含嘧啶硫醚的嗜球果傘素類化合物的設(shè)計、合成及殺菌活性

郝樹林, 蔡增飛, 曹楊羊, 杜曉華

(浙江工業(yè)大學(xué) 催化加氫中心，浙江省綠色農(nóng)藥清潔生產(chǎn)技術(shù)研究重點實驗室，浙江省綠色農(nóng)藥協(xié)同創(chuàng)新中心，杭州 310014)

雜環(huán)化合物是新農(nóng)藥研究的重點之一，其中含氮雜環(huán)化合物占現(xiàn)有超高效農(nóng)藥品種的80%左右，嘧啶類尤為突出，如殺菌劑嘧菌酯、氟嘧菌酯、乙嘧酚磺酸酯，殺蟲殺螨劑嘧螨醚、嘧螨胺、環(huán)蟲腈和大部分磺酰脲類除草劑等[1-7]。此外，許多農(nóng)藥分子中含有取代烯烴和炔烴[7-9]，比如：殺蟲劑氟噻蟲砜，殺菌劑胺苯吡菌酮、雙炔酰菌胺、快螨特，除草劑烯草酮、丙炔氟草胺等(圖式1)。引入取代烯烴和炔烴，可通過氫鍵、π-π 效應(yīng)或者其他方式增強(qiáng)其與生物大分子間的作用，干擾生物大分子的功能。

嗜球果傘素類殺菌劑是以天然抗生素strobilurin A 為先導(dǎo)化合物開發(fā)的一類新型殺菌劑[10]。自從1996 年原ICI (捷利康，現(xiàn)先正達(dá)) 開發(fā)的全球第1 個甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑嘧菌酯上市以來，醚菌酯、肟菌酯和苯氧菌胺等數(shù)10 個品種陸續(xù)商品化，其中包括原沈陽化工研究院 (現(xiàn)中化沈陽農(nóng)研公司) 開發(fā)的丁香菌酯、烯肟菌酯、唑菌酯等和浙江省化工研究院開發(fā)的苯醚菌酯[7,9,11-16](圖式2)。

Strobilurin 類殺菌劑的作用機(jī)理主要是它們能結(jié)合在真菌的細(xì)胞色素b 的還原型輔酶Q 的氧化位點，通過阻止三磷酸腺苷 (ATP) 的產(chǎn)生，干擾真菌體內(nèi)的能量循環(huán)，從而抑制整個新陳代謝過程[17-18]。盡管該類殺菌劑作用機(jī)理相同，但是不同結(jié)構(gòu)的適用作物和防治對象、以及抗性發(fā)生情況還存在很大差別[7]，因此具有活性結(jié)構(gòu)的strobilurin類化合物仍值得繼續(xù)研究。本研究以嘧菌酯為先導(dǎo)化合物，通過活性亞結(jié)構(gòu)拼接，在分子中引入烯烴基嘧啶硫醚結(jié)構(gòu)片段，設(shè)計合成了一系列結(jié)構(gòu)新穎的化合物，并進(jìn)行了殺菌活性篩選。目標(biāo)化合物的設(shè)計和合成路線分別見圖式3 和圖式4。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Bruker Avance III 500 MHz 和Bruker 400 MHz核磁共振儀 (CDCl3或者DMSO-d6為溶劑, TMS作為內(nèi)標(biāo))。全部試劑均為市售分析純化學(xué)試劑。柱層析硅膠 (200～300 目) 產(chǎn)自青島海洋化工廠。97% 噻呋酰胺 (thifluzamide) 和 97% 嘧菌酯(azoxystrobin) 原藥由浙江化工研究院測試中心提供; 15% 7b 乳油 (EC) 由本課題組配制；250 g/L 嘧菌酯懸浮劑 (azoxystrobin 250 g/L SC，阿米西達(dá))產(chǎn)自英國先正達(dá)有限公司；25% 乙嘧酚懸浮劑(ethirimol 25% SC) 產(chǎn)自深圳諾普信農(nóng)化股份有限公司。

1.2 化合物合成

1.2.1 中間體6 合成方法 β-甲氧基丙烯酸甲酯活性基團(tuán)化合物6a ((E)-methyl 2-(2- (chloromethyl)phenyl)-3-methoxyacrylate) 參考文獻(xiàn)方法[14-18]合成；肟基乙酸酯化合物6b ((E)-methyl 2-(2-(bromomethyl) phenyl)-2-(methoxyimino) acetate) 參考文獻(xiàn)[19]合成；甲氧基氨基甲酸酯類化合物6c(methyl-2-(bromomethyl)phenyl(methoxy)carbamate) 參考文獻(xiàn)[20-21]合成。

1.2.2 中間體3 通用合成方法[22-23]將取代β-酮酸酯 (0.10 mol) 和硫脲 (0.12 mol) 加入 100 mL 無水乙醇中，室溫下攪拌，滴加30% 的乙醇鈉溶液(0.22 mol)，回流反應(yīng)12 h。在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上濃縮混合物，將殘留物溶解于80 mL 水中，滴加鹽酸調(diào)節(jié)至弱酸性 (pH=3～5)，析出固體。抽濾，用30mL 水洗滌濾餅，收集濾餅并烘干，得到化合物3。

1.2.3 中間體5 通用合成方法[24-28]將化合物3(0.10 mol) 和碳酸鉀 (0.12 mol) 加入50 mL DMF中，加熱到40 ℃，滴加4-溴-1,1,2-三氟-1-丁烯(4，0.11 mol)，滴加完畢后升溫至50～60 ℃反應(yīng)8 h。冷卻至室溫，將反應(yīng)液倒入150 mL 水中，攪拌下滴加鹽酸調(diào)至中性，析出固體。抽濾，洗滌，收集濾餅并烘干，得到化合物5。

其中5e、5g 和5h 為已知化合物，5a～5d、5f和5i 是新化合物。5a～5i 的結(jié)構(gòu)表征結(jié)果見表1。

表1 化合物 5a～5i 的理化數(shù)據(jù)及 1H NMR 譜圖Table 1 Physical properties, 1H NMR of compounds 5a-5i

1.2.4 目標(biāo)化合物7 通用合成方法[29-30]將化合物5 (10.0 mmol) 和碳酸鉀 (12.0 mmol) 加入20 mL DMF 中，室溫攪拌0.5 h，分批加入化合物6 (10.5 mmol) 后升溫至85 ℃ 繼續(xù)反應(yīng)8 h。冷卻至室溫，將反應(yīng)液加入到60 mL 水中，用乙酸乙酯 (3 × 30 mL) 萃取，合并有機(jī)層，用食鹽水(2 × 20 mL)洗滌，無水硫酸鎂干燥。過濾，濾液濃縮，粗品經(jīng)柱層析 (V (乙酸乙酯) : V (石油醚) =1 : 8) 分離，得到目標(biāo)化合物7a～7v。

1.2.5 化合物15% 7B EC 制備方法 分別將39 g化合物7B、13 g 乳化劑70B、22 g 乳化劑1602、13 g 乳化劑2507 和163 g 溶劑ND-60 加入混合釜中，熱水浴中加熱攪拌溶解，混合均勻，即可得到15% 7B EC。

1.3 殺菌活性測試

1.3.1 室內(nèi)抑菌活性 供試靶標(biāo)為：黃瓜白粉病菌Sphaerotheca fuliginea、黃瓜霜霉病菌Pseudoperoniospora cubensis、黃瓜灰霉病菌Botrytis cinerea 和水稻紋枯病菌Rhizoctonia solani[31]。

準(zhǔn)確稱取目標(biāo)化合物7 (精確至0.000 1 g)，用含1%吐溫-80 的DMF 溶解，配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的母液，用蒸餾水稀釋后備用。生物活性普篩和初篩測定均采用盆栽活體試驗法。各處理重復(fù)3 次 (參照創(chuàng)制農(nóng)藥生物活性評價SOP (殺菌劑卷))。試驗供試作物為培養(yǎng)至2 片真葉期的盆栽黃瓜苗 (品種為寶揚(yáng)5 號)和培養(yǎng)至兩葉一心的盆栽水稻苗 (品種為紹粳18) 。采用孢子懸浮液噴霧接種法測定藥劑對黃瓜白粉病菌和黃瓜霜霉病菌的殺菌活性；采用盆栽苗接菌絲塊法測定藥劑對黃瓜灰霉病菌和水稻紋枯病菌的殺菌活性。接種后的作物置于人工氣候室中培養(yǎng)，對以上病害分別培養(yǎng)7～8 d 后調(diào)查防效。噻呋酰胺作為防治水稻紋枯病菌的對照藥劑，嘧菌酯作為防治黃瓜霜霉病菌、黃瓜灰霉病菌和黃瓜白粉病菌的對照藥劑，質(zhì)量濃度均為200 mg/L。

1.3.2 防治黃瓜白粉病田間試驗 田間小區(qū)試驗地點為河北省保定市日光溫室，時間為2019 年12 月中下旬，越冬黃瓜 (“津綠2110”，對白粉病感病)。供試藥劑為15% 7b EC，處理劑量分別為有效成分 225.00、281.25 和 337.50 g/hm2，以 250 g/L 嘧菌酯SC (處理劑量為有效成分281.25 g/hm2) 和25%乙嘧酚SC (處理劑量為有效成分300.00 g/hm2)為對照藥劑。試驗地水肥條件較好，栽培管理條件一致。于黃瓜定植后52 d、在白粉病極零星發(fā)生時開始莖葉噴施藥液，施藥液量為900 L/hm2(滿架)。試驗設(shè)12 個處理，每個處理設(shè)3 次重復(fù)，共36 個小區(qū)，小區(qū)隨機(jī)區(qū)組排列，每小區(qū)1 架兩行種植 54 棵，1.3 m × 11 m = 14.3 m2。每個處理3 次重復(fù)對應(yīng)3 個小區(qū)，面積為42.9 m2，噴水量 4 L (滿架)。

根據(jù)《農(nóng)藥田間藥效試驗準(zhǔn)則》[32]中的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，以病情指數(shù)計算藥劑的防治效果，并用鄧肯氏新復(fù)極差法進(jìn)行顯著性測定。病害分級[32]：0 級：無??；1 級：病斑面積占整個葉面積小于5%；3 級：病斑面積占整個葉面積的6%～10%；5 級：病斑面積占整個葉面積的11%～20%；7 級：病斑面積占整個葉面積的21%～50%；9 級：病斑面積占整個葉面積的51%以上。按公式(1)～(3)計算病葉率、病情指數(shù)及防治效果。

式中：CK0為空白對照區(qū)施藥前病情指數(shù)；PT1位藥劑處理區(qū)施藥后病情指數(shù)；CK1為空白對照區(qū)施藥后病情指數(shù)；PT0位藥劑處理區(qū)施藥前病情指數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 目標(biāo)化合物的合成

以取代β-酮酸酯為起始原料，在堿性條件下與硫脲反應(yīng)生成嘧啶硫醇；根據(jù)硫原子和氧原子親核能力的差異，與不飽和鹵代烯烴發(fā)生選擇性反應(yīng)，得到不飽和烯烴嘧啶硫醚中間體5；然后其與甲氧基丙烯酸酯類芐鹵中間體6 發(fā)生親核取代反應(yīng)得到目標(biāo)化合物7a～7v。其結(jié)構(gòu)表征數(shù)據(jù)見表 2 和表 3。

在合成中間體5 時，如果反應(yīng)條件選擇不當(dāng)，就可能存在鹵代物接到嘧啶5 位的氧原子上，或者硫和氧原子均可能與鹵代物發(fā)生反應(yīng)。根據(jù)同族元素中硫和氧原子給電子能力和電負(fù)性的差異，通過多個反應(yīng)條件和反應(yīng)溫度的探索，最終選擇以DMF 作為溶劑，碳酸鉀為縛酸劑，反應(yīng)溫度控制在50～60 ℃，可以高選擇地得到中間體5；如果堿性太強(qiáng)，反應(yīng)溫度高于60 ℃，嘧啶4 位氧原子與鹵代物發(fā)生的副反應(yīng)產(chǎn)物則明顯增加[33-34]。

2.2 目標(biāo)化合物圖譜剖析

以目標(biāo)化合物 7a 的1H NMR 和13C NMR 數(shù)據(jù)為例進(jìn)行說明。δ 7.63 的單峰為β-甲氧基丙烯酸甲酯活性基團(tuán) C＝CH 氫；δ 7.42～7.44、δ 7.30～7.34 和 δ 7.11～7.14 間的多重峰為 3 個苯環(huán)氫；δ 6.47 的單峰為嘧啶環(huán)上5 位氫；δ 5.23 的單峰為與苯環(huán)相連的亞甲基上2 個氫；δ 3.79 的單峰為酯基 COOCH3上 3 個氫；δ 3.58 的單峰為烯醚C＝CHOCH3上甲基的 3 個氫；δ 3.24～3.26 三重峰為三氟丁烯基與硫原子相連的亞甲基上2 個氫；δ 2.69～2.78 間的多重峰為三氟丁烯基上與雙鍵相連的亞甲基上2 個氫；δ 2.31 的單峰嘧啶環(huán)6 位甲基上3 個氫。δ 168.84 嘧啶環(huán)上2 位碳原子；δ 168.14 嘧啶環(huán)上 4 位碳原子；δ 166.83 嘧啶環(huán)上6 位碳原子；δ 102.28 嘧啶環(huán)上5 位碳原子；δ 168.63 羰基碳原子；δ 160.63 和 108.73 為苯環(huán)上相連的烯鍵碳原子；δ 153.23 與兩個氟原子相連的烯烴端位碳原子的多重峰；δ 127.95 與一個氟原子相連的烯烴碳原子的多重峰；δ 135.01, 132.41,131.16, 128.15, 127.73, 127.47 為苯環(huán)上碳原子峰；δ 65.68 為苯環(huán)相連的亞甲基碳原子峰；δ 61.72 為酯基上甲基碳原子峰；δ 51.12為烯鍵相連的甲氧基上甲基碳原子峰；δ 26.03 為含硫亞甲基碳的峰；δ 25.49 為三氟丁烯上靠近雙鍵的亞甲基上碳的dd 峰，J = 26.3 Hz, J = 2.5 Hz；δ 23.13 為嘧啶環(huán)上相連的甲基碳的峰。

2.3 殺菌活性

室內(nèi)殺菌活性測定結(jié)果顯示：在200 mg/L下，所有目標(biāo)化合物對水稻紋枯病菌、黃瓜灰霉病菌和黃瓜霜霉病菌的抑制率在0～50%之間；化合物7a、7b 和7h 在200 mg/L 下對黃瓜白粉病菌的抑制率為100%，7i～7l 和7r 的抑制率≥80%，7f、7h、7k、7n、7s～7v 的抑制率 50%，7e、7g、7i 和7o～7q 均無抑菌活性。而在相同濃度下，對照藥劑噻呋酰胺對水稻紋枯病菌的抑制率為100%，嘧菌酯對黃瓜灰霉病菌、黃瓜霜霉病菌和黃瓜白粉病菌的抑制率分別為86%、95%和100%。以上數(shù)據(jù)表明，目標(biāo)化合物對黃瓜白粉病菌具有

一定或較好的殺菌活性。在此基礎(chǔ)上，對抑制率達(dá)到80% 及以上的化合物又進(jìn)行了生物活性初篩。結(jié)果 (表4) 表明：在100 mg/ L 時，化合物7b和7d 對黃瓜白粉病菌的抑制率分別為100%和82%；在50 mg/L 時7b 的抑制率仍達(dá)85%。

表2 目標(biāo)化合物7a～7v 的理化數(shù)據(jù)及高分辨質(zhì)譜Table 2 Physical properties, HRMS of compounds 7a-7v

表3 目標(biāo)化合物 7a～7v 的 1H NMR 和 13C NMR 數(shù)據(jù)Table 3 The 1H NMR and 13C NMR data of compounds 7a-7v

續(xù)表 3Table 3 (Continued)

2.4 結(jié)構(gòu)活性關(guān)系討論

從初篩數(shù)據(jù)可以發(fā)現(xiàn)，當(dāng)Q 為β-甲氧基丙烯酸甲酯 (Q1)、R1是甲基或者二氟甲基時，化合物7a～7d 對黃瓜白粉病菌的抑制活性較好，隨著官能團(tuán)變大，抑制率降低或者消失。當(dāng)Q 為肟基乙酸酯 (Q2) 和甲氧基氨基甲酸酯類 (Q3) 時，同樣發(fā)現(xiàn)隨著R1相對分子質(zhì)量變大和鏈變長，其對黃瓜白粉病菌的抑制作用越來越差或者消失。從表4數(shù)據(jù)可以發(fā)現(xiàn)，當(dāng)Q 為β-甲氧基丙烯酸甲酯 (Q1)、R1= CH3時，R2對黃瓜白粉病菌的抑制率順序是CH3(7b) ＞ H (7a) ＞ n-Bu (7c)。

2.5 化合物7b 的田間試驗結(jié)果

對初篩活性較好的化合物7b 進(jìn)行了田間試驗。15% 7b EC 分別按有效成分225.00、281.25和337.50 g/hm2的劑量噴施1 次，第7 天時調(diào)查發(fā)現(xiàn)：其對日光溫室內(nèi)黃瓜白粉病的防治效果分別為85.4%、88.0%和89.6%，與對照藥劑嘧菌酯在有效成分281.25 g/hm2下噴施1 次的防效(89.3%) 及乙嘧酚在有效成分300.00 g/ hm2下噴施1 次的防效 (90.4%) 相當(dāng)；但15% 7b EC 以有效成分225.00 g/hm2噴施2 次的防效 (85.8%) 顯著低于乙嘧酚 (281.50 g/hm2) 噴施2 次的防效 (91.8%)；而15% 7b EC 以有效成分281.25 和337.50 g/hm2噴施2 次的防效 (88.9%、91.8%) 則與乙嘧酚有效成分300.00 g/hm2噴施2 次的防效 (91.8%) 相當(dāng)(表 5)。

表4 部分化合物對黃瓜白粉病菌的初篩結(jié)果Table 4 Preliminary screening results of some compounds for Sphaerotheca fuliginea

表5 化合物7b 對日光溫室黃瓜白粉病藥效試驗結(jié)果Table 5 The results of field trials of 7b (15% EC) for Sphaerotheca fuliginea

3 結(jié)論

以嘧菌酯為先導(dǎo)化合物，通過活性亞結(jié)構(gòu)拼接等手段引入烯烴硫醚結(jié)構(gòu)，合成了22 個結(jié)構(gòu)新穎的化合物。室內(nèi)生物活性測試結(jié)果顯示，多個化合物對黃瓜白粉病菌具有較好的抑制率。田間試驗結(jié)果表明，化合物7b 在有效成分281.25 g/hm2時對黃瓜白粉病的防效與對照藥劑嘧菌酯 (281.25 g/hm2) 和對白粉病有特效[35]的乙嘧酚 (300.00 g/hm2)的防效相當(dāng)，具有進(jìn)一步研究的價值。本研究為新型烯烴嘧啶硫醚類化合物的設(shè)計與構(gòu)效關(guān)系研究提供了新思路。