高壓氧促進(jìn)小鼠脊髓損傷后功能恢復(fù)

廖小俊 李 蘭 陳亞星 文澤賢

脊髓損傷包括原發(fā)性和繼發(fā)性損傷，原發(fā)性損傷不可逆，治療重點(diǎn)在繼發(fā)性損傷[1]。高壓氧治療（hyperbaric oxygen，HBO）可減少脊髓損傷后繼發(fā)性損傷[2]，機(jī)制主要有減輕炎癥反應(yīng)、抑制神經(jīng)元凋亡、減輕脊髓水腫、促進(jìn)血管再生、促進(jìn)軸突再生等[3]。Nrf2具有神經(jīng)保護(hù)作用，是否參與HBO 治療脊髓損傷的機(jī)制，目前尚不清楚。本研究擬采用小鼠脊髓損傷模型，分析HBO治療對(duì)小鼠脊髓損傷后Nrf2的影響，進(jìn)一步探討HBO治療脊髓損傷的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組45 只成年雌性ICR 小鼠[購(gòu)于北京華阜康生物科技股份有限公司，體質(zhì)量（24±2）g]按隨機(jī)數(shù)字表法分為3 組假手術(shù)組（A 組，n=15）、模型組（B組，n=15）、HBO組（C組，n=15）。

1.2 動(dòng)物模型建立 腹腔注射4%水合氯醛（10 ml/kg）麻醉小鼠，以T11 棘突為中心，在背部正中做長(zhǎng)約2 cm切口，依次切開皮膚、皮下組織，切開椎旁肌向兩側(cè)分離，顯露T9～L1 椎體棘突及椎板。小鼠左側(cè)第13肋骨脊柱發(fā)出部位為T12與L1交界處，以此判定T11脊椎位置。咬除T11椎體棘突及背側(cè)椎板，血管夾從左右兩側(cè)將T11節(jié)段脊髓壓迫至0.2 mm[4]，持續(xù)15 s，保持脊膜完整，止血、縫合各層組織。假手術(shù)組只打開椎板，不損傷脊膜及脊髓。術(shù)后置于暖光燈下復(fù)蘇，蘇醒后BMS 評(píng)分0 分判斷為建模成功。術(shù)后分籠飼養(yǎng)，每天擠壓膀胱協(xié)助排尿2次。

1.3 HBO 治療方法及管理 將HBO 組小鼠置于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)高壓氧倉(cāng)，加壓10 min 使倉(cāng)內(nèi)壓力達(dá)到0.2 Mpa，倉(cāng)內(nèi)氧濃度達(dá)到95%以上，穩(wěn)壓吸氧40 min[5]，每日1次，共7 d。造模后護(hù)理：每日按壓膀胱排尿2次，間隔12 h，直至小鼠排便功能基本恢復(fù)。

1.4 小鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分 造模后1、7、28 d 采用BMS 評(píng)分法[6]評(píng)估小鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)情況，每組5只。將小鼠置于直徑100 cm、高30 cm的塑料盆持續(xù)觀察，按評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)相應(yīng)判分，0分表示后肢完全癱瘓，9分表示運(yùn)動(dòng)功能正常。

1.5 免疫熒光染色 造模后7 d取損傷部位脊髓組織及假手術(shù)組相應(yīng)部位脊髓組織行免疫熒光染色，每組5只。以4%多聚甲醛溶液灌注固定后，分離脊髓組織，4%多聚甲醛溶液4 ℃后固定24 h，30%蔗糖溶液脫水過夜，取出脊髓組織，以損傷部位為中心，前后各留取5 mm，剪去多余脊髓，冰凍切片，厚度14 μm。將切片于50 ℃烤箱中烘烤1 h，PBS 漂洗，4%多聚甲醛浸泡，1% Triton X-100 通透細(xì)胞膜，10%正常山羊血清封閉，滴加兔抗Nrf2 多克隆抗體（1∶200，美國(guó)Abcam 公司）4℃孵育過夜，滴加Cy3 標(biāo)記山羊抗兔IgG 抗體（1∶200，美國(guó)Beyotime 公司）37 ℃孵育2 h，DAPI 染色，抗熒光淬滅劑封片，激光共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果。

1.6 免疫印跡法檢測(cè)細(xì)胞核Nrf2蛋白表達(dá) 造模7 d，取損傷部位脊髓組織及假手術(shù)組相應(yīng)部位脊髓組織，每組5只。小鼠麻醉后快速取出脊髓組織，以損傷部位為中心，前后各留取5 mm，剪去多余脊髓。將脊髓標(biāo)本以細(xì)胞核蛋白抽提試劑盒抽提蛋白，BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒檢測(cè)濃度，濃度調(diào)定一致后等體積上樣，SDS-PAGE 電泳分離蛋白，濕轉(zhuǎn)到PVDF膜，封閉1 h，一抗4 ℃孵育過夜（Nrf2，1∶500）；二抗孵育2 h，化學(xué)發(fā)光液顯影，用Image Lab 軟件分析各條帶相對(duì)值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 20.0軟件分析；計(jì)量資料以±s表示，行單因素方差分析；檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠后肢功能評(píng)分比較 假手術(shù)組各時(shí)間點(diǎn)BMS 評(píng)分均為9 分，后肢運(yùn)動(dòng)功能無(wú)明顯異常。造模后1 d，模型組和HBO 組BMS 評(píng)分均為0 分，后肢完全癱瘓。造模7 d，模型組BMS 評(píng)分仍為0 分；HBO 組MBS評(píng)分明顯高于模型組（P＜0.05，表1），明顯低于假手術(shù)組（P＜0.05，表1）；提示后肢功能有所恢復(fù)。造模后28 d，模型組和HBO組BMS評(píng)分均明顯提高（P＜0.05，表1），HBO 組提高更明顯（P＜0.05，表1）。

表1 各組小鼠BMS評(píng)分比較（分）

2.2 免疫熒光染色結(jié)果 免疫熒光染色顯示細(xì)胞核為藍(lán)色，Nrf2為紅色。激光共聚焦顯微鏡觀察，各組細(xì)胞核染色無(wú)差別，假手術(shù)組Nrf2染色較弱，模型組Nrf2 染色明顯增強(qiáng)，可見脊髓損傷后Nrf2 表達(dá)增加。藍(lán)色細(xì)胞核與紅色熒光重疊表示Nrf2發(fā)生核移位，假手術(shù)組未見明顯Nrf2核移位，HBO組與模型組均可見部分細(xì)胞核藍(lán)色熒光與紅色熒光重疊，存在Nrf2 核移位；而且，HBO 組紅色熒光更強(qiáng)，發(fā)生Nrf2核移位更多，可見HBO明顯促進(jìn)Nrf2的表達(dá)及核移位。見圖1。

2.3 細(xì)胞核Nrf2 蛋白表達(dá)變化 HBO 組及模型組Nrf2 表達(dá)量均較假手術(shù)組明顯增加（P＜0.05，圖2），而且HBO組細(xì)胞核Nrf2表達(dá)量明顯高于模型組（P＜0.05，圖2）。這說明脊髓損傷后Nrf2 被激活發(fā)生核移位發(fā)揮生物學(xué)功能，HBO 干預(yù)可進(jìn)一步促進(jìn)Nrf2核移位。

3 討論

圖1 小鼠脊髓損傷后損傷脊髓組織Nrf2免疫熒光染色情況

圖2 高壓氧治療對(duì)脊髓損傷小鼠損傷脊髓組織Nrf2表達(dá)的影響

脊髓損傷后原發(fā)性損傷已不可逆轉(zhuǎn)，積極干預(yù)繼發(fā)性損傷是提高療效的關(guān)鍵。繼發(fā)性損傷的機(jī)制主要有炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、鈣超載、自由基形成等[7]。HBO 治療減輕神經(jīng)繼發(fā)性損傷包含多種機(jī)制：抑制白細(xì)胞介素-1、腫瘤壞死因子-α、基質(zhì)金屬蛋白酶-2、基質(zhì)金屬蛋白酶-9、核轉(zhuǎn)錄因子-κB等炎癥因子表達(dá)[8]，減輕炎癥反應(yīng)；抑制Caspase-3 表達(dá)，減少脊髓神經(jīng)元凋亡[9]；促進(jìn)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子表達(dá)，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[10]；促進(jìn)脊髓損傷后軸突再生、損傷區(qū)域血管重建、減輕脊髓水腫[11]。

Nrf2是一種細(xì)胞保護(hù)性轉(zhuǎn)錄因子，生理狀態(tài)下，與細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白keap1結(jié)合，存在于細(xì)胞漿中，無(wú)活性、易降解。當(dāng)細(xì)胞受到自由基、化學(xué)性物質(zhì)刺激時(shí)，keap1 被磷酸化或者Nrf2 直接被磷酸化，Nrf2與keap1解離進(jìn)入細(xì)胞核，與抗氧化反應(yīng)元件（antioxidative response element，ARE）啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，調(diào)控ARE 下游抗氧化酶及解毒酶表達(dá)，發(fā)揮抗腫瘤、抗炎、抗氧化、抗凋亡、清除自由基等作用[12]。另外，Nrf2具有抑制炎癥反應(yīng)、減輕膜性結(jié)構(gòu)氧化性損傷、保護(hù)血腦屏障、減輕腦水腫等神經(jīng)保護(hù)作用[13]。

本研究結(jié)果表明，小鼠脊髓損傷后HBO治療明顯促進(jìn)后肢運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)。這與既往文獻(xiàn)報(bào)道一致[14]。本文免疫熒光染色可見HBO組Nrf2核移位明顯增加，免疫印跡法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)HBO組細(xì)胞核Nrf2蛋白含量明顯增高。這與既往文獻(xiàn)報(bào)道相符[15]。

總之，HBO 治療顯著促進(jìn)小鼠脊髓損傷后神經(jīng)功能恢復(fù)，機(jī)制可能與促進(jìn)Nrf2表達(dá)及核移位有關(guān)。