 與基礎(chǔ)位點(diǎn)相比均有所提高。

在335份雜交種樣品中, 99.7%樣品的雙親互補(bǔ)基因型比率超過(guò)10%, 多個(gè)雙親互補(bǔ)引物可供篩選用于純度鑒定(圖2-B)。綜合各項(xiàng)參數(shù)說(shuō)明, 20個(gè)純度鑒定核心引物均明顯優(yōu)于基礎(chǔ)位點(diǎn)和候選位點(diǎn), 也證明這20個(gè)核心引物能夠有效應(yīng)用于目前國(guó)內(nèi)市場(chǎng)絕大部分玉米雜交種的純度鑒定。

2.3 玉米SNP核心引物純度鑒定實(shí)例及高通量檢測(cè)方案的建立

使用SNP純度鑒定核心引物對(duì)待測(cè)樣品京科968進(jìn)行純度鑒定, 通過(guò)SNP-DNA指紋數(shù)據(jù)庫(kù)查詢?cè)?0個(gè)核心引物中有15個(gè)顯示為雙親互補(bǔ)型, 從中隨機(jī)選擇MG072、MG135、MG175和MG215等4個(gè)引物進(jìn)行純度鑒定。試驗(yàn)放置的母本和父本自交系分型均與預(yù)期一致,空白對(duì)照未檢測(cè)到明顯增加的熒光信號(hào), 說(shuō)明各引物擴(kuò)增正常, 本次試驗(yàn)結(jié)果可信(圖3)。在檢測(cè)的110個(gè)個(gè)體中, 綜合4個(gè)引物的分型結(jié)果判定, 共檢出1個(gè)自交苗和2個(gè)異型株, 純度為97.3%。根據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定, 玉米單交種的純度不低于96.0%, 試驗(yàn)結(jié)果表明該供試樣品純度符合標(biāo)準(zhǔn)。

在實(shí)際純度檢測(cè)過(guò)程中, 純度待測(cè)樣品情況是比較復(fù)雜的, 如是否提供樣品信息、是否為批量樣品、是否存在樣品一致性問(wèn)題等, 因此純度檢測(cè)試驗(yàn)設(shè)計(jì)不能使用固定模式。基于玉米純度鑒定核心引物對(duì)批量樣品純度檢測(cè), 建立高通量純度檢測(cè)方案。當(dāng)樣品信息已知, 可通過(guò)玉米SNP-DNA指紋數(shù)據(jù)庫(kù)查詢雙親互補(bǔ)引物, 優(yōu)先選擇純度核心引物進(jìn)行檢測(cè)。當(dāng)樣品信息未知, 可以選擇純度核心引物快速建立批量樣品指紋, 并找到雙親互補(bǔ)引物進(jìn)行檢測(cè)。其中雙親互補(bǔ)引物用于快速準(zhǔn)確鑒定自交苗, 對(duì)于遺傳不穩(wěn)定的位點(diǎn), 由于其仍處于分離狀態(tài), 不應(yīng)計(jì)入樣品純度統(tǒng)計(jì)。在試驗(yàn)流程上, 通過(guò)快速DNA提取法、高通量擴(kuò)增、自動(dòng)化掃描讀取數(shù)據(jù)和數(shù)據(jù)庫(kù)管理系統(tǒng)批量計(jì)算樣品純度等環(huán)節(jié)的有機(jī)結(jié)合, 共同實(shí)現(xiàn)批量樣品高通量純度檢測(cè)。

A為樣品雙親互補(bǔ)基因型比率比較圖, 橫坐標(biāo)為按照核心引物的樣品雙親互補(bǔ)基因型比率從低到高的樣品排序, 縱坐標(biāo)為樣品雙親互補(bǔ)基因型比率; B為樣品雙親互補(bǔ)基因型比率柱狀統(tǒng)計(jì)圖, 柱狀圖表示樣品雙親互補(bǔ)基因型比率每增加10%區(qū)間的樣品數(shù)。

A is the comparison chart of parental complementary genotype rate of sample between three loci set, of which the abscissa is the parental complementary genotype rate of sample sorted from low to high according to the core primes and the ordinate is the parental complementary genotype rate of sample; B is the histogram of the parental complementary genotype rate of sample, of which the histogram shows the number of samples for each 10% rise in parental complementary.

圖中每1個(gè)點(diǎn)代表1個(gè)單株的檢測(cè)結(jié)果, 其中藍(lán)色和紅色點(diǎn)分別代表2種純合基因型, 綠色點(diǎn)代表雙親互補(bǔ)基因型, 黑色點(diǎn)代表空白對(duì)照, 三角形點(diǎn)代表親本自交系樣品。

Each point represents the result of single seed, of which blue and red points represent two homozygous genotype, green points represent parental complementary genotype, black points represent non-template control and triangle points represent parental inbred lines samples.

3 討論

3.1 KASP技術(shù)應(yīng)用于玉米純度鑒定的優(yōu)勢(shì)

玉米雜交種純度鑒定應(yīng)達(dá)到快捷、準(zhǔn)確、高通量和低成本的要求。本研究在檢測(cè)方法中選擇適于高通量樣品檢測(cè)平臺(tái)KASP技術(shù)結(jié)合快速DNA提取法, 在技術(shù)方案上具有以下優(yōu)點(diǎn)。

第一, 試驗(yàn)步驟快速簡(jiǎn)便, 易實(shí)現(xiàn)高通量自動(dòng)化。KASP技術(shù)是目前應(yīng)用SNP檢測(cè)技術(shù)中試驗(yàn)步驟最簡(jiǎn)單的方法之一, 僅需要DNA提取、PCR擴(kuò)增和數(shù)據(jù)采集3個(gè)環(huán)節(jié)。由于純度樣品需要對(duì)每個(gè)單株樣品進(jìn)行檢測(cè), 常規(guī)的DNA提取方法會(huì)造成時(shí)間和試驗(yàn)成本增加, 使用快速DNA提取法是純度快速檢測(cè)的前提。整體試驗(yàn)操作結(jié)合自動(dòng)化工作站、高通量水浴和孔板熒光掃描儀等儀器能大幅提高檢測(cè)效率, 目前最高配置的SNPLine平臺(tái)每輪試驗(yàn)檢測(cè)的最高通量超過(guò)8萬(wàn)個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn), 如使用Arraytape平臺(tái)可進(jìn)一步提高檢測(cè)通量。數(shù)據(jù)采集與統(tǒng)計(jì)利用軟件自動(dòng)化分析, 進(jìn)一步提高數(shù)據(jù)采集的效率, 也減少人工讀取數(shù)據(jù)誤差的可能。當(dāng)純度檢測(cè)樣品量超過(guò)一定范圍, 水浴PCR系統(tǒng)具有明顯優(yōu)勢(shì)。假設(shè)有100份樣品集中檢測(cè)純度, 每個(gè)樣品檢測(cè)100個(gè)單株, KASP平臺(tái)使用4個(gè)位點(diǎn)檢測(cè), 總數(shù)據(jù)點(diǎn)為4萬(wàn)個(gè), 僅需要一輪擴(kuò)增即可完成, 擴(kuò)增后進(jìn)行全部熒光掃描時(shí)間約1 h; 使用熒光毛細(xì)管平臺(tái)檢測(cè), 需選擇適合的引物組合多重?cái)U(kuò)增并使用384 PCR儀擴(kuò)增, 使用96通道毛細(xì)管電泳儀掃描, 需要25塊PCR板和100塊電泳板, 每塊電泳板按照30 min掃描完成, 需要50 h即可完成電泳檢測(cè)。與熒光毛細(xì)管平臺(tái)相比, KASP平臺(tái)通過(guò)使用高通量?jī)x器大大縮短了擴(kuò)增和檢測(cè)時(shí)間; 通過(guò)自動(dòng)化數(shù)據(jù)分型讀取, 減少了數(shù)據(jù)人工分析時(shí)間。

第二, 試驗(yàn)對(duì)于DNA質(zhì)量容忍度高, 取樣部位限制少。DNA質(zhì)量是影響篩選標(biāo)記的是否好用的重要因素, 標(biāo)記分型結(jié)果進(jìn)一步影響自動(dòng)化采集數(shù)據(jù)的效率。使用快速DNA提取法尤其考驗(yàn)測(cè)試位點(diǎn)對(duì)DNA質(zhì)量的容忍度, 主要原因包括DNA拷貝數(shù)不如常規(guī)方法多, 上清液中含有雜質(zhì)或PCR抑制劑, 獲得的DNA鏈有可能存在降解斷裂等[19-21]。在本研究測(cè)試的位點(diǎn)中, 有84.2%的位點(diǎn)在CTAB法和粗提法中均能夠具有清晰穩(wěn)定的3個(gè)基因型, 說(shuō)明KASP技術(shù)大部分引物對(duì)于核酸質(zhì)量及數(shù)量要求很低。原因主要是KASP上下游引物被設(shè)計(jì)在緊貼著SNP變異位點(diǎn)的幾個(gè)堿基對(duì)范圍內(nèi), 整體擴(kuò)增產(chǎn)物為100 bp左右, 而且KASP引物在上游引物的5'端連接通用尾巴序列, 在擴(kuò)增中與體系中的互補(bǔ)序列結(jié)合增加熒光基團(tuán), 在擴(kuò)增循環(huán)中形成“完美擴(kuò)增”。因此, 當(dāng)DNA降解斷裂等情況發(fā)生時(shí), 與長(zhǎng)目標(biāo)片段相比, 這種設(shè)計(jì)使目標(biāo)片段正常擴(kuò)增的可能性增加?！巴昝罃U(kuò)增”使得模板DNA加入的拷貝數(shù)很少, 也可實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增。使用本文測(cè)試的快速DNA提取方法, 對(duì)于待測(cè)樣品的取樣部位要求限制少, 已經(jīng)測(cè)試的部位, 包括玉米籽粒、幼苗及田間葉片等, 均取得了良好、穩(wěn)定的分型效果。在實(shí)際應(yīng)用中可以在種子生產(chǎn)和田間鑒定等多個(gè)場(chǎng)景中進(jìn)行純度檢測(cè)。

第三, 檢測(cè)儀器兼容性高, 檢測(cè)成本低。使用KASP技術(shù)不僅可以選擇高通量檢測(cè)儀器, 還可以跟據(jù)常規(guī)檢測(cè)樣品通量和實(shí)驗(yàn)室已有儀器靈活選擇適宜的儀器。擴(kuò)增及熒光掃描儀器均選擇廣泛, 擴(kuò)增儀器不僅可以使用水浴PCR儀, 還可以使用金屬浴PCR儀, 也可以使用平板PCR儀等。熒光掃描既可以使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀終點(diǎn)法讀數(shù), 也可以使用能夠檢測(cè)FAM和HEX/VIC熒光通道的酶標(biāo)儀等。同時(shí)此類(lèi)儀器維護(hù)成本也較低, 與電泳設(shè)備相比, 免去沖洗、換膠等周期性維護(hù)工作。KASP體系單個(gè)反應(yīng)的檢測(cè)成本低于1元, 具體成本取決于所選擇的反應(yīng)體系、檢測(cè)樣品量和檢測(cè)試劑耗材等。當(dāng)檢測(cè)樣本量增加時(shí), 通過(guò)減少反應(yīng)體積, 增加單位面積的檢測(cè)數(shù)據(jù)量, 使檢測(cè)成本大幅下降[11]。

3.2 兼容多平臺(tái)的SNP位點(diǎn)的轉(zhuǎn)化和應(yīng)用

基于SNP標(biāo)記對(duì)于親本與子代差異的可識(shí)別性、不受環(huán)境影響特性以及試驗(yàn)結(jié)果可靠性。盡管玉米基因組中存在大量SNP位點(diǎn), 但可供選擇具有多態(tài)性、穩(wěn)定和兼容多平臺(tái)的SNP位點(diǎn)仍然只占少數(shù)[22], 因此位點(diǎn)篩選中各個(gè)評(píng)價(jià)指標(biāo)非常重要, 決定了所選標(biāo)記是否具有大規(guī)模應(yīng)用的潛力。隨著生物技術(shù)和生物信息學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展, 挖掘轉(zhuǎn)化SNP變異位點(diǎn)的方法包括從公共數(shù)據(jù)庫(kù)中挖掘已有SNP位點(diǎn)并進(jìn)行驗(yàn)證, 在不同平臺(tái)間轉(zhuǎn)化已有SNP位點(diǎn)以及通過(guò)重測(cè)序技術(shù)挖掘新的SNP位點(diǎn)等[16,18]。本文采用將已有商業(yè)化芯片SNP位點(diǎn)轉(zhuǎn)化為KASP引物的策略, 并在KASP平臺(tái)進(jìn)一步篩選評(píng)估獲得純度核心引物。其中, 多態(tài)性和雙親互補(bǔ)率參數(shù)、是否為單拷貝和是否緊密分型等已通過(guò)芯片平臺(tái)驗(yàn)證, 開(kāi)發(fā)KASP標(biāo)記主要考慮引物雙親互補(bǔ)率、是否與預(yù)期結(jié)果一致以及試驗(yàn)分型效果等信息。這種策略在第二階段篩選過(guò)程中避免了稀有變異、多拷貝、單拷貝和偏分離等問(wèn)題, 位點(diǎn)轉(zhuǎn)化成功率較高, 多平臺(tái)間的結(jié)果可以有效相互驗(yàn)證, 保證了標(biāo)記分型結(jié)果的準(zhǔn)確性。

基于SNP多平臺(tái)兼容性的特點(diǎn), 我們可以更加靈活的制定檢測(cè)方案, 將具有不同特點(diǎn)的平臺(tái)結(jié)合使用—使用位點(diǎn)高通量的芯片平臺(tái)構(gòu)建樣品SNP指紋數(shù)據(jù)庫(kù), 通過(guò)轉(zhuǎn)化等位基因命名建立共享樣品指紋數(shù)據(jù)庫(kù), 并獲得其純度核心引物指紋圖譜。在數(shù)據(jù)庫(kù)中查詢確定雙親互補(bǔ)引物進(jìn)行純度鑒定, 利用KASP平臺(tái)建立樣本高通量的快速檢測(cè)方案。其中, 純度SNP核心引物應(yīng)包含于真實(shí)性SNP核心引物, 既具有真實(shí)性核心引物的高區(qū)分能力, 同時(shí)可以保證建庫(kù)指紋中包含了純度核心引物, 可以同步采集純度核心引物指紋數(shù)據(jù)。通過(guò)有機(jī)結(jié)合多個(gè)檢測(cè)平臺(tái), 發(fā)揮不同技術(shù)平臺(tái)的優(yōu)勢(shì), 建立合理的檢測(cè)方案。

3.3 農(nóng)作物品種純度檢測(cè)技術(shù)發(fā)展展望

農(nóng)作物品種純度對(duì)于農(nóng)作物生產(chǎn)具有重要的意義, 純度檢驗(yàn)主要包括2種類(lèi)型和對(duì)象, 生產(chǎn)企業(yè)對(duì)于品種純度摸底能夠及時(shí)掌握不同批次種子純度, 利于企業(yè)質(zhì)量?jī)?nèi)控; 而政府抽檢能監(jiān)控市場(chǎng)流通種子質(zhì)量, 利于政府宏觀指導(dǎo)。因此, 純度檢測(cè)業(yè)務(wù)具有多元性和兼容性的特點(diǎn), 在長(zhǎng)期狀態(tài)下應(yīng)有多種方案并存, 可根據(jù)實(shí)際情況選擇具體檢測(cè)方案。從方案選擇來(lái)看, 傳統(tǒng)的田間鑒定能夠有效觀察品種在不同生長(zhǎng)時(shí)期的表型變化; 蛋白檢測(cè)具有檢測(cè)流程簡(jiǎn)便、成本低特點(diǎn); 分子標(biāo)記檢測(cè)能夠有效識(shí)別自交苗, 不受生產(chǎn)季節(jié)的影響, 區(qū)分能力更高[23]。從分子標(biāo)記類(lèi)型來(lái)看, 二態(tài)性標(biāo)記由于易實(shí)現(xiàn)數(shù)據(jù)采集和整合, 能夠大幅提高檢測(cè)效率、降低檢測(cè)成本[24], 而多態(tài)性標(biāo)記雙親互補(bǔ)率較高, 更容易獲得雙親互補(bǔ)引物。進(jìn)而引申到檢測(cè)平臺(tái)的選擇上, 以熒光顏色為基礎(chǔ)的二態(tài)性檢測(cè)平臺(tái)具有大幅增加樣品檢測(cè)能力的可能性, 因此更適合批量樣品; 以長(zhǎng)度多態(tài)為基礎(chǔ)的電泳檢測(cè)平臺(tái)可以將引物組合成多重反應(yīng)也能提高檢測(cè)效率, 降低檢測(cè)成本。隨著檢測(cè)技術(shù)的不斷發(fā)展, 未來(lái)準(zhǔn)確、穩(wěn)定、簡(jiǎn)便和快捷的純度鑒定方案將不斷涌現(xiàn)并廣泛服務(wù)于種業(yè), 為政府監(jiān)管和企業(yè)提供了更多純度鑒定方案的選擇。

[1] 李少昆, 王崇桃. 中國(guó)玉米生產(chǎn)技術(shù)的演變與發(fā)展. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué), 2009, 42: 1941–1951. Li S K, Wang C T. Evolution and development of maize production techniques in China., 2009, 42: 1941–1951 (in Chinese with English abstract).

[2] 李陽(yáng), 范夢(mèng)偉, 季曉坤, 賈相初, 吳彬, 趙自仙, 王德海. 利用SSR技術(shù)鑒定玉米雜交種“家佳榮2號(hào)”的種子純度. 西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2018, 31: 1349–1354. Li Y, Fan M W, Ji X K, Jia X C, Wu B, Zhao Z X, Wang D H. Seed purity identification for maize hybrid ‘Jiajiarong No.2’ by SSR marker technique., 2018, 31: 1349–1354 (in Chinese with English abstract).

[3] 蓋樹(shù)鵬. 玉米品種純度SSR鑒定與田間鑒定的相關(guān)性. 華北農(nóng)學(xué)報(bào), 2010, 25(增刊1): 28–31. Gai S P. The relativity between SSR method and field test in the hybrids purity identification of maize.-, 2010, 25(S1): 28–31 (in Chinese with English abstract).

[4] 王波, 彭宏, 羅緒標(biāo), 郭玲. 鹽溶蛋白電泳和SSR標(biāo)記鑒定蘇玉20種子純度的比較研究. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué), 2016, 44(3): 72–74.Wang B, Peng H, Luo X B, Guo L. Comparative study on identification of Suyu 20 seed purity by salt-soluble protein electrophoresis and SSR markers., 2016, 44(3): 72–74 (in Chinese).

[5] 王鳳格, 趙久然, 王璐, 易紅梅, 郭景倫, 戴景瑞, 原亞萍, 盧柏山, 楊國(guó)航. 適于玉米雜交種純度鑒定的SSR核心引物的確定. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào), 2007, 15: 964–969. Wang F G, Zhao J R, Wang L, Yi H M, Guo J L, Dai J R, Yuan Y P, Lu B S, Yang G H. Determination of SSR core primers for maize hybrid purity identification., 2007, 15: 964–969 (in Chinese with English abstract).

[6] 王鳳格, 趙久然, 郭景倫, 佘花娣, 陳剛. 比較三種DNA指紋分析方法在玉米品種純度及真?zhèn)舞b定中的應(yīng)用. 分子植物育種, 2003, 1: 655–661. Wang F G, Zhao J R, Guo J L, She H D, Chen G. Comparison of three DNA fingerprint analyzing methods for maize cultivars’ identification., 2003, 1: 655–661 (in Chinese with English abstract).

[7] 王鳳格, 易紅梅, 趙久然. 玉米純度分子鑒定標(biāo)準(zhǔn)研制相關(guān)問(wèn)題的探討. 玉米科學(xué), 2015, 23(4): 48–53. Wang F G, Yi H M, Zhao J R. Discussion about the purity of maize standard molecular identification development., 2015, 23(4): 48–53 (in Chinese with English abstract).

[8] 吳金鳳, 宋偉, 王蕊, 田紅麗, 李雪, 王鳳格, 趙久然, 蔚榮海. 利用SNP標(biāo)記對(duì)51份玉米自交系進(jìn)行類(lèi)群劃分. 玉米科學(xué), 2014, 22(5): 29–34. Wu J F, Song W, Wang R, Tian H L, Li X, Wang F G, Zhao J R, Wei R H. Heterotic grouping of 51 maize inbred lines by SNP markers., 2014, 22(5): 29–34 (in Chinese with English abstract).

[9] Tian H L, Wang F G, Zhao J R, Yi H M, Wang L, Wang R, Yang Y, Song W. Development of maizeSNP3072, a high-throughput compatible SNP array, for DNA fingerprinting identification of Chinese maize varieties., 2015, 35: 136.

[10] Sun Q, Wang P, Li W L, Li W C, Lu S P, Yu Y L, Zhao M, Meng Z D. Genomic selection on shelling percentage and other traits for maize., 2019, 69: 266–271.

[11] Semagn K, Babu R, Hearne S, Olsen M. Single nucleotide polymorphism genotyping using Kompetitive Allele Specific PCR (KASP): overview of the technology and its application in crop improvement., 2014, 33: 1–14.

[12] De La Vega F A, Lazaruk K D, Rhodes M D, Wenz M H. Assessment of two flexible and compatible SNP genotyping platforms: TaqMan SNP genotyping assays and the SNPlex genotyping system., 2005, 573: 111–135.

[13] Cheng X, Ren Y H, Jian Y Q, Guo Z F, Zhang Y, Xie C X, Fu J J, Wang H W, Wang G Y, Xu Y B, Li P, Zou C. Development of a maize 55K SNP array with improved genome coverage for molecular breeding., 2017, 37: 20.

[14] Yang G L, Chen S P, Chen L K, Sun K, Huang C H, Zhou D H, Huang Y T, Wang J F, Liu Y Z, Wang H, Chen Z Q, Guo T. Development of a core SNP arrays based on the KASP method for molecular breeding of rice., 2019, 12: 21.

[15] 蔣培基, 王德良, 徐東東, 黃承雪, 郭剛剛, 欒春光, 蒲彪. 基于競(jìng)爭(zhēng)性等位基因特異性PCR技術(shù)的麥芽品種純度定性和定量檢測(cè). 食品科學(xué), 2018, 39: 322–326. Jiang P J, Wang D L, Xu D D, Huang C X, Guo G G, Luan C G, Pu B. Kompetitive allele specific PCR (KASP) for the qualification and quantification of malt varieties., 2018, 39: 322–326 (in Chinese with English abstract).

[16] 匡猛, 王延琴, 周大云, 馬磊, 方丹, 徐雙嬌, 楊偉華, 魏守軍, 馬峙英. 基于單拷貝SNP標(biāo)記的棉花雜交種純度高通量檢測(cè)技術(shù). 棉花學(xué)報(bào), 2016, 28: 227–233.Kuang M, Wang Y Q, Zhou D Y, Ma L, Fang D, Xu S J, Yang W H, Wei S J, Ma Z Y. High-throughput detection technology for purity of cotton hybrids based on single copy SNP markers., 2016, 28: 227–233 (in Chinese with English abstract).

[17] 田紅麗, 楊揚(yáng), 王璐, 王蕊, 易紅梅, 許理文, 張?jiān)讫? 葛建镕, 王鳳格, 趙久然. 兼容型maize SNP 384標(biāo)記篩選與玉米雜交種DNA指紋圖譜構(gòu)建. 作物學(xué)報(bào), 2020, 46: 1006–1015. Tian H L, Yang Y, Wang L, Wang R, Yi H M, Xu L W, Zhang Y L, Ge J R, Wang F G, Zhao J R. Screening of compatible maize SNP384 markers and the construction of DNA fingerprints of maize varieties., 2020, 46: 1006–1015 (in Chinese with English abstract).

[18] Rasheed A, Wen W E, Gao F M, Zhai S N, Jin H, Liu J D, Guo Q, Zhang Y J, Susanne D, Xia X C, He Z H. Development and validation of KASP assays for genes underpinning key economic traits in bread wheat., 2016, 129: 1843–1860.

[19] Collard B C Y, Das A, Virk P S, Mackill D J. Evaluation of ‘quick and dirty’ DNA extraction methods for marker-assisted selection in rice (L.)., 2007, 126: 47–50.

[20] Xalxo S M, Saxena R R, Pali V, Kurrey L N, Verulkar S B. A rapid and low cost method of DNA isolation for marker assisted selection in rice., 2014, 3: 83–86.

[21] Liang H B, Deng Y, Wang C T, Xu X. A high-throughput DNA extraction method from rice seeds., 2016, 30: 32–35.

[22] Mammadov J, Chen W, Mingus J, Thompson S, Kumpatla S. Development of versatile gene-based SNP assays in maize (L.)., 2012, 29: 779–790.

[23] Jiao J, Jia X R, Liu P, Zhang Q M, Liu F, Ma C D, Xi P Z, Liang Z S. Species identification of polygonatirhizoma in China by both morphological and molecular marker methods., 2018, 341: 102–110.

[24] 劉歡, 張新全, 馬嘯, 張瑞珍, 何光武, 潘玲, 金夢(mèng)雅. 基于熒光檢測(cè)技術(shù)的多花黑麥草EST-SSR指紋圖譜的構(gòu)建. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué), 2017, 50: 437–450. Liu H, Zhang X Q, Ma X, Zhang R Z, He G W, Pan L, Jin M Y. Construction of EST-SSR fingerprint based on fluorescence detection technology for Italian ryegrass., 2017, 50: 437–450 (in Chinese with English abstract).

Identification of SNP core primer and establishment of high throughput detection scheme for purity identification in maize hybrids

WANG Rui1,**, SHI Long-Jian1,2,**, TIAN Hong-Li1, YI Hong-Mei1, YANG Yang1, GE Jian-Rong1, FAN Ya-Ming1, REN Jie1, WANG Lu1, LU Da-Lei2, ZHAO Jiu-Ran1,*, and WANG Feng-Ge1,*

1Maize Research Center, Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences / Beijing Key Laboratory of Maize DNA Fingerprinting and Molecular Breeding, Beijing 100097, China;2Jiangsu Key Laboratory of Crop Genetics and Physiology / Co-Innovation Center for Modern Production Technology of Grain Crops, Yangzhou University, Yangzhou 225009, Jiangsu, China

Purity is one of the most important indexes of maize seed quality, especially for inbred seedlings in hybrids which is a key factor affecting field yield. A new high-throughput and economical technology named KASP (Kompetitive allele specific PCR) is suitable for seed purity detection. This study was based on 12 sets of triplet samples of hybrids with their parents and 335 SNP fingerprint data which was nationally approved as standard samples of maize hybrids. Sixty candidate loci were selected from 384 SNP basic loci, and the success rate of transformation from chip to KASP primers was 95%. Considering comprehensive elements including parental complementary rate, polymorphism and other indicators such as stability and genotyping effect of primers, 20 core primers were finally determined for purity identification of maize hybrids. The results showed these core primers were able to effectively identify the purity of 99.7% of tested samples. The purity of tested sample Jingke 968 was identified by searching SNP-DNA fingerprint database and selecting parental complementary primers. One inbred seedling and two off-types were detected in 110 individuals, and the purity value was 97.3%. Meanwhile, a high-throughput purity detection scheme was established based on the core primers of purity identification for batch samples, which is fast, accurate, high-throughput and low-cost, providing more options of purity identification for government regulatory agencies and enterprises.

purity; SNP; KASP; maize hybrid; core primers

10.3724/SP.J.1006.2021.03031

本研究由“十三五”國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(2017YFD0102001)資助。

This study was supported by the 13th Five-Year National Key Research and Development Program of China (2017YFD0102001).

王鳳格, E-mail: gege0106@163.com, Tel: 86-10-51503558; 趙久然, E-mail: maizezhao@126.com, Tel: 86-10-51503936

**同等貢獻(xiàn)(Contributed equally to this work)

王蕊, E-mail: skywangr@126.com; 施龍建, E-mail: SLJ18752782386@163.com

2020-06-14;

2020-11-19.

URL: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20201119.0925.002.html