胞外囊泡源性miRNA在膠質母細胞瘤中作用的研究進展

王明明 唐瑞天綜述 劉建雄審校

作者單位：730000 蘭州，甘肅中醫(yī)藥大學（王明明）；730000 蘭州，甘肅省人民醫(yī)院神經(jīng)外科（唐瑞天）；750000 銀川，寧夏醫(yī)科大學（劉建雄）

膠質瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見、最具侵襲性、預后較差的原發(fā)性惡性腫瘤，占顱內(nèi)腫瘤的50%～60%。膠質母細胞瘤（glioblastoma multiforme，GBM）屬于腦膠質瘤的一種，WHO 分級Ⅳ級，惡性程度最高，即使積極手術聯(lián)合放化療，GBM 治療效果仍然不佳，平均生存期大約17 個月[1]。本文就細胞外囊泡（extracellular vesicles，EV）源性微小RNA（micro-RNA，miRNA）的生物學特性及其在GBM 中的作用研究進展進行綜述。

1 EV的生物特性

EV是一類起源于細胞膜的微小顆粒，來源于激活CD4+和CD8+T 細胞抗原提呈細胞，依據(jù)起源、大小以及組成可分為凋亡體、外泌體、微泡、癌小體。凋亡體是最大的EV，大小1 000～5 000 nm，可促進細胞的程序性死亡。外泌體是一種最小的囊泡，通過質膜的外向出芽所形成，CD3 和CD9 被認為在外泌體形成中起關鍵作用[2]，直徑30～100 nm，形態(tài)大致為杯狀；也可起源于內(nèi)體膜的內(nèi)向出芽，多個的外泌體聚集形成多泡體。微泡起源于膜蛋白富積的質膜結構域，最具特征的外泌體能夠在細胞間進行信息交流，不僅在正常生理過程中起重要的作用，也參與病理的發(fā)生發(fā)展，進行信息交流的物質有蛋白質、DNA、miRNA、mRNA、脂質和非編碼RNA 等。癌小體，直徑1～10 μm，起源于膜泡脫落，其中細胞角蛋白18 最為富集[3]，含有大量的參與局部侵襲的生物活性分子，與腫瘤進展相關。

腦組織分泌的EV參與神經(jīng)元、膠質細胞以及內(nèi)皮細胞之間的信息傳遞，調節(jié)血腦屏障的形成，以及神經(jīng)系統(tǒng)的功能和神經(jīng)再生等。GBM 中EV 含有miRNA 信號，有小部分反映腫瘤細胞起源的miRNA，也有少量miRNA 在腫瘤EV 中特異性富積。3'端腺苷化的miRNA 在細胞中相對富集，而3'端尿苷化的miRNA主要存在于EV中。

2 miRNA的生物特性

miRNA 屬于一種家族性的微小非編碼RNA，大小約22 個核苷酸，可調控多種細胞功能，如細胞增殖、分化、凋亡、細胞周期和組織發(fā)育[4]。miRNA 主要通過減少目的基因的表達，減少互補結合的mRNA 的3'端非編碼區(qū)，導致mRNA 的快速衰變或阻止編碼蛋白質的表達。miRNA 由RNA 聚合酶Ⅱ（RNA polymerase Ⅱ，PolⅡ）通過蛋白編碼基因或者內(nèi)含區(qū)序列轉錄而來。雖然初級轉錄體通過DGosha-DGCR8 復 合 物，繞 過RNase Ⅲ，將 原 始miRNA切割為大小約70個核苷酸的莖環(huán)樣前體；再由RNase Ⅲ酶DICER1進一步加工成具有22個核苷酸的雙鏈miRNA，之后不穩(wěn)定的miRNA雙鏈加工修飾變成穩(wěn)定的成熟單鏈miRNA。

成熟miRNA 生成并裝載到argongaute 效應蛋白中，形成miRNA 誘導沉默復合物的核心，識別并結合mRNA 3'非編碼區(qū)，通過seed 序列互補介導基因沉默[5]或抑制表達，促進miRNA 靶點降解。由于mRNA 靶向的復雜性，miRNA 可以靶向很多個不同的mRNA。因此，單獨的一個miRNA 就能夠有規(guī)律性的調控復雜的生物過程。

3 EV與受體細胞的相互作用

研究表明，受體細胞在體外和體內(nèi)都對EV有很強的吸引力，EV似乎只是與它們特定識別的細胞相互作用。腫瘤來源的EV被器官特異性細胞內(nèi)化，導致腫瘤細胞轉移前的微生態(tài)改變[6]。EV與受體細胞相互作用的性質很關鍵，能通過直接刺激受體表面的受體而激發(fā)信號，并不需要進入受體細胞[7]。EV也可以直接與受體細胞的質膜融合，將其內(nèi)容釋放到細胞質中。這種細胞間轉移通過致癌受體導致細胞內(nèi)信號異常，進而導致受體細胞的轉化。因此靶細胞可通過內(nèi)吞作用把EV內(nèi)化，但需要一個初始受體介導的結合步驟，然后達到內(nèi)部化效應。在GBM的EV中，這種結合至少在一定程度上由硫酸肝素鈉蛋白多糖介導。一旦內(nèi)吞，EV可以通過與膜融合釋放其在細胞質中的包含物，也可以通過相鄰細胞間的連接，在細胞之間傳遞信號。

4 EV源性miRNA對微環(huán)境的調控

在GBM 中，EV 富集于幾種致癌miRNA，包括miR-21、miR-23a、miR-30a、miR-221 和miR-451。在GBM 細胞間信息的傳遞過程中，EV 介導的致癌miRNA 可能是調控腫瘤細胞增殖、侵襲和生存的重要機制。同時，GBM 中EV 源性miRNA 可以轉移到微環(huán)境中的非惡性細胞中，改變其表型，促進腫瘤進展。van der Vos 等[8]發(fā)現(xiàn)GBM 中EV 與小膠質細胞相互作用，傳遞miR-21、miR-451；小膠質細胞暴露于GBM的EV中，受體細胞中兩種miRNA水平升高，導致共同靶細胞原癌基因水平降低。

在GBM進展過程中，缺氧環(huán)境可導致腫瘤細胞內(nèi)應激反應通路的激活，導致mRNA和蛋白富積EV的產(chǎn)生。EV介導GBM和內(nèi)皮細胞之間的缺氧依賴性細胞間通信，導致腫瘤新生血管的強烈激活。因此，EV組成的變化及其在缺氧環(huán)境下的影響可能是由于GBM細胞中miRNA信號的改變。有研究表明，在缺氧過程中，miR-210 可以通過EV 分泌，直接影響內(nèi)皮細胞的反應。細胞miRNA 表達的變化可能在miRNA和蛋白組mRNA水平上影響EV的組成。

5 miRNA在GBM病理生理中的作用

GBM的miRNA表達失調，如miR-221表達顯著上調，miR-128、miR-181a和miR-181b表達下調，其中miR-181a 的下調會降低膠質瘤對放療的敏感性。同時，miRNA 影響多種細胞和分子途徑，如調控胰島素樣生長因子結合蛋白-3、金屬蛋白酶組織抑制因子等，進一步參與GBM的病理生理過程。

miRNA 可以通過促進腫瘤抑制基因的轉移和沉默在癌癥的發(fā)生和進展中發(fā)揮重要作用。有研究提示多種miRNA 在調控GBM 的發(fā)展和進程中具有致癌和抑癌的作用，如miR-543 通過金屬蛋白酶-9調控GBM，起到抑癌作用[9]。GBM叉頭蛋白M1的表達與miR-876-5p 呈負相關，叉頭蛋白M1 的下調導致miR-876-5p過表達，其抑癌作用更明顯[10]。GBM惡性增殖失控等顯著特征的發(fā)生，不只是蛋白質編碼基因信號通路的失活，也可能是基因間miRNA介導相互作用異常所導致。

6 miRNA對血管生成的調控

血管內(nèi)皮生長因子及其受體是腫瘤誘導血管生成的重要介質，如血管抑制素、內(nèi)皮抑制素、血栓反應蛋白-1、血栓反應蛋白-2等。血管的生成是內(nèi)皮細胞向微血管中萌發(fā)，為腫瘤細胞提供營養(yǎng)與氧氣的過程。血管生成與腫瘤細胞的浸潤在腫瘤生長和轉移方面成正相關，有基礎作用，更具有促進作用。腫瘤的缺氧環(huán)境易誘導腫瘤血管的生成。在新的血管形成過程中，間充質干細胞可分化為周細胞，最后遷移形成新的血管。然而間充質干細胞在GBM 中的血管生成和miRNA修飾機制尚不清楚[12]。有研究表明miR-299參與GBM血管生成過程，牛磺酸上調因子1通過直接與miR-299結合調控腫瘤血管的生成[12]。miR-137 可通過直接靶向組蛋白-賴氨酸N-甲基轉移酶的增強子，調控GBM的血管生成[13]。

7 miRNA對代謝的調控

代謝與腫瘤生長有關。miR-451 可作為GBM代謝和侵襲的強有力調控因子[14]。在高糖環(huán)境中，miR-451 在GBM 中保持高水平的表達，且通過直接靶向激活腺苷酸活化蛋白激酶的肝激酶B1，是腺苷酸活化蛋白激酶復合物的有效抑制劑。GBM 很顯著的特征之一是有氧糖酵解，也被稱為Warburg 效應。miRNA是一個控制細胞代謝相關基因的轉錄表達的關鍵性調控因子，可通過兩種方式調節(jié)GBM糖酵解代謝。首先，miRNA 可直接調控GBM，參與糖攝取和糖代謝基因的表達，如miR-106a抑制葡萄糖轉運蛋白3，促進糖酵解，提高葡萄糖通量。miRNAlet-7a 抑制M2 型丙酮酸激酶[15]，導致上游糖酵解中間體的積累。另外miRNA 可通過磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B 和RAS 通路調控受體酪氨酸激酶的信號轉導，間接調控糖酵解。

8 EV源性miRNA作為GBM生物標志物

單個多個microRNA 在腫瘤細胞和微環(huán)境中調控基因表達，可能是監(jiān)測GBM復發(fā)和化療反應的非常有價值的生物標志物。然而，最常用的檢測手段活檢術對GBM 腫瘤的異質性檢測準確度不高。在人的血液[16]、唾液、腦脊液、滑液、房水[17]等體液中可檢測到EV，可作為診斷和預后生物標志物。miR-21為GBM 中上調最多的miRNA 之一，通過誘導與caspase3活性，降低相關促凋亡蛋白表達，保護GBM細胞免受替莫唑胺誘導的凋亡。Qu 等[18]在meta 分析中指出，細胞外的miR-21可作為診斷腦腫瘤的生物標志物，其具有一定的準確性。

綜上所述，EV 源性miRNA 在受體細胞中的攝取和處理的機制尚不清楚，但在GBM 的生長、侵襲過程中具有重要作用。