不同類型Monilinia fructicola 菌株的溫度適應(yīng)性及其對(duì)苯并咪唑類殺菌劑和乙霉威的交互抗性

陳鳳平, 鄭鈺瓏, 周 挺, 張 玥, 黃中喬, 劉西莉*,,4

(1. 福建農(nóng)林大學(xué) 閩臺(tái)作物有害生物生態(tài)防控國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福州 350002；2. 中國(guó)煙草總公司福建省公司，福州 350003；3. 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物病理學(xué)系，北京 100193；4. 西北農(nóng)林科技大學(xué) 植物病理學(xué)系，陜西 楊凌 712100)

0 引言

褐腐病菌Monilinia fructicola (G. Winter)Honey 是引起果樹褐腐病的重要病原菌[1-2]，對(duì)果樹的花、莖、果實(shí)等均可為害，尤其以為害成熟期及儲(chǔ)藏期的果實(shí)為重。該病原菌可以侵染多種果樹，主要包括桃、李、櫻桃等核果類果樹，以及梨、蘋果等仁果類果樹。病菌侵染果實(shí)后，首先在果實(shí)上出現(xiàn)淡褐色斑點(diǎn)，隨后迅速擴(kuò)展產(chǎn)生大量的分生孢子，分生孢子還會(huì)引起再侵染造成更大范圍的危害，被侵染的果實(shí)后期會(huì)縮水干燥形成僵果[3]。M. fructicola 主要分布在美洲，是歐洲的檢疫性病原，近年來，該病原菌在中國(guó)多個(gè)桃產(chǎn)區(qū)，包括北京、山東、中部、西部及東南地區(qū)等均有報(bào)道[2,4-6]。對(duì)于果樹褐腐病，生產(chǎn)中還是以化學(xué)防治為主，許多內(nèi)吸性殺菌劑如苯并咪唑類殺菌劑 (methyl benzimidazole carbamates, MBCs)、甾醇脫甲基抑制劑 (sterol demethylation inhibitors,DMIs)、Qo 位點(diǎn)抑制劑 (quinone outside inhibitors,QoIs) 及琥珀酸脫氫酶抑制劑 (succinate dehydrogenase inhibitors, SDHIs) 均可有效控制褐腐病的發(fā)展[7-10]。

MBCs 類殺菌劑殺菌譜廣，具有很好的內(nèi)吸性，對(duì)哺乳動(dòng)物安全。自20 世紀(jì)被開發(fā)以來，一直被廣泛用于控制植物真菌病害的流行和危害，代表性藥劑如多菌靈、苯菌靈、甲基硫菌靈等。其作用機(jī)制是通過與病原菌微管蛋白結(jié)合而影響微管的正確組裝，從而破壞紡錘絲的形成，最終阻礙病原菌細(xì)胞的正常有絲分裂，起到殺菌作用[11-12]，因此該類殺菌劑也稱為β-微管蛋白抑制劑。該類藥劑對(duì)褐腐病有很好的防治效果，然而由于其作用位點(diǎn)單一，長(zhǎng)期使用會(huì)產(chǎn)生抗藥性問題。截至目前，已有多篇文獻(xiàn)報(bào)道了M. fructicola對(duì)MBCs 的抗性，如Ma 等檢測(cè)到其對(duì)苯菌靈和甲基硫菌靈產(chǎn)生了抗性，且引起低抗和高抗的原因是菌株Tub2 基因上的氨基酸發(fā)生了變異，分別為H6Y 和E198A 點(diǎn)突變[13]；隨后，其他研究者也發(fā)現(xiàn)，Monilinia spp. 對(duì)苯并咪唑類殺菌劑的抗性相關(guān)突變位點(diǎn)為E198A，且該突變位點(diǎn)廣泛存在，如在美國(guó)加利福尼亞州[14]和南卡羅來納州[15]，以及巴西[16]、意大利、法國(guó)、西班牙和瑞士[17]均有報(bào)道。

乙霉威屬于氨基甲酸酯類殺菌劑，其對(duì)MBCs表現(xiàn)敏感的菌株具有天然不敏感性，但其與多菌靈、甲基硫菌靈等常用的MBCs 具有負(fù)交互抗性，因此，生產(chǎn)中乙霉威常作為治理對(duì)MBCs 產(chǎn)生抗性菌株的重要?dú)⒕鷦＠纾荷蛑娴妊芯堪l(fā)現(xiàn)，當(dāng)多菌靈與乙霉威按質(zhì)量比1 : 1 混配時(shí)，其對(duì)多菌靈抗性的番茄灰霉病菌的聯(lián)合作用系數(shù)(共毒系數(shù))達(dá)到 460.63[18]；Zhu 等發(fā)現(xiàn)，200 μg/mL的多菌靈和乙霉威混劑 (質(zhì)量比4 : 1)，對(duì)抗多菌靈菌株Sclerotinia sclerotiorum 的保護(hù)效果達(dá)100%，治療效果為87.1%[19]；Malandrakis 等檢測(cè)了來自希臘與M. fructicola 同屬的M. laxa 菌株對(duì)多菌靈的敏感性，發(fā)現(xiàn)有37% 的菌株為高抗菌株，多菌靈對(duì)該菌株的EC50值大于500 μg/mL，但該菌株對(duì)乙霉威卻表現(xiàn)敏感[20]。在M. fructicola中也發(fā)現(xiàn)多菌靈抗性菌株對(duì)乙霉威具有負(fù)交互抗性[21]。然而，也有研究者報(bào)道，在灰霉病菌中，部分菌株對(duì)乙霉威和多菌靈產(chǎn)生了雙重抗性[22]。

本研究組在前期研究中發(fā)現(xiàn)，對(duì)甲基硫菌靈產(chǎn)生抗性的M. fructicola 菌株，在其Tub2 蛋白序列上存在3 個(gè)與抗性有關(guān)的點(diǎn)突變，包括E198A、E198Q 及F200Y[7]。因此，本研究進(jìn)一步檢測(cè)了含不同點(diǎn)突變的M. fructicola 菌株在不同溫度下的生長(zhǎng)特性，及其對(duì)甲基硫菌靈、多菌靈和乙霉威的敏感性差異，明確不同類型菌株的溫度適應(yīng)性及其對(duì)乙霉威的交互抗性情況，旨在為進(jìn)一步監(jiān)測(cè)褐腐病菌對(duì)MBCs 類殺菌劑的抗性發(fā)生發(fā)展提供理論基礎(chǔ)，為利用乙霉威治理MBCs 抗性菌株提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試藥劑與培養(yǎng)基

殺菌劑：98.5% 甲基硫菌靈 (thiophanatemethyl) 原藥、98.0%多菌靈 (carbendazim) 原藥及99.1%乙霉威 (diethofencarb) 原藥，均由沈陽化工研究院合成。甲基硫菌靈與乙霉威用丙酮溶解，而多菌靈溶解于0.2 mol/L 的鹽酸中，均配制成1 × 104μg/mL 的母液，于 4 ℃ 冰箱中貯存，備用。

PDA 培養(yǎng)基：200 g 馬鈴薯，20 g 葡萄糖，20 g 瓊脂粉，用去離子水定容至1 L。于121 ℃，高壓蒸汽滅菌20 min。

1.2 供試菌株

4 種類型M. fructicola 菌株均源自中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)種子病理藥理實(shí)驗(yàn)室保存庫，分別為對(duì)甲基硫菌靈表現(xiàn)敏感的菌株3 株；對(duì)甲基硫菌靈表現(xiàn)為抗性且在β-微管蛋白上分別攜帶E198A、E198Q及F200Y 點(diǎn)突變的菌株各3 株 (表1)[7]。上述菌株分別用S、R(E198A)、R(E198Q)及R(F200Y)表示。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 溫度對(duì)不同類型菌株生長(zhǎng)的影響 選取在PDA 平板上培養(yǎng)5 d 的新鮮菌落，在菌落邊緣同一圓周上打取5 mm 菌餅，接種于PDA 平板上，每皿接種1 個(gè)菌餅，每菌株3 次重復(fù)。分別置于13、18、25、28 及33 ℃培養(yǎng)箱中，黑暗培養(yǎng)5 d，測(cè)量各溫度培養(yǎng)箱下各菌株的菌落直徑，并利用公式 (1)[23]分析菌落直徑與溫度的關(guān)系，計(jì)算不同類型菌株的最適生長(zhǎng)溫度。同時(shí)根據(jù)公式 (2) 計(jì)算各菌株的生長(zhǎng)速率，并求出每類菌株的平均生長(zhǎng)速率。

式 (1) 中：DT為菌落直徑，T 為溫度，a、b 和 c 為常數(shù)。

式 (2) 中：Gr為生長(zhǎng)速率，DT和t 分別表示T 溫度培養(yǎng)下的菌落直徑和培養(yǎng)時(shí)間。

1.3.2 甲基硫菌靈對(duì)不同類型菌株生長(zhǎng)的影響配制甲基硫菌靈的系列質(zhì)量濃度藥液，將其分別加入冷卻至約45 ℃的PDA 培養(yǎng)基中，制成終濃度分別為 0.1、1、5 及 50 μg/mL 的含藥平板，并以含等量丙酮的PDA 平板為對(duì)照。在預(yù)培養(yǎng)的各菌株菌落邊緣打取直徑5 mm 的菌餅，接種于以上平板中央，置于23 ℃培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)，每處理3 次重復(fù)。當(dāng)對(duì)照菌落直徑達(dá)到培養(yǎng)皿直徑的80%左右時(shí)，采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，按照公式 (3)[24-25]求出菌株在各甲基硫菌靈濃度處理下的相對(duì)生長(zhǎng)量 (%)。

表1 不同點(diǎn)突變菌株對(duì)苯并咪唑類殺菌劑和乙霉威的交互抗性Table 1 Cross resistance between methyl-benzimidazole carbamates and diethofencarb in Monilinia fructicola isolates with different mutations in β-tubulin gene

式 (3) 中：RGi為i 處理的相對(duì)生長(zhǎng)量，Di和D0分別表示i 處理和對(duì)照的平均菌落直徑。

2．5 慢性病相關(guān)知識(shí)來源情況 被調(diào)查小學(xué)生最信任和最喜歡的健康知識(shí)來源分別是老師講課和電視，飲食和運(yùn)動(dòng)習(xí)慣受家人影響的比例最高。見表5。

1.3.3 多菌靈對(duì)不同類型菌株生長(zhǎng)的影響 配制多菌靈系列質(zhì)量濃度藥液，將其分別加入冷卻至約45 ℃的PDA 培養(yǎng)基中，制成終濃度分別為0.01、0.1、1、5 及 50 μg/mL 的含藥平板。以不含藥PDA 平板為空白對(duì)照，并接菌于平板上，每處理3 次重復(fù)。于23 ℃黑暗培養(yǎng)5 d 后，由公式 (3)求出菌株在各多菌靈濃度處理下的相對(duì)生長(zhǎng)量 (%)。

1.3.4 乙霉威對(duì)不同類型菌株生長(zhǎng)的影響 配制乙霉威系列質(zhì)量濃度藥液，將其分別加入冷卻至約45 ℃的PDA 培養(yǎng)基中，制成終濃度分別為0.1、1、5 及 50 μg/mL 的含藥平板，以不含藥PDA 平板為對(duì)照，并接菌于平板上，每處理3 次重復(fù)。于23 ℃黑暗培養(yǎng)5 d 后，由公式 (3) 求出菌株在各乙霉威濃度處理下的相對(duì)生長(zhǎng)量 (%)。

1.3.5 交互抗藥性測(cè)定及分析 根據(jù)1.3.2～1.3.4 節(jié)的試驗(yàn)結(jié)果，分別選擇甲基硫菌靈、多菌靈和乙霉威的區(qū)分濃度。分別配制終濃度為1 μg/mL 的甲基硫菌靈、多菌靈和乙霉威含藥PDA 平板，同時(shí)設(shè)置兩種對(duì)照處理，甲基硫菌靈和乙霉威處理的對(duì)照為含0.1%丙酮的PDA 平板處理，多菌靈處理的對(duì)照為不含丙酮的PDA 平板處理，每處理重復(fù)3 次。選取5 mm 菌餅接菌于各平板中央，23 ℃黑暗培養(yǎng)5 d，以十字交叉法測(cè)定各菌株的菌落直徑，并計(jì)算菌株在每個(gè)處理下的平均菌落直徑，用公式 (3) 計(jì)算菌株的相對(duì)生長(zhǎng)量。以對(duì)乙霉威的相對(duì)生長(zhǎng)量為縱坐標(biāo)，對(duì)甲基硫菌靈或多菌靈的相對(duì)生長(zhǎng)量為橫坐標(biāo)，用公式 (4)[26]分別分析 S 型菌株與R(E198A)、R(E198Q)和R(F200Y)型菌株對(duì)兩種藥劑的相對(duì)生長(zhǎng)量的相關(guān)性，計(jì)算相關(guān)系數(shù)r 值及p 值，并根據(jù)r 值、p 值和表型判斷交互抗性情況。當(dāng) p 值 ＜ 0.05、r 值 ＜ 0，且對(duì)甲基硫菌靈或多菌靈抗性的菌株對(duì)乙霉威表現(xiàn)敏感時(shí)，則判定該類型菌株對(duì)乙霉威存在負(fù)交互抗性；當(dāng)p 值 ＞ 0.05，無論r 值大小和表型如何，則判定該類型菌株對(duì)兩種藥劑均不存在交互抗性。

式 (4) 中：y 為對(duì)乙霉威的相對(duì)生長(zhǎng)量，x 為對(duì)甲基硫菌靈或多菌靈的相對(duì)生長(zhǎng)量，a 和b 為常數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同類型菌株對(duì)溫度適應(yīng)性

分別于13、18、25、28 及33 ℃下培養(yǎng)4 種類型菌株。結(jié)果表明，所有菌株均可以在13～28 ℃之間生長(zhǎng)，但均不能在33 ℃下生長(zhǎng)；所有菌株均表現(xiàn)為在一定溫度范圍內(nèi)隨溫度的升高，菌落生長(zhǎng)加快，但當(dāng)溫度達(dá)到一定高度后，又隨溫度的升高，菌落生長(zhǎng)減慢。進(jìn)一步分析菌落生長(zhǎng)與培養(yǎng)溫度的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，4 種類型菌株對(duì)溫度的生長(zhǎng)曲線模式相同，均呈現(xiàn)為顯著的二階多項(xiàng)式相關(guān) (圖 1A～1D，p 值均 ＜ 0.05)；但最適生長(zhǎng)溫度具有一定的差異，敏感菌株與R(E198A)型抗性菌株的最適生長(zhǎng)溫度相同且最高，均為22.7 ℃(圖1A～1B)，R(F200Y)型抗性菌株的最適生長(zhǎng)溫度次之，為22.1 ℃(圖1C)，而R(E198Q)型菌株的最適生長(zhǎng)溫度最小，為22.0 ℃(圖1D)。

2.2 不同類型菌株的生長(zhǎng)速率差異

分析4 種類型菌株分別在13、18、25 及28 ℃下生長(zhǎng)速率的差異。結(jié)果 (圖2A～2D)表明，其生長(zhǎng)速率范圍分別為 0.11～0.23 cm/d、0.25～0.36 cm/d、0.46～0.69 cm/d 及 0.03～0.60 cm/d；其中，S、R(E198A)及R(F200Y)型菌株在所有溫度條件下的生長(zhǎng)速率均無顯著差異，而R(E198Q)型菌株生長(zhǎng)速率均表現(xiàn)為最慢，且在13 ℃和28 ℃條件下顯著低于其他3 類菌株。

2.3 甲基硫菌靈對(duì)不同類型菌株生長(zhǎng)的影響

2.4 多菌靈對(duì)不同類型菌株生長(zhǎng)的影響

當(dāng)多菌靈的處理質(zhì)量濃度為0.01 μg/mL 時(shí)，所有菌株的相對(duì)生長(zhǎng)量均大于95%。當(dāng)其質(zhì)量濃度為0.1 μg/mL 時(shí)，S 型菌株的平均相對(duì)生長(zhǎng)量?jī)H為8.5%，其他3 類抗性菌株的相對(duì)生長(zhǎng)量均大于98.0%，3 類抗性菌株的相對(duì)生長(zhǎng)量顯著高于S 型菌株，但抗性菌株間無顯著差異 (圖4A)。當(dāng)處理質(zhì)量濃度提高到1.0 μg/mL 時(shí)，S 型菌株的平均相對(duì)生長(zhǎng)量?jī)H為3.0%，R(E198A)和R(F200Y)型抗性菌株相對(duì)生長(zhǎng)量仍大于100.0%，但 R(E198Q)型菌株的相對(duì)生長(zhǎng)量降低到45.8%，且顯著低于其他兩類抗性菌株 (圖4B)。當(dāng)處理質(zhì)量濃度提高到5.0 μg/mL時(shí)，S 型菌株和R(E198Q)型菌株停止生長(zhǎng)，R(E198A)和R(F200Y)型抗性菌株相對(duì)生長(zhǎng)量仍大于80.0%，但R(F200Y)型菌株顯著低于R(E198A)型菌株 (圖4C)。隨著處理濃度進(jìn)一步提高到50.0 μg/mL 時(shí)，除了R(E198A)型菌株，其他3 類菌株均停止生長(zhǎng) (圖4D)。綜合表明，S 型菌株對(duì)多菌靈表現(xiàn)敏感；R(E198A)、R(E198Q)和 R(F200Y)3 種類型菌株均對(duì)多菌靈表現(xiàn)抗性，但抗性有所差異，其中R(E198Q)型抗性水平相對(duì)較低，R(F200Y)型次之，R(E198A)型抗性水平最高。

2.5 乙霉威對(duì)不同類型菌株生長(zhǎng)的影響

當(dāng)乙霉威的處理質(zhì)量濃度為0.1 μg/mL 時(shí)，S 型菌株的平均相對(duì)生長(zhǎng)量最高，為98.8%，其他3 類抗性菌株的相對(duì)生長(zhǎng)量范圍為59.9%～94.8%，3 類抗性菌株中R(E198Q)型的相對(duì)生長(zhǎng)量顯著低于其他兩類 (圖5A)。當(dāng)處理質(zhì)量濃度提高到1.0 μg/mL 時(shí)，R(E198A)型抗性菌株的平均相對(duì)生長(zhǎng)量?jī)H為0.2%；S 型、R(E198Q)和R(F200Y)型菌株相對(duì)生長(zhǎng)量范圍為87.3%～96.2%，且三者之間無顯著差異 (圖5B)。當(dāng)處理質(zhì)量濃度提高到5.0 μg/mL時(shí)，R(E198A)型菌株停止生長(zhǎng)；S 型、R(E198Q)和R(F200Y)型菌株相對(duì)生長(zhǎng)量范圍為92.7%～101.7%，且三者之間無顯著差異 (圖5C)。隨著處理濃度進(jìn)一步提高到50.0 μg/mL 時(shí)，除了R(E198A)型菌株，其他3 類菌株依然可以生長(zhǎng)，且R(F200Y)型和S 型無顯著差異，但顯著高于R(E198Q)型 (圖5D)。綜合表明，R(E198A)型菌株對(duì)乙霉威表現(xiàn)敏感，S 型菌株表現(xiàn)為天然不敏感，R(E198Q)和 R(F200Y)兩種類型則表現(xiàn)為抗藥性，且抗性水平差別不大。

2.6 MBCs 與乙霉威的交互抗性

綜合2.3～2.5 節(jié)的分析結(jié)果可見，當(dāng)甲基硫菌靈和多菌靈的處理質(zhì)量濃度達(dá)1.0 μg/mL 時(shí)，可以明顯區(qū)分S 型和其他3 類菌株。因此，選擇質(zhì)量濃度為1.0 μg/mL 時(shí)的相對(duì)生長(zhǎng)量分析其與乙霉威的交互抗性情況。如表1 所示，3 株S 型菌株對(duì)甲基硫菌靈的相對(duì)生長(zhǎng)量均小于2.0%，但對(duì)乙霉威的相對(duì)生長(zhǎng)量均大于80.0%，表明這3 個(gè)菌株對(duì)乙霉威均表現(xiàn)為天然不敏感性；3 株R(E198A)型菌株對(duì)甲基硫菌靈的相對(duì)生長(zhǎng)量均大于94.0%，但其對(duì)乙霉威的相對(duì)生長(zhǎng)量均小于1.0%，表明這3 株菌株對(duì)乙霉威均表現(xiàn)敏感；而R(E198Q)型和R(F200Y)型菌株，對(duì)甲基硫菌靈和乙霉威的相對(duì)生長(zhǎng)量均大于84.0%，表明這些菌株對(duì)乙霉威表現(xiàn)抗性 (表1)。相關(guān)性分析結(jié)果表明，S 和R(E198A)型組合菌株對(duì)甲基硫菌靈的敏感性與乙霉威存在顯著負(fù)相關(guān)性 (圖 6A，r =?0.992，p = 0.000)；S 分別和R(E198Q)型和R(F200Y)型組合菌株對(duì)甲基硫菌靈的敏感性與乙霉威具有一定的正相關(guān)性，但相關(guān)性不顯著 (圖 6B～6C，p 均 ＞ 0.050)。分析多菌靈與乙霉威的交互抗藥性，發(fā)現(xiàn)不同類型組合菌株的表現(xiàn)結(jié)果與甲基硫菌靈一致 (表1，圖6D～6F)。

綜合以上研究結(jié)果，說明β-微管蛋白上不同點(diǎn)突變的菌株對(duì)MBCs 和乙霉威的交互抗藥性結(jié)果不同，只有198 位從谷氨酸變成丙氨酸 (E198A)時(shí)，MBCs 與乙霉威之間才存在負(fù)交互抗性；而其他兩種突變?nèi)绠?dāng)198 位從谷氨酸變成谷氨酰胺(E198Q) 或200 位從苯丙氨酸變成酪氨酸 (F200Y)時(shí)，MBCs 與乙霉威均不存在負(fù)交互抗性。

3 結(jié)論與討論

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，M. fructicola 菌株對(duì)甲基硫菌靈的抗性與Tub2 蛋白上的3 種點(diǎn)突變有關(guān)，即E198A、E198Q 和F200Y，且每一株抗性菌株在Tub2 蛋白上只含有其中一種突變位點(diǎn)[7]。已有研究表明，該3 種突變菌株在22 ℃環(huán)境中，其生長(zhǎng)速率與敏感菌株均無差異[7]。而本研究結(jié)果表明，3 種突變菌株的生長(zhǎng)速率與溫度有一定關(guān)系，其中R(E198A)和R(F200Y)型菌株在4 種溫度下的生長(zhǎng)速率與敏感菌株之間均無差異；但R(E198Q)型菌株在不同溫度下表現(xiàn)不同，在低溫 (13 ℃) 和高溫 (28 ℃) 時(shí)，其生長(zhǎng)速率顯著低于其他3 類菌株，推測(cè)R(E198Q)型菌株在逆境中的競(jìng)爭(zhēng)力弱于其他抗性菌株及敏感菌株，該特性可能是R(E198Q)型菌株在田間很少被發(fā)現(xiàn)和報(bào)道的原因之一。

甲基硫菌靈和多菌靈是MBCs 的典型代表藥劑，其對(duì)病原菌的抑制活性存在一定差異，然而在生產(chǎn)實(shí)踐中，通常使用共同的區(qū)分濃度即50 μg/mL 作為 M. fructicola 抗性檢測(cè)的區(qū)分濃度[15,17]。本研究發(fā)現(xiàn)，在M. fructicola 中，抗MBCs的不同類型菌株對(duì)甲基硫菌靈和多菌靈的敏感性也存在一定差異。例如，在5 μg/mL 甲基硫菌靈處理中，R(E198Q)型菌株可以生長(zhǎng)，但同樣濃度的多菌靈處理則可以完全抑制R(E198Q)型菌株的生長(zhǎng)。研究者經(jīng)常采用較高的區(qū)分濃度進(jìn)行病原菌的抗藥性檢測(cè)，這可能導(dǎo)致R(E198Q)型菌株很少被報(bào)道。因此，為避免某些抗性菌株在研究中被漏檢，測(cè)定不同MBCs 時(shí)最好采用不同的區(qū)分濃度。針對(duì)M. fructicola 菌株對(duì)多菌靈的抗性檢測(cè)，其區(qū)分濃度建議降低為1 μg/mL，而對(duì)甲基硫菌靈進(jìn)行抗性檢測(cè)的區(qū)分濃度可以是1 μg/mL 或5 μg/mL。

乙霉威通常被作為MBCs 類藥劑的抗性治理藥劑，然而本研究發(fā)現(xiàn)，不同Tub2 突變位點(diǎn)引起的抗MBCs 菌株對(duì)乙霉威的敏感性不同。乙霉威和MBCs 的負(fù)交互抗性與M. fructicola 的Tub2 基因變異情況有關(guān)，只有Tub2 蛋白在198 位發(fā)生突變并且由谷氨酸突變?yōu)楸彼?(E198A) 時(shí)，該抗性菌株對(duì)乙霉威才表現(xiàn)為敏感；其他由E198Q 或F200Y 突變引起的抗MBCs 菌株，對(duì)乙霉威依然保持抗性狀態(tài)；說明乙霉威和MBCs的負(fù)交互抗性并不是存在于所有的抗MBCs 菌株中，因此，在生產(chǎn)中利用乙霉威治理M. fructicola對(duì)MBCs 的抗性時(shí)，首先需鑒定從相關(guān)區(qū)域分離獲得的抗性菌株的突變類型。Chen 等在研究M. fructicola 對(duì)多菌靈和乙霉威的敏感性時(shí)發(fā)現(xiàn)，所有抗多菌靈菌株對(duì)乙霉威均表現(xiàn)敏感，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，抗性菌株的Tub2 蛋白均攜帶E198A 突變[21]。該研究結(jié)果也可以為其他研究提供借鑒，例如在灰霉病菌抗藥性相關(guān)研究中，劉圣明等發(fā)現(xiàn)大量菌株對(duì)多菌靈和乙霉威均表現(xiàn)抗性，抗性頻率分別達(dá)到81.29%和93.53%，這可能與大部分抗多菌靈菌株未發(fā)生E198A 突變有關(guān)[22]。

綜上所述，在M. fructicola 對(duì)MBCs 產(chǎn)生抗性的3 類菌株中，R(E198Q)型菌株在溫度逆境中的生長(zhǎng)速率低于其他兩類抗性菌株及敏感菌株；不同類型抗性菌株對(duì)不同MBCs 藥劑的敏感性有所差異，因此，使用區(qū)分濃度檢測(cè)抗性菌株時(shí)對(duì)于不同藥劑需有所不同；不同類型抗性菌株對(duì)乙霉威的交互抗性不同，乙霉威與多菌靈的負(fù)交互抗性現(xiàn)象僅存在于R(E198A)型菌株中。本研究結(jié)果可為未來監(jiān)測(cè)M. fructicola 對(duì)MBCs 類藥劑的抗性發(fā)生發(fā)展情況以及制定有效的抗性治理策略提供理論支持，為有效控制褐腐病的流行和危害提供理論參考。