DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3b對乳腺癌細胞微小RNA表達的影響

（北華大學醫(yī)學技術學院實驗中心，吉林 吉林 132013）

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，死亡率高，嚴重危害女性健康。乳腺癌的發(fā)生發(fā)展常受到多種基因的調(diào)控（原癌基因的激活和抑癌基因的失活），同時也受到一些表觀遺傳學因素［DNA甲基化和微小RNA（microRNA，miRNA）等］影響［1-3］。其中DNA甲基化的發(fā)生不僅可以影響腫瘤相關基因的表達變化，而且對位于CpG島附近或位于CpG島中的miRNA表達產(chǎn)生影響［4-6］。本研究探討抑制DNA甲基化和siRNA干擾DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3b（DNA methyltransferase 3b，Dnmt3b）后乳腺癌細胞MCF-7中miRNA和腫瘤相關基因的表達情況，旨在為乳腺癌的診斷和治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

人乳腺癌細胞株MCF-7購自中國科學院上海細胞生物學研究所，DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清和胰蛋白酶購于美國HyClone公司，轉(zhuǎn)染試劑購于美國QIAGEN公司，RNA提取、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量PCR試劑盒購于日本TaKaRa BIOINC公司，GAPDH抗體、DNA甲基化抗體購于英國Abcam公司，二抗購于中國博士德公司，抗熒光淬滅劑、Hoechst33258購于德國Sigma公司。siRNA由上海吉瑪公司合成，引物由上海生工生物有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 免疫熒光染色檢測MCF-7細胞甲基化水平：將蓋玻片過酸處理高壓滅菌后，放入24孔板中，接種MCF-7細胞，24 h后實驗組分別加入5-氮雜-2’-脫氧胞苷（5-Aza-2’-deoxycytidine，5-Aza-CdR），終濃度分別為5-Aza-CdR 10、5、1 μmol/mL；對照組加入等體積PBS，每24 h加入1次5-Aza-CdR，同時更換培養(yǎng)液，連續(xù)處理4 d。4 d后取出蓋玻片，PBS清洗3次，用5%多聚甲醛固定30 min，PBS清洗3次。用TritonX-100（0.2%）透化40 min，鹽酸（4N）酸化30 min，棄去液體后，用Tris鹽酸（pH8.0）中和20 min，PBS清洗3次。BSA（1%）4 ℃封閉過夜后，加入適量5-甲基胞嘧啶直接熒光抗體（1%BSA 1∶50稀釋），避光放置4 ℃過夜，PBS清洗3次，每次30 min。在適量Hoechst33258染色液（5 mg/L）中避光染色10 min，PBS避光清洗3次，每次5 min。將含抗熒光淬滅劑的封片劑DABCO滴于載玻片上封片，30 min內(nèi)熒光倒置顯微鏡下觀察，拍照并記錄。

1.2.2 siRNA轉(zhuǎn)染及細胞生長曲線繪制：MCF-7細胞用含有10%胎牛血清和90%DMEM培養(yǎng)液，置于37 ℃、5%CO2中培養(yǎng)。實驗分為空白對照組（Mock組）、陰性對照組（NC組）和干擾組（siRNA組）。針對Dnmt3b的siRNA-1511及其陰性對照序列如下：5’-CGCCUC AAGACAAAUUGCUTT-3 ’；5’-AGCAAUUUGUCUU GAGGCGTT-3’。轉(zhuǎn)染前1 d將細胞按照1×105/mL接種于24孔板中，每孔加入1 mL培養(yǎng)液。過夜貼壁后，每孔更換為400 μL無血清培養(yǎng)液待用。用100 μL無血清培養(yǎng)液稀釋80 ng siRNA，與3 μL轉(zhuǎn)染試劑混勻，室溫靜止5～10 min，輕輕將轉(zhuǎn)染復合物滴加至24孔板中，輕輕搖勻，轉(zhuǎn)染6 h后熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染情況，計算轉(zhuǎn)染效率。48 h后提取RNA檢測目的基因表達情況，96 h后檢測miRNA與相關基因表達情況。轉(zhuǎn)染前后連續(xù)5 d顯微鏡下計數(shù)細胞，繪制細胞生長曲線。

1.2.3 qRT-PCR檢測siRNA干擾后細胞Dnmt3bmRNA的表達：轉(zhuǎn)染48 h后提取NC組、Mock組、siRNA組細胞RNA逆轉(zhuǎn)錄，獲得的cDNA進行qRT-PCR擴增Dnmt3bmRNA，β-actin作為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法進行數(shù)據(jù)分析，引物序列見表1。

1.2.4 Western blotting檢測siRNA干擾后細胞Dnmt3b蛋白的表達：收集Mock組、NC組、siRNA組細胞，加入RAPI細胞裂解液，4℃裂解10 min，其間渦旋振蕩2次，30 s/次，4℃離心15 min，取上清，BCA法測定蛋白濃度。調(diào)蛋白濃度一致，進行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，半干法轉(zhuǎn)膜。封閉后加入Dnmt3b單克隆抗體（1∶100稀釋），內(nèi)參加入兔抗-GAPDH抗體（1∶200稀釋），慢搖1 h，用PBS-T洗膜3次，每次20 min。加入二抗（Dnmt3b 1∶3 000稀釋；GAPDH 1∶2 000稀釋），室溫孵育40 min，PBS-T洗膜1次，PBS洗膜2次，每次10 min。在顯影儀中滴加顯影液顯影，用Image J軟件對蛋白表達條帶進行光密度值的定量分析。

1.2.5 高通量測序檢測miRNA的表達情況：將細胞按1×105/mL接種于6孔板，每孔加入含10%胎牛血清的DMEM，3孔/組，分為實驗組和對照組，實驗組每孔加入終濃度5 μmol/mL的5-Aza-CdR，換液1次/24 h，并重新加入5-Aza-CdR。72 h后每孔加入1 mL Trizol將細胞完全裂解，miRNA高通量測序委托上海吉瑪公司進行。

1.2.6 qRT-PCR檢測mRNA和miRNA的表達：采用Trizol法提取RNA，檢測濃度與質(zhì)量，進行逆轉(zhuǎn)錄，qRT-PCR擴增，退火溫度及引物序列見表1、表2。以β-actin為內(nèi)參，采用2-△△Ct法計算各基因相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 16.0統(tǒng)計學軟件進行統(tǒng)計處理。計量資料用表示，組間比較采用t檢驗，P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

表1 引物序列Tab.1 Sequences of the primers used in the study

表2 miRNA引物序列Tab.2 Sequences of the primers targeting miRNA sequences used in the study

2 結(jié)果

2.1 5-Aza-CdR對細胞DNA甲基化水平的影響

熒光顯微鏡觀察MCF-7甲基化程度，結(jié)果可見，隨著5-Aza-CdR濃度的升高，5-甲基胞嘧啶甲基化抗體染色逐漸減弱，表示其整體甲基化水平逐漸降低。與對照組（59.37±8.45）比較，1、5、10 μmol/mL組（分別為34.30±9.47、5.11±2.78、4.99±2.64）甲基化水平均有統(tǒng)計學差異（均P＜ 0.05），但5 μmol/mL組與10 μmol/mL組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞ 0.05），因此后續(xù)實驗選用5 μmol/mL濃度5-Aza-CdR，見圖1。

2.2 siRNA轉(zhuǎn)染后細胞生長及Dnmt3b的表達

Western blotting結(jié)果顯示，siRNA干擾組中Dnmt3b的表達低于Mock組和NC組（P＜ 0.05），見圖2A、2B。qRT-PCR結(jié)果顯示，與對照組比較，siRNA干擾組Dnmt3b的表達顯著下降（P＜ 0.05），抑制達75%以上，見圖2C；細胞計數(shù)可見Mock組和NC組細胞生長速度相近，而與Mock組和NC組比較，siRNA干擾組細胞生長受到抑制（P＜ 0.05），見圖2D。說明siRNA轉(zhuǎn)染后顯著下調(diào)Dnmt3b的表達。

2.3 5-Aza-CdR處理、Dnmt3b siRNA干擾后癌基因和抑癌基因mRNA的表達

與對照組比較，經(jīng)5 μmol/mL 5-Aza-CdR處理后WWOX、MMP7表達顯著下調(diào)，TCF21、TIMP1表達顯著上調(diào)，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.05），見表3。與NC組比較，siRNA干擾組抑癌基因BRCA1、BRCA2及癌基因MMP7、survivin的表達均顯著下調(diào)（均P＜0.05），見表3。

2.4 高通量測序檢測5-Aza-CdR處理后miRNA的表達情況

高通量測序結(jié)果顯示，1 319個miRNA表達存在差異，其中，67個miRNA表達有統(tǒng)計學差異（均P＜0.05），見圖3。20個miRNA實驗組與對照組均有表達，見表4；47個miRNA對照組中無表達，見表5。

圖1 5-Aza-CdR處理后細胞DNA甲基化水平的改變×400Fig.1 Changes in DNA methylation levels in cells after 5-Aza-2’-deoxycytidine（5-Aza-CdR）treatment×400

圖2 siRNA干擾后細胞生長及Dnmt3b的表達Fig.2 Cell growth and DNMT3b expression after siRNA interference

2.5 qRT-PCR檢測5-Aza-CdR處理、Dnmt3b siRNA干擾后miRNA的表達情況

與對照組比較，經(jīng)5 μmol/mL 5-Aza-Cdr處理后miR-200a、miR-411、miR-382、miR-409、miR-493、miR-127、miR-520a、miR-654表達量顯著上調(diào)（P＜0.05），并且此8個miRNA的差異性表達與高通量測序結(jié)果一致。與NC組比較，siRNA干擾組中miR-29b、miR-506、miR-200a、miR-203b、miR-409、miR-520a、miR-654的表達顯著上調(diào)，而miR-200b、miR-127的表達顯著下調(diào)（均P＜ 0.05），見表6。

3 討論

miRNA來源于細胞核內(nèi)基因組的miRNA基因，部分miRNA位于CpG島附近或位于CpG島中，這些miRNA表達極易受到DNA異常甲基化的調(diào)控［7-9］。miRNA的異常表達與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關，盡管完整的miRNA表達調(diào)控機制目前尚不清楚，但已有研究提示腫瘤細胞中DNA甲基化異常會引起miRNA表達改變。HASHIMOTO等［10］研究顯示胃癌組織和細胞中miR-181c基因CpG島高甲基化，而miR-181c低表達，經(jīng)5-Aza-CdR處理后miR-181c表達恢復，同時抑制了胃癌細胞增殖。在DNA甲基化過程中，DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNA methyltransferase，Dnmt）參與催化，其包含Dnmt1、Dnmt3a和Dnmt3b等，其中Dnmt3b參與CpG從頭甲基化［11］。有研究［7］表明乳腺癌組織中Dnmt3b表達增加，并且與腫瘤分期及預后相關。本研究通過5-Aza-CdR抑制乳腺癌細胞整體甲基化水平，結(jié)果顯示，miR-200a、miR-411、miR-382、miR-409、miR-493、miR-127、miR-520、miR-654的表達顯著上調(diào)，而僅干擾Dnmt3b表達時，miR-29b、miR-506、miR-200a、miR-203b、miR-409、miR-502a、miR-654表達顯著上調(diào)，miR-127、miR-200b表達顯著下調(diào)，此結(jié)果與高通量測序結(jié)果基本一致。有研究［13-14］表明miR-29家族可調(diào)控Dnmt3a和Dnmt3b的表達。由此可見，Dnmt3b會受到miRNA的調(diào)控，也可以改變部分miRNA基因甲基化狀態(tài)，從而影響它們的轉(zhuǎn)錄表達。

表3 5-Aza-CdR處理及Dnmt3b siRNA干擾后癌基因和抑癌基因mRNA的表達Tab.3 Relative mRNA expression of oncogenes and tumor suppressors after 5-Aza-2’-deoxycytidine（5-Aza-CdR）treatment and DNMT3b siRNA interference

圖3 5-Aza-CdR處理后MCF-7 miRNA高通量測序差異表達Fig.3 Identification of differentially expressed miRNAs after 5-Aza-2’-deoxycytidine（5-Aza-cdR）treatment

表4 高通量測序中miRNA差異表達Tab.4 Differential expression of miRNAs determined via high-throughput sequencing

表5 高通量測序中對照組不表達的miRNATab.5 List of miRNAs not expressed in the control group as determined via high-throughput sequencing

表6 5-Aza-CdR處理及Dnmt3b siRNA干擾后miRNA的表達Tab.6 Relative expression levels of miRNA after 5-Aza-2’-deoxycytidine（5-Aza-CdR）treatment and DNMT3b siRNA interference

乳腺癌的發(fā)生發(fā)展與癌基因的表達增高和抑癌基因的沉默密切相關，Dnmt3b作為甲基化的催化劑可以影響部分基因表達的功能。已有研究表明，在癌組織中抑癌基因WWOX、TCF21、BRCA1、BRCA2［15-20］表達下降，而癌基因MMP7［21］、TIMP1［22］、PKM2［23］、survivin［24］表達增高。本研究中5-Aza-CdR可以使乳腺癌細胞中抑癌基因WWOX和癌基因MMP7表達降低，而上調(diào)抑癌基因TCF21和癌基因TIMP1，其中TCF21和MMP7的表達符合預期結(jié)果，而WWOX和TIMP1的結(jié)果分析原因可能是由于轉(zhuǎn)錄后調(diào)控影響這些基因的表達。對于siRNA干擾抑制Dnmt3b的表達中可見癌基因TIMP1、PKM2、survivin的表達顯著降低，而抑癌基因WWOX、TCF21、BRCA1、BRCA2的表達也降低，分析原因可能是由于甲基化程度與組織特異性的關系存在多樣化，雖然這些基因在前列腺癌、肺癌、大腸癌甚至乳腺癌中甲基化程度較高，但實驗中所培養(yǎng)的細胞種類不同、腫瘤的分期進展不同、腫瘤的組織種類不同，其甲基化水平也不相同。另外本研究僅對Dnmt3b進行干擾抑制Dnmt3b的表達，推測Dnmt3b對WWOX、TCF21、BRCA1、BRCA2的表達影響較小，并不占主要調(diào)控位置，其他甲基轉(zhuǎn)移酶是這些基因發(fā)生甲基化的主要因素，目前研究者對乳腺癌易感基因的甲基化研究還不夠成熟，往往出現(xiàn)矛盾的結(jié)果，具體原因還有待進一步探討。

綜上所述，Dnmt3b可影響乳腺癌細胞相關基因WWOX、TCF21、BRCA1、BRCA2、MMP7、TIMP1、PKM2、survivin及miR-29b、miR-506、miR-200a、miR-200b、miR-203b、miR-409、miR-127、miR-520a的表達。DNA甲基化是一種可逆的表觀遺傳學修飾方式，逆轉(zhuǎn)與腫瘤發(fā)生發(fā)展相關的miRNA基因甲基化水平將改變腫瘤細胞的生物學特性，為腫瘤的精準治療提供新的方向［25］。本實驗從Dnmt3b對miRNA及mRNA的影響作用出發(fā)，應用siRNA干擾的方法改變Dnmt3b的表達，檢測乳腺癌相關miRNA及mRNA的表達情況，明確了Dnmt3b對miRNA及靶基因mRNA的相互調(diào)控機制，為乳腺癌的臨床精確診治提供了依據(jù)。