小麥谷氨酰胺合成酶同工酶轉(zhuǎn)錄特點(diǎn)及其啟動(dòng)子序列分析

王小純 王露露 張志勇 秦步壇 于美琴 韋一昊 馬新明,*

研究簡(jiǎn)報(bào)

小麥谷氨酰胺合成酶同工酶轉(zhuǎn)錄特點(diǎn)及其啟動(dòng)子序列分析

王小純1,2王露露1張志勇1秦步壇1于美琴2韋一昊1馬新明1,*

1河南糧食作物協(xié)同創(chuàng)新中心 / 河南農(nóng)業(yè)大學(xué), 河南鄭州 450002;2河南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 河南鄭州 450002

谷氨酰胺合成酶是小麥氮同化關(guān)鍵酶, 分為胞液型和質(zhì)體型(TaGS2)兩類(lèi), 其中胞液型TaGS又分為T(mén)aGS1、TaGSr和TaGSe。為了研究異源六倍體小麥A、B、D染色體組TaGS同工酶表達(dá)差異及調(diào)控機(jī)制, 本項(xiàng)目利用三代測(cè)序技術(shù)測(cè)定了TaGS同工酶基因轉(zhuǎn)錄水平, 依據(jù)中國(guó)春基因組序列克隆了豫麥49的12個(gè)TaGS同工酶啟動(dòng)子, 并對(duì)其序列進(jìn)行了分析。結(jié)果表明, TaGS1主要由6B染色體基因轉(zhuǎn)錄, TaGSe和TaGSr主要由4D染色體基因轉(zhuǎn)錄, TaGS2主要由2D染色體基因轉(zhuǎn)錄, 不同TaGS同工酶轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)距起始密碼子ATG的距離不同。啟動(dòng)子元件分析顯示, 6B染色體上的TaGS1啟動(dòng)子有較多W-box、AC-I、ABRE、as-1和茉莉酸甲酯等響應(yīng)元件, 4D染色體上的TaGSe啟動(dòng)子有較多脅迫響應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子(MYB、MBS、LTR等)結(jié)合元件和植物生長(zhǎng)素響應(yīng)元件, 4D染色體上的TaGSr啟動(dòng)子有較多WRE3等轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合元件, 2D染色體上的TaGS2啟動(dòng)子有較多A-box、WRE3、ARE及AT富集區(qū)。不同TaGS同工酶啟動(dòng)子順式元件種類(lèi)、數(shù)目及排列順序均不同, 為進(jìn)一步研究GS同工酶調(diào)控機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

小麥; GS同工酶; 轉(zhuǎn)錄; 啟動(dòng)子; 順式作用元件

氮是植物生長(zhǎng)發(fā)育的必需元素, 在作物產(chǎn)量與品質(zhì)形成過(guò)程中起重要作用。谷氨酰胺合成酶(GS)是植物氮素同化和運(yùn)轉(zhuǎn)的關(guān)鍵酶[1], 根據(jù)亞細(xì)胞定位可分為胞液型(GS1)和質(zhì)體型(GS2)兩類(lèi)[2], 小麥GS1包含GS1.1 (GS1)、GS1.2 (GSr)和GS1.3 (GSe)。GS2參與硝酸還原氨與光呼吸釋放氨同化, GS1參與葉片衰老過(guò)程中氮素的再利用[3], GSr參與根部系氮素同化運(yùn)轉(zhuǎn), GSe參與籽粒發(fā)育過(guò)程中氮素利用[4]。GS活性與小麥籽?？扇苄缘鞍缀考爱a(chǎn)量密切相關(guān)[5-9]。水稻過(guò)表達(dá)GS1基因, 其GS活性及可溶性蛋白含量顯著提高[10], 過(guò)表達(dá)GS2可以增強(qiáng)水稻的光呼吸和光合作用強(qiáng)度, 水稻過(guò)表達(dá)GS2和煙草過(guò)表達(dá)GS2均提高抗鹽能力[11-12]。過(guò)表達(dá)GSr可提高水稻對(duì)鹽、干旱及冷脅迫的敏感性[13]。QTL定位證明GS與小麥產(chǎn)量呈正相關(guān)[6]?？梢?jiàn), GS與植物生長(zhǎng)發(fā)育和抗逆密切相關(guān)。

小麥?zhǔn)钱愒戳扼w, 有A、B、D三個(gè)染色體組, 每組染色體都有一套TaGS同工酶基因, 比如GS1有3個(gè)基因編碼, 即和。以前報(bào)道小麥GSr和GSe只有2個(gè)基因[14], 可能存在未發(fā)現(xiàn)的GSr和GSe同工酶基因。啟動(dòng)子位于基因的5'端非編碼區(qū), 其結(jié)構(gòu)和功能影響基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。Michael等[15]發(fā)現(xiàn)擬南芥GLN1:2啟動(dòng)子在高氮條件下活性更高。擬南芥不同GS啟動(dòng)子存在組織特異性, 與GS同工酶在植物中表達(dá)部位相吻合[16-17]。Gómez-Maldonado等[18]研究發(fā)現(xiàn), 松樹(shù)GS啟動(dòng)子可與MYB轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合提高GS同工酶的表達(dá)量從而調(diào)控體內(nèi)氮代謝。小麥染色體組復(fù)雜, 不同染色體組基因表達(dá)存在差異。董佳敏等[19]發(fā)現(xiàn)A、B、D染色體上的expansin (膨脹素)基因均有表達(dá), 脅迫處理后B染色體上的expansin表達(dá)量最高, D染色體表達(dá)量最低, 可見(jiàn)不同染色體上的啟動(dòng)子調(diào)控方式不同。

有關(guān)植物GS功能及分布等研究報(bào)道較多, 但對(duì)GS啟動(dòng)子研究相對(duì)較少, 小麥GS啟動(dòng)子研究至今尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究依據(jù)中國(guó)春基因組序列, 在A(yíng)、B、D染色體上克隆12個(gè)GS同工酶啟動(dòng)子, 利用Plant-CARE在線(xiàn)軟件對(duì)其進(jìn)行序列分析及功能預(yù)測(cè), 利用三代測(cè)序技術(shù)測(cè)定了小麥不同染色體組上GS同工酶的轉(zhuǎn)錄水平, 為深入研究小麥A、B、D染色體組上不同GS同工酶表達(dá)調(diào)控機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)品種為具有豐產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)特點(diǎn)、氮素利用效率高的河南省當(dāng)家品種之一, 豫麥49 (YM49)。將成熟飽滿(mǎn)大小均勻一致的小麥種子放入清水中浸泡, 露白后分別移入Hoagland營(yíng)養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)至三葉一心, 分別取其根系和葉片, 液氮處理后于–80℃冰箱保存。許昌實(shí)驗(yàn)農(nóng)場(chǎng)大田種植的豫麥49, 于2018年10月16日機(jī)械播種, 播種前一次施入氮素量為225 kg hm–2, 其他管理同大田。于小麥開(kāi)花16 d后分別選取有代表性的旗葉、穗下節(jié)及籽粒, 每個(gè)處理重復(fù)3次, 液氮處理后于–80℃冰箱保存。

1.2 三代測(cè)序

將上述所取的葉、穗下節(jié)、籽粒、根系樣品分別于液氮中研磨成粉狀, 送百邁客生物科技公司, 由公司分別提取各部位RNA并等量混合后測(cè)序。

1.3 TaGS同工酶基因查找

依據(jù)本實(shí)驗(yàn)室前期克隆的小麥GS同工酶的cDNA序列[GenBank號(hào)分別為: TaGS1:1 (DQ124209), TaGS1:2 (AY491968), TaGS1:3 (AY491970)和TaGS2 (DQ124212)], 在中國(guó)春小麥基因組文庫(kù)(http://plants.ensembl.org/ Triticum_aestivum/Info/Index)中查找小麥GS基因。利用ClustalX軟件進(jìn)行序列對(duì)比, 確定編碼GS同工酶的基因, 預(yù)測(cè)上游的啟動(dòng)子位置。

1.4 引物設(shè)計(jì)

以1.3查找的中國(guó)春TaGS同工酶啟動(dòng)子序列為模板, 利用Premier 5.0設(shè)計(jì)擴(kuò)增目的片段的引物。上游引物(S)在A(yíng)TG上游2000 bp左右, 下游引物(A)在A(yíng)TG下游500 bp左右(表1)。擴(kuò)增目的序列包含啟動(dòng)子及ORF的5′端,由華大基因合成引物。

1.5 豫麥49基因組提取及啟動(dòng)子克隆

利用CTAB法[20]提取YM49基因組DNA。以YM49基因組DNA為模板進(jìn)行PCR: 95℃預(yù)變性180 s; 95℃變性15 s, 退火15 s (退火溫度詳見(jiàn)表1), 72℃延伸160 s, 循環(huán)35次; 72℃穩(wěn)定5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后, 切取與目的片段大小一致的條帶, 利用膠回收試劑盒(諾唯贊, DC301)回收目的條帶, 然后與pTOPO載體(艾德萊, DR01)連接, 轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌, 利用卡那抗性平板篩選陽(yáng)性克隆, 進(jìn)行PCR驗(yàn)證后送生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。

1.6 啟動(dòng)子序列分析

測(cè)序后利用ClustalX軟件與中國(guó)春小麥GS基因進(jìn)行序列對(duì)比, 并利用在線(xiàn)軟件Plant-CARE (http://bioinformatics. psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)對(duì)啟動(dòng)子序列進(jìn)行順式作用元件分析。

1.7 轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)預(yù)測(cè)

將三代測(cè)序的TaGS同工酶mRNA序列5′端A/G定為轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn); 若5′端沒(méi)有A/G, 沿克隆的啟動(dòng)子序列上游尋找最近的A/G定為轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。根據(jù)克隆的啟動(dòng)子序列, 距轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)最近的TATA-box為RNA聚合酶II識(shí)別位點(diǎn)[21]。

2 結(jié)果與分析

2.1 TaGS同工酶在小麥染色體中表達(dá)特點(diǎn)

TaGS同工酶種類(lèi)多, 且同源性高, 利用qPCR不能準(zhǔn)確反應(yīng)各染色體上TaGS的表達(dá)情況。三代測(cè)序可以獲得YM49的TaGS同工酶全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本, 便于準(zhǔn)確區(qū)分各個(gè)TaGS基因。為了得到小麥所有TaGS同工酶表達(dá)信息, 選擇花后16 d根系、節(jié)間、葉片、籽粒及苗期根系與葉片組織RNA等量混合測(cè)序。三代測(cè)序數(shù)據(jù)分析顯示, 不同染色體組的TaGS同工酶表達(dá)量存在差異。其中TaGSr基因表達(dá)量最高, TaGSe基因表達(dá)量最低。TaGS1位于6號(hào)染色體長(zhǎng)臂(L), 在A(yíng)、B、D染色體上的表達(dá)量依次為6B> 6A>6D; TaGSe和TaGSr位于4號(hào)B、D染色體長(zhǎng)臂(L)或A染色體短臂(S)。TaGSe在不同染色體上的表達(dá)量依次為4D>4A>4B; TaGSr在A(yíng)、B、D染色體上的表達(dá)量依次則為4D>4B>4A; TaGS2位于2號(hào)染色體長(zhǎng)臂(L), 在A(yíng)、B、D染色體上的表達(dá)量依次為2D>2B>2A (圖1)。

表1 TaGS同工酶啟動(dòng)子擴(kuò)增引物

2.2 TaGS同工酶啟動(dòng)子克隆

TaGS同工酶基因轉(zhuǎn)錄受其啟動(dòng)子元件調(diào)控, 為了探索其基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制, 對(duì)A、B、D染色體上的TaGS同工酶啟動(dòng)子進(jìn)行了克隆。首先以YM49基因組為模板, 利用特異性引物(表1)進(jìn)行PCR擴(kuò)增, 分別擴(kuò)增到A、B、D染色體上的TaGS1、TaGSr、TaGSe及TaGS2基因的啟動(dòng)子片段(圖2)。將與表1一致的目的片段回收, 與pTOPO載體連接轉(zhuǎn)化DH5α, 提取質(zhì)粒, 并進(jìn)行PCR鑒定后(圖3), 相應(yīng)菌株進(jìn)行測(cè)序, 結(jié)果表明YM49與中國(guó)春的GS啟動(dòng)子序列同源性為100%。

箭頭所指為目的片段。M: DNA分子量標(biāo)記。The arrows are the pointed to the target segment. M: marker.

箭頭所指為目的片段。M: DNA分子量標(biāo)記。The arrows are the pointed to the target segment. M: marker.

2.3 TaGS同工酶啟動(dòng)子序列分析

利用Plant-CARE在線(xiàn)軟件對(duì)克隆測(cè)序的12個(gè)TaGS同工酶啟動(dòng)子進(jìn)行分析, 發(fā)現(xiàn)存在功能不同的多種順式元件(圖4)。包括基本起始元件CAAT-box和TATA-box; 脫落酸、水楊酸、生長(zhǎng)素、赤霉素及茉莉酸等激素響應(yīng)元件; 光響應(yīng)元件; 厭氧、防御及低溫等脅迫響應(yīng)元件; 分生組織表達(dá)調(diào)控元件及柵欄葉肉細(xì)胞分化元件等組織特異性元件; 細(xì)胞周期及晝夜節(jié)律調(diào)節(jié)元件; MYB、MYC等轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn), 以及as-1、W-box、dOCT及WRE3等未知功能響應(yīng)元件。

不同TaGS同工酶啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)不同, 同一TaGS同工酶在不同染色體上有其特殊的響應(yīng)元件。6A染色體上的TaGS1啟動(dòng)子存在生長(zhǎng)素響應(yīng)元件和晝夜調(diào)控元件, 6B染色體上TaGS1啟動(dòng)子存在防御和脅迫響應(yīng)元件, 6D染色體上TaGS1啟動(dòng)子存在MYBHv1結(jié)合位點(diǎn)。TaGSe在4A染色體上存在干旱響應(yīng)元件及MYB結(jié)合位點(diǎn), 在4B染色體上存在MYBHv1結(jié)合位點(diǎn)、分生組織表達(dá)調(diào)控元件, 在4D染色體上存在赤霉素響應(yīng)元件、生長(zhǎng)素響應(yīng)元件、低溫響應(yīng)元件、MYBHv1結(jié)合位點(diǎn)、分生組織表達(dá)調(diào)控元件。TaGSr在4A染色體上存在A(yíng)-box、MYC, 在4B染色體上存在赤霉素響應(yīng)元件、水楊酸響應(yīng)元件、缺氧特異性誘導(dǎo)元件、細(xì)胞周期調(diào)控元件, 在4D染色體上存在MYBHv1結(jié)合位點(diǎn)。TaGS2在2A染色體上存在赤霉素響應(yīng)元件、厭氧誘導(dǎo)調(diào)控元件, 在2B染色體上存在茉莉酸甲酯響應(yīng)元件, 在2D染色體上存在赤霉素響應(yīng)元件、茉莉酸甲酯響應(yīng)元件、厭氧誘導(dǎo)調(diào)控元件。

基于TaGS同工酶啟動(dòng)子克隆與序列分析, 結(jié)合三代測(cè)序結(jié)果, 對(duì)不同TaGS同工酶基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)進(jìn)行了預(yù)測(cè)(圖5)。結(jié)果表明: 胞液型TaGS(包括TaGS1、TaGSe和TaGSr)在A(yíng)、B、D染色體上的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)位于A(yíng)TG上游約–88~ –249 bp, 且不同染色體組之間存在差異。TaGS1位于6號(hào)染色體, 在A(yíng)、B、D染色體上轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)分別位于A(yíng)TG上游–202 bp、–249 bp、–171 bp; TaGSe和TaGSr位于4號(hào)染色體, TaGSe在A(yíng)、B、D染色體上轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)分別位于A(yíng)TG上游–110 bp、–139 bp、–191 bp; TaGSr在A(yíng)、B、D染色體上轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)分別位于A(yíng)TG上游–88 bp、–89 bp、–107 bp。質(zhì)體型TaGS2在A(yíng)、B、D染色體上的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)距ATG最遠(yuǎn), 差異也最大, 約–111~ –631 bp。TaGS2位于2號(hào)染色體, 在A(yíng)、B、D染色體上轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)分別位于A(yíng)TG上游–111 bp、–631 bp、–448 bp。

小麥不同TaGS同工酶啟動(dòng)子存在特異的響應(yīng)元件, 不同的環(huán)境條件下、不同的生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期、不同的組織器官影響不同染色體上的TaGS同工酶轉(zhuǎn)錄水平不同, 而轉(zhuǎn)錄本5′端非編碼區(qū)與翻譯起始效率密切相關(guān), 進(jìn)一步影響TaGS同工酶表達(dá)量及生物活性, 從而影響小麥的氮素利用、產(chǎn)量和品質(zhì)。

3 討論

啟動(dòng)子是基因表達(dá)的開(kāi)關(guān), 可分為組成型、組織特異型和誘導(dǎo)型3種類(lèi)型[22], 啟動(dòng)子上的順式作用元件與基因表達(dá)水平密切相關(guān)。前人研究表明, 順式作用元件的種類(lèi)、數(shù)量、順序及距離可能會(huì)影響轉(zhuǎn)錄的起始及轉(zhuǎn)錄水平[23-24]。啟動(dòng)子上游存在的增強(qiáng)子或抑制子可能增強(qiáng)或降低基因的表達(dá)水平。栽培小麥不同染色體上的TaGS同工酶啟動(dòng)子元件不同, 可能響應(yīng)不同環(huán)境條件, 以確保TaGS表達(dá)水平, 使小麥具有豐產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)的特性。本實(shí)驗(yàn)室前期TaGS同工酶活性測(cè)定及Western 雜交表明花后16 d小麥旗葉及子粒GS同工酶條帶最多, 表達(dá)量也最大[13]。為了獲得小麥GS同工酶轉(zhuǎn)錄本及轉(zhuǎn)錄量全面信息, 本研究以豫麥49花后16 d各組織器官及苗期葉片和根系為材料, 采用三代測(cè)序技術(shù)研究了TaGS同工酶在不同染色體上的表達(dá)特點(diǎn), 發(fā)現(xiàn)豫麥49不同染色體的GS1、GSr、GSe和GS2表達(dá)量不同, 但GSr、GSe和GS2都是D染色體基因表達(dá)量最大, D組染色體使栽培小麥從二粒小麥進(jìn)化到現(xiàn)在的多粒小麥, 根系、葉片及籽粒主要GS同工酶的大量表達(dá)是氮素同化的基礎(chǔ), 也是產(chǎn)量形成的基礎(chǔ)。

研究啟動(dòng)子的方法主要是生物信息學(xué)預(yù)測(cè)分析及實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證, 本文利用生物信息學(xué)對(duì)TaGS的12個(gè)啟動(dòng)子序列進(jìn)行分析, 發(fā)現(xiàn)每個(gè)啟動(dòng)子中存在多個(gè)TATA-box, 結(jié)合三代測(cè)序數(shù)據(jù)分析表明在A(yíng)/G上游可能只有1個(gè)TATA-box是RNA聚合酶II識(shí)別位點(diǎn), 不同TaGS啟動(dòng)子的起始轉(zhuǎn)錄位點(diǎn)與TATA-box距離差別又十分大, 可能意味著起始轉(zhuǎn)錄的機(jī)理不盡相同; 每個(gè)啟動(dòng)子都有許多光響應(yīng)元件, 但是只有TaGS2酶表達(dá)量及活性受光照強(qiáng)度影響[13], 當(dāng)利用啟動(dòng)子與構(gòu)建重組載體轉(zhuǎn)化擬南芥時(shí), 發(fā)現(xiàn)只有GS2-2AL啟動(dòng)子受光誘導(dǎo)(結(jié)果尚未發(fā)表)。Plant-CARE在線(xiàn)分析還發(fā)現(xiàn)每個(gè)GS啟動(dòng)子除了基本調(diào)控元件CAAT-box外, 還存在多種非生物脅迫應(yīng)答元件, 如缺氧/厭氧調(diào)控元件、干旱響應(yīng)原件、低溫響應(yīng)原件等以及轉(zhuǎn)錄因子如MYB、MYC等結(jié)合位點(diǎn), 啟動(dòng)子上的順式元件特點(diǎn)與基因功能密切相關(guān)[25]。乙烯、茉莉酸和赤霉素處理使大豆基因啟動(dòng)子活性增強(qiáng)[26], 干旱可誘導(dǎo)小麥啟動(dòng)子活性[27], 小麥基因啟動(dòng)子響應(yīng)干旱、低溫及ABA[28], 松樹(shù)的GS啟動(dòng)子可與MYB轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合從而提高GS同工酶的表達(dá)量[18]等。TaGS同工酶啟動(dòng)子元件數(shù)量及種類(lèi)不同, 對(duì)外界環(huán)境應(yīng)答不同, 可能是TaGS同工酶差異表達(dá)及在A(yíng)、B、D染色體上差異表達(dá)的原因。但是這些啟動(dòng)子元件是否真正存在, 哪個(gè)部位的響應(yīng)元件起作用, 以及如何響應(yīng)外界環(huán)境的變化等還需要進(jìn)一步驗(yàn)證。

不同顏色代表不同類(lèi)型的響應(yīng)元件, 顏色和形狀代表一個(gè)具體的響應(yīng)元件。紅色: 激素響應(yīng)元件; 綠色: 功能未知的響應(yīng)元件; 藍(lán)色: 基礎(chǔ)元件; 黑色: 轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn); 紫色: 脅迫響應(yīng)元件; 粉色: 組織特異性響應(yīng)元件; 黃色: 光響應(yīng)元件。

Different colors represent different types of response elements; color and shape represent a specific response element. Red: hormone response element; Green: unknown function response element; Blue: basic element; Black: transcription factor binding site; Purple: stress response element; Pink: tissue specific response element; Yellow: light response element.

TATA-box為RNA聚合酶II識(shí)別位點(diǎn)。TATA box is the RNA polymerase II recognition site.

[1] Miflin B J, Habash D Z. The role of glutamine synthetase and glutamate dehydrogenase in nitrogen assimilation and possibilities for improvement in the nitrogen utilization of crops., 2002, 53: 979–987.

[2] Ortega J L, Wilson O L, Sengupta-Gopalan C. The 5′ untranslated region of the soybean cytosolic glutamine synthetase β1 gene contains prokaryotic translation initiation signals and acts as a translational enhancer in plants., 2012, 287: 881–893.

[3] Keys A J. The re-assimilation of ammonia produced by photorespiration and the nitrogen economy of C3higher plants., 2006, 87: 165–175.

[4] Konishi N, Saito M, Imagawa F, Kanno K, Yamaya T, Kojima S. Cytosolic glutamine synthetase isozymes play redundant roles in ammonium assimilation under low-ammonium conditions in roots of., 2018, 59: 601–613.

[5] Kichey T,HeumezE, PocholleD, PageauK, VanackerH, DuboisF, GouisJ L, Hirel B. Combined agronomic and physiological aspects of nitrogen management in wheat highlight a central role for glutamine synthetase., 2006, 169: 265–278.

[6] Li H M, Liang H, Li Z, Li Z, Tang Z X, Fu S L, Geng Y Y, Yan B J, Ren Z L. Dynamic QTL analysis of protein content and glutamine synthetase activity in re-combinant inbred wheat lines., 2015, 14: 8706–8715.

[7] Kichey T, Hirel B, Heumez E, Dubois F, Le Gouis J. In winter wheat (L.) post-anthesis nitrogen uptake and remobilization to the grain correlates with agronomic traits and nitrogen physiological markers., 2007, 102: 22–32.

[8] Bernard S M, Moller A L, Dionisio G, Kichey T, Jahn T P, Dubois F, Baudo M, Lopes M S, Tercé-Laforgue T, Foyer C H, Parry M A, Forde B G, Araus J L, Hirel B, Schjoerring J K, Habash D Z. Gene expression, cellular localization and function of glutamine synthetase isozymes in wheat (L)., 2008, 67: 89–105.

[9] 王小燕, 于振文. 不同小麥品種主要品質(zhì)性狀及相關(guān)酶活性研究. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué), 2005, 38: 1980–1988. Wang X Y, Yu Z W. Study on main quality traits and related enzyme activities of different wheat varieties., 2005, 38: 1980–1988 (in Chinese with English abstract).

[10] Cai H, Zhou Y, Xiao J, Li X, Zhang Q, Lian X. Overexpressed glutamine synthetase gene modifies nitrogen metabolism and abiotic stress responses in rice., 2009, 28: 527–537.

[11] 賈喜婷, 韋一昊, 谷明鑫, 石愛(ài)博, 王小純. 過(guò)表達(dá)對(duì)煙草抗鹽能力的影響及其機(jī)制. 中國(guó)煙草學(xué)報(bào), 2017, 121: 112–117. Jia X T, Wei Y H, Gu M X, Shi A B, Wang C H. Effects of overexpression ofon tobacco salt resistance and its mechanism., 2017, 121: 112–117 (in Chinese with English abstract).

[12] Hoshida H, Tanaka Y, Hibino T, Hayashi Y, Tanaka A, Takabe T, Takabe T. Enhanced tolerance to salt stress in transgenic rice that overexpresses chloroplast glutamine synthetase., 2000, 43: 103–111.

[13] 張同勛. 小麥谷氨酰胺合成酶在氮素代謝中的功能分析. 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文, 河南鄭州, 2012. pp 7–32. Zhang T X. Functional Analysis of Wheat Glutamine Synthase in Nitrogen Metabolism. MS Thesis of Henan Agricultural University, Zhengzhou, Henan, China, 2012. pp 7–32 (in Chinese with English abstract).

[14] Céline M D, Michèle R C, Karine P, Maud L, Olivier G, Joceline K, Marie H V, Magali F, Tiphanie J, Akira S. Glutamine synthetase-glutamate synthase pathway and Glutamate dehydrogenase play distinct roles in the sink-source nitrogen cycle in tobacco., 2006, 140: 444–456.

[15] Moison M, Marmagne A, Dinant S, Soulay F, Azzopardi M, Lothier J, Citerne S, Morin H, Legay N, Chardon F, Avice J C, Reisdorf-Cren M, Masclaux-Daubresse C. Three cytosolic glutamine synthetase isoforms located in different order veins work together for N remobilization and seed filling in., 2018, 69: 4379–4393.

[16] Tabuchi M, Sugiyama K, Ishiyama K, Inoue E, Sato T, Takahashi H, Yamaya T. Severe reduction in growth rate and grain filling of rice mutants lacking, a cytosolic glutamine synthetase1:1., 2005, 42: 641–651.

[17] Tabuchi M, Abiko T, Yamaya T. Assimilation of ammonium ions and reutilization of nitrogen in rice (L.)., 2007, 58: 2319–2327.

[18] Gómez-Maldonado J, Avila C, Torre F, Ca?as R, Cánovas F M, Campbell M M. Functional interactions between a glutamine synthetase promoter and MYB proteins., 2004, 39: 513–526.

[19] 董佳敏, 徐永清, 彭麗娜, 馮旭, 姚樹(shù)寬, 趙巧芩, 李鳳蘭, 胡寶忠. 小麥品種東農(nóng)冬麥2號(hào)根中TaEXPA7部分同源基因的克隆及表達(dá)特性分析. 麥類(lèi)作物學(xué)報(bào), 2017, 37(11): 25–33. Dong J M, Xu Y Q, Peng L N, Feng X, Yao S K, Zhao Q C, Li L F, Hu B Z. Cloning and expression characteristics analysis of some homologous genes TaEXPA7 in root of winter wheat Dongnong No.2 variety., 2017, 37(11): 25–33(in Chinese with English abstract).

[20] 何輝. 光皮樺基因克隆及其互作蛋白分析. 浙江農(nóng)林大學(xué)碩士學(xué)位論文, 浙江杭州, 2016. pp 15–76. He H. Cloning of theGene and Analysis of Its Interaction Proteins in Birch. MS Thesis of Zhejiang A & F University, Hangzhou, Zhejiang, China, 2016. pp 15–76(in Chinese with English abstract).

[21] 李志英, 牟紅珍, 高丁梅, 丁國(guó)平, 馬婷, 王盛. 本氏煙I型啟動(dòng)子的克隆及其轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)分析. 中國(guó)生物工程雜志, 2014, 34(1): 28–35. Li Z Y, Mou H Z, Gao D M, Ding G P, Ma T, Wang S. Cloning of cigarette type I promoter and analysis of its transcriptional starting sites., 2014, 34(1): 28–35 (in Chinese with English abstract).

[22] 李一琨, 王金發(fā). 高等植物啟動(dòng)子研究進(jìn)展. 植物學(xué)通報(bào), 1998, 15(增刊1): 1–6.Li Y K, Wang J F. Research progress of higher plant promoters., 1998, 15(S1): 1–6(in Chinese with English abstract).

[23] 路靜, 趙華燕, 何奕昆, 宋艷茹. 高等植物啟動(dòng)子及其應(yīng)用研究進(jìn)展. 自然科學(xué)進(jìn)展, 2004, 14: 856–862. Lu J, Zhao H Y, He Y K, Song Y R. Advances in higher plant promoters and their applications., 2004, 14: 856–862(in Chinese with English abstract).

[24] 王昊龍, 韓俊杰, 李衛(wèi)華, 劉偉. 抗性淀粉含量不同的小麥品種(系)淀粉分支酶和基因多態(tài)性分析. 新疆農(nóng)業(yè)科學(xué), 2015, 52: 981–987.Wang H L, Han J J, Li W H, Liu W. Resistant starch content of different wheat varieties (or lines) of starch branching enzymeandgene polymorphism analysis., 2015, 52: 981–987(in Chinese with English abstract).

[25] 扆珩, 李昂, 劉惠民, 景蕊蓮. 小麥蛋白磷酸酶2A基因啟動(dòng)子的克隆及表達(dá)分析. 作物學(xué)報(bào), 2016, 42: 1282–1290.Yi H, Li A, Liu H M, Jing R L. Wheat protein phosphatase 2A genepromoter cloning and expression analysis., 2016, 42: 1282–1290(in Chinese with English abstract).

[26] 邵宇鵬, 楊明明, 包格格, 孫英楠, 楊強(qiáng), 李文濱, 王志坤. 大豆基因啟動(dòng)子克隆及其功能分析. 中國(guó)油料作物學(xué)報(bào), 2019, 41: 517–523.Shao Y P, Yang M M, Bao G G, Sun Y N, Yang Q, Li W B, Wang Z K. Cloning and functional analysis of soybean GmWRI1a promoter., 2019, 41: 517–523(in Chinese with English abstract).

[27] 魏文杰, 鄧霞, 楊淑慎. 非生物脅迫下小麥基因啟動(dòng)子的功能分析. 福建師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2019, 35(2): 76–84. Wei W J, Deng X, Yang S S. Functional analysis ofgene promoter in wheat under abiotic stress.(Nat Sci Edn), 2019, 35(2): 76–84 (in Chinese with English abstract).

[28] 常建忠, 董春林, 張正, 喬麟軼, 楊睿, 蔣丹, 張彥琴, 楊麗莉, 吳佳潔, 景蕊蓮. 小麥抗逆相關(guān)基因的5′非翻譯區(qū)含子功能分析. 作物學(xué)報(bào), 2019, 45: 1311–1318. Chang J Z, Dong C L, Zhang Z, Qiao L Y, Yang R, Jiang D, Zhang Y Q, Yang L L, Wu J J, Jing R L. Functional analysis of 5' non-translational subdomains of stress-related genein wheat., 2019, 45: 1311–1318 (in Chinese with English abstract).

[29] 金正勛, 李丹, 李明月, 同拉嘎, 潘冬, 張玉磊, 王海微, 韓云飛, 張忠臣. 水稻谷氨酰胺合成酶同工型基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)量與啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)關(guān)系分析. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2017, 48(10): 1–10.Jin Z X, Li D, Li M Y, Tong L G, Pan D,Zhang Y L,Wang H W, Han Y F, Zhang Z C. Relationship between transcriptional expression of glutamine synthase isotype gene and promoter structure in rice., 2017, 48(10): 1–10(in Chinese with English abstract).

Transcription characteristics of wheat glutamine synthetase isoforms and the sequence analysis of their promoters

WANG Xiao-Chun1,2, WANG Lu-Lu1, ZHANG Zhi-Yong1, QIN Bu-Tan1, YU Mei-Qin2, WEI Yi-Hao1, and MA Xin-Ming1,*

1Collaborative Innovation Center of Henan Grain Crops, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, Henan, China;2College of Life Science, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, Henan, China

As a key enzyme for nitrogen assimilation in wheat, glutamine synthetase is grouped into two classes: cytosolic GS and chloroplastic GS (TaGS2), and cytosolic GS includes TaGS1, TaGSr, and TaGSe. In order to study the expression characteristics and regulatory mechanisms of GS isozymes in chromosome A, B, and D of heterohexaploid wheat, transcripts of TaGS isoforms were analyzed based on the third-generation sequencing technology transcriptome analysis, and 12 promoters of TaGS isozymes of Yumai 49 were cloned based on Chinese Spring genome, and the sequence of the promoters were analyzed. The results showed that TaGS1 was mainly transcribed on chromosome 6B, TaGSe and TaGSr on chromosome 4D, and TaGS2 on chromosome 2D. Furthermore, the distance from initiation codon ATG to initiation site of transcript for each promoter of TaGS was distinct. Promoter element analysis showed that the promoter of TaGS1 in 6B had more W-box, AC-I, ABRE, as-1, and methyl jasmonic response elements, the promoter of TaGSe in 4D had more stress response elements (MYB, MBS, LTR, etc.) and auxin response element, the promoter of TaGSr in 4D had more WRE3 and transcript factor response elements, the promoter of TaGS2 in 2D had more A-box, WRE3, ARE, and an AT enrichment region. In summary, the number, type and order of cis-elements of different promoters of TaGS isozymes were distinct, which provided the foundation for further study on the regulation mechanism of TaGS isozymes.

wheat; GS isoforms; transcription; promoter; cis-element

10.3724/SP.J.1006.2021.01046

本研究由國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(2016YFD0300205)和河南省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項(xiàng)目(S2010-01-G04)資助。

This study was supported by the National Key Research and Development Program of China (2016YFD0300205) and the Modern Agricultural Technology System in Henan Province (S2010-01-G04).

馬新明, E-mail: xinmingma@126.com

E-mail: xiaochun.w@163.com

2020-06-03;

2020-10-17;

2020-11-02.

URL: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20201030.1707.010.html