原肌球蛋白3在雄性ApoE基因敲除小鼠動脈粥樣硬化組織中的表達

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院第二內(nèi)分泌科，沈陽 110004）

原肌球蛋白（tropomyosins，TPM）是微絲的重要組成部分，參與調(diào)節(jié)肌動蛋白細胞骨架，主要參與骨骼肌和平滑肌細胞的收縮或維持非肌細胞中細胞骨架的穩(wěn)定性［1］。TPM呈卷曲螺旋二聚體，沿著肌動蛋白絲形成頭對尾聚合物。目前，TPM中4種哺乳動物基因已確認，分別命名為TPM1、TPM2、TPM3和TPM4。因啟動子的多變性和外顯子的剪切，這4種基因至少可表達出40多種亞型［2］。這些亞型在分布和結(jié)構(gòu)上具有組織和肌絲特異性，與細胞形態(tài)和功能轉(zhuǎn)化有密切聯(lián)系，并且還調(diào)節(jié)其他蛋白質(zhì)（肌動蛋白解聚因子/共纖維蛋白和肌球蛋白）與肌動蛋白相互作用［3］。

TPM3是一種肌動蛋白結(jié)合蛋白，存在于骨骼肌、平滑肌和一些非肌肉組織中。骨骼肌中TPM3介導(dǎo)肌球蛋白-肌動蛋白對鈣離子的反應(yīng)，并參與細胞骨架微絲的穩(wěn)定［4］。有研究［5］報道癌癥發(fā)展伴隨著腫瘤細胞對TPM3依賴增加；膠質(zhì)瘤中表達較高水平的TPM3往往預(yù)后極差。肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）細胞系中擴增TPM3導(dǎo)致上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化上調(diào)和上皮鈣黏蛋白下調(diào)，而上皮鈣黏蛋白下調(diào)最終導(dǎo)致HCC遷移和入侵以及更差的預(yù)后［6］。細胞骨架是真核細胞中維持細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)和細胞運動有關(guān)的纖維網(wǎng)絡(luò)，它決定細胞形態(tài)，由微絲、微管和中間絲組成。細胞遷移是生物體的重要生命過程，需要細胞骨架參與，尤其是由肌動蛋白組成的微絲骨架的參與。肌球蛋白收縮、肌動蛋白聚合、細胞黏附都會影響細胞的遷移［7］。TPM3通過穩(wěn)定肌動蛋白絲結(jié)構(gòu)構(gòu)建細胞骨架，參與細胞運動［8-10］。

本課題組前期通過從單核細胞cDNA文庫中篩選出與雄激素受體相互作用的TPM3蛋白，并證實了二者在體外存在相互作用［11］。本研究建立脂蛋白E基因敲除（apolipoprotein E gene knockout，ApoE-/-）雄性小鼠動脈粥樣硬化模型，探討TPM3在動脈粥樣硬化組織內(nèi)表達情況，旨在為男性動脈粥樣硬化防治提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 動物模型建立及分組

6周齡ApoE-/-雄性小鼠（ApoE-/-組）和C57BL/6J雄性小鼠（C57BL/6J組）購自遼寧長生生物公司，每組6只，體質(zhì)量20～25 g，生長狀態(tài)發(fā)育良好，于中國醫(yī)科大學(xué)研發(fā)中心動物部SPF級實驗室（室內(nèi)溫度20～26 ℃，日溫差≤4 ℃，相對濕度40%～70%）高脂飼料（蛋白質(zhì)20%、脂肪35%、糖類45%，購自Research Diets公司）喂養(yǎng)，自由飲水，15周后處死。

1.2 主要試劑及儀器

小鼠TPM3單克隆抗體（ab113692，美國Abcam公司），通用SP試劑盒、DAB顯色試劑盒（中杉金橋公司），檸檬酸鈉抗原修復(fù)液（C1031，中國Solarbio公司），PBS磷酸鹽緩沖液（P1010，中國Solarbio公司），高脂飼料（D12336，美國Research diets公司）。

1.3 方法

1.3.1 動脈粥樣硬化標(biāo)本制備：取高脂飲食喂養(yǎng)后的雄性ApoE-/-小鼠和C57BL/6J小鼠主動脈降段血管，將標(biāo)本置入4%中性甲醛固定液中固定24 h。取出組織并切割合適大小后放入對應(yīng)脫水盒，做好標(biāo)記，室溫下依次經(jīng)過75%乙醇4 h、85%乙醇2 h、95%乙醇2 h、95%乙醇Ⅰ中2 h、95%乙醇Ⅱ中2 h、100%乙醇Ⅰ中20 min、100%乙醇Ⅱ中30 min、100%乙醇Ⅲ中30 min脫水。然后將脫水盒置二甲苯Ⅰ中15 min，后置入二甲苯Ⅱ中10 min，后放入二甲苯Ⅲ中10 min。然后入石蠟Ⅰ（熔點56 ℃）1 h、石蠟Ⅱ（熔點58 ℃）1.5 h浸蠟、包埋。修塊后4 ℃保存。

1.3.2 HE染色：（1）脫蠟水化，切片依次入二甲苯Ⅰ中5 min、二甲苯Ⅱ中5 min、二甲苯Ⅲ中5 min，再放入100%乙醇中5 min、95%乙醇中5 min、80%乙醇中5 min、70%乙醇中5 min后下行至雙蒸水10 min。（2）蘇木素染色，入蘇木素稀釋液20 min，自來水沖洗，入0.5%鹽酸分色數(shù)秒鐘。（3）伊紅染色：入蒸餾水中20 min、伊紅染液中染色2 min、95%乙醇分色。（4）透明封片，依次入100%乙醇Ⅰ中5 min、100%乙醇Ⅱ中5 min、二甲苯Ⅰ中5 min、二甲苯Ⅱ中5 min、用中性樹膠封片，標(biāo)記備用。（5）動脈內(nèi)膜厚度測量，切片在顯微鏡下仔細觀察并采集放大100倍時的圖像，在圓形動脈0時、1時30分、3時、4時30分、6時、7時30分、9時、10時30分時鐘方向的8個點上用ImagePro Plus 6.0軟件測量內(nèi)膜的厚度。然后計算內(nèi)膜厚度平均值。

1.3.3 免疫組化染色：將切片依次入二甲苯Ⅰ中15 min、二甲苯Ⅱ中10 min、二甲苯Ⅲ中5 min、100%乙醇中10 min、100%乙醇中10 min、95%乙醇中10 min、90%乙醇中10 min、85%乙醇中10 min、75%乙醇中10 min，下行至PBS中5 min。將脫蠟后的切片入檸檬酸鈉修復(fù)液微波修復(fù)15 min，自然冷卻至常溫，然后PBS溶液清洗。滴加100 μL內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑，37 ℃孵育20 min，后用PBS溶液清洗。滴加100 μL封閉用山羊血清，37 ℃孵育20 min。滴加100 μL一抗工作液 4 ℃過夜。滴加100 μL生物素標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG，37 ℃孵育20 min，然后PBS溶液清洗。滴加100 μL辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液，37 ℃孵育20 min然后PBS溶液清洗。滴加100 μL DAB顯色劑工作液，光鏡下出現(xiàn)棕黃色顆粒后終止顯色反應(yīng)。流動自來水充分沖洗5 min，蘇木素染液復(fù)染20 s。切片依次入75%乙醇中5 min、85%乙醇中5 min、90%乙醇中5 min、95%乙醇中5 min、100%乙醇中5 min、100%乙醇中5 min、二甲苯Ⅰ中5 min、二甲苯Ⅱ中10 min脫水透明。使用中性樹膠封片。顯微鏡下仔細觀察切片并采集放大100倍時圖像，TPM3陽性表達為細胞內(nèi)棕褐色或棕黃色、淡黃色顆粒。ImagePro Plus 6.0軟件測量斑塊內(nèi)陽性細胞積分光密度（integral optical density，IOD）值及面積，計算平均IOD值。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

采用Image-Pro Plus 6.0軟件統(tǒng)計動脈斑塊厚度及IOD，數(shù)據(jù)以表示，2組間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HE染色結(jié)果

結(jié)果顯示，ApoE-/-組雄性小鼠動脈內(nèi)皮細胞脫落，可見向腔內(nèi)凸起的斑塊，內(nèi)膜明顯增厚，中膜鈣化增生、平滑肌纖維排列紊亂，內(nèi)膜下平滑肌細胞可見增生、壞死，粥樣硬化斑塊非常明顯，并有泡沫細胞積聚。提示造模成功。C57BL/6J組雄性小鼠動脈內(nèi)膜光滑未見斑塊形成，見圖1。ApoE-/-組小鼠動脈內(nèi)膜厚度（46.375±17.898）μm，C57BL/6J組小鼠動脈內(nèi)膜厚度為（0.629±0.114）μm，2組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05）。

圖1 2組小鼠動脈組織HE染色結(jié)果×100

2.2 免疫組化染色結(jié)果

結(jié)果顯示，ApoE-/-組動脈粥樣硬化斑塊內(nèi)TPM3表達顯著。TPM3陽性表達為胞質(zhì)或胞膜內(nèi)的棕黃色顆粒，主要分布在內(nèi)皮細胞和含有泡沫細胞和平滑肌細胞等成分的斑塊組織內(nèi)部。C57BL/6J組雄性小鼠動脈經(jīng)過免疫組化染色后，觀察到動脈內(nèi)膜內(nèi)未見明顯 TPM3 蛋白表達，見圖2。動脈斑塊TPM3表達ApoE-/-組為0.099 6±0.020 7，C57BL/6J組為0.005 6±0.002 5，2組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

圖2 2組小鼠動脈組織免疫組化染色結(jié)果×100

3 討論

目前，心血管疾病仍是全球死亡的主要原因，每年有數(shù)百萬人因心血管疾病死亡。心血管疾病發(fā)生的主要原因是動脈粥樣硬化，而動脈粥樣硬化是一種逐漸發(fā)展的慢性炎癥性疾病，最終可導(dǎo)致嚴重的臨床表現(xiàn)（心肌梗死或中風(fēng)）［12］。已有研究顯示，動脈粥樣硬化形成發(fā)展涉及內(nèi)皮細胞［13］、血管平滑肌細胞［14］、巨噬細胞［15］、血小板和細胞因子［16］等，但發(fā)病機制尚未明確。

性別差異與動脈粥樣硬化的關(guān)系受到越來越多的關(guān)注。研究［17］顯示男性動脈粥樣硬化發(fā)生率高于女性；雄激素是男性體內(nèi)重要激素，臨床上以睪酮水平反應(yīng)雄激素水平，睪酮水平降低時男性動脈粥樣硬化發(fā)病率升高。雄激素依賴雄激素受體發(fā)揮作用；雄激素相關(guān)受體分布廣泛，心房、心室肌纖維，血管內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞均有表達。睪酮通過誘導(dǎo)一氧化氮生成釋放影響內(nèi)皮細胞功能，從而影響血管張力及斑塊形成［18］。也有研究［19-20］顯示睪酮也可能對凝血和纖溶系統(tǒng)、血管平滑肌細胞、單核巨噬細胞等產(chǎn)生作用來影響動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展。

本研究免疫組化結(jié)果顯示，TPM3陽性表達主要分布在斑塊的纖維帽。纖維帽內(nèi)包括內(nèi)皮細胞、巨噬細胞和平滑肌細胞等。TPM3作為關(guān)鍵的細胞骨架蛋白在雄性小鼠動脈粥樣硬化形成過程中表達，可能參與細胞遷移，從而促進動脈粥樣硬化的形成。有研究［21-23］表明，TPM3在胰腺癌、乳腺癌和食管癌中高表達，可能與癌細胞的轉(zhuǎn)移有關(guān)，其表達升高與不良預(yù)后相關(guān)。TPM3作為細胞骨架的組成成分是否參與動脈粥樣硬化的形成過程國內(nèi)外均未見報道。本研究顯示雄性ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化組織內(nèi)TPM3高表達，表明TPM3可能作為骨架蛋白參與細胞遷移，影響動脈粥樣硬化的形成過程。

綜上所述，雄性ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化組織內(nèi)存在TPM3蛋白表達，雄激素可能通過與TPM3蛋白相互作用影響細胞遷移來參與動脈粥樣硬化形成，但具體機制尚不明確，需要進一步研究論證。