一測(cè)多評(píng)法測(cè)定板藍(lán)根中6種化學(xué)成分的含量

黃 遠(yuǎn)，董福越，李楚源，王德勤

廣州白云山和記黃埔中藥有限公司，廣東 廣州 510515

板藍(lán)根為十字花科植物菘藍(lán)Isatis in digoticaFortune 的干燥根，主要含有木脂素類、生物堿類、核苷類等活性成分，具有清熱解毒、涼血利咽的功效[1]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，木脂素（lignan）具有抗病毒、抗炎、抗氧化、抗腫瘤和保肝等多種藥理活性和重要的應(yīng)用價(jià)值[2-9]。核苷（nucleoside）是中成藥抗病毒的活性成分[10-13]，在板藍(lán)根藥材中含量較高且易溶于水，對(duì)板藍(lán)根及其制劑的療效和質(zhì)量影響較大；板藍(lán)根的生物堿類（alkaloids）成分能夠抗炎、抗病毒、解熱[14]。然而，現(xiàn)行《中國(guó)藥典》板藍(lán)根的含量測(cè)定項(xiàng)下僅采用HPLC 測(cè)定水提液中的(R,S)-告依春的含量作為質(zhì)量控制指標(biāo)，對(duì)板藍(lán)根尚未建立完善的質(zhì)量控制方法[15-16]。因此，多成分、多指標(biāo)的控制方法對(duì)評(píng)價(jià)功效多樣、成分復(fù)雜的板藍(lán)根的質(zhì)量研究有重要意義[17-21]。本研究采用一測(cè)多評(píng)（QAMS）技術(shù)，選取價(jià)廉易得的生物堿類化合物(R,S)-告依春作為參照物，建立其與木脂素類化合物直鐵線蓮寧B 以及核苷類化合物胞苷、尿苷、鳥苷、腺苷的相對(duì)校正因子，實(shí)現(xiàn)通過(guò)只測(cè)定板藍(lán)根的(R,S)-告依春的含量，用校正因子計(jì)算出另外5 種木脂素類和核苷類成分的含量，從而簡(jiǎn)便快捷、全面準(zhǔn)確地對(duì)板藍(lán)根進(jìn)行多指標(biāo)的質(zhì)量評(píng)價(jià)，有助于保證該產(chǎn)品的質(zhì)量可控和療效穩(wěn)定，同時(shí)節(jié)約檢測(cè)成本和時(shí)間。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260 高效液相色譜儀（美國(guó)安捷倫公司）；UltiMate 3000 系列高效液相色譜儀（美國(guó)Thermo Scientific Technologies 公司）；Waters 2695高效液相色譜儀（美國(guó)Waters 公司）；色譜柱Agilent ZORBAX-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；色譜柱Waters Xbridge-C18（250 mm×4.6 mm，5μm）；色譜柱Phenomenex Kinetex-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；BT 214D 型電子分析天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；CP225D 型電子分析天平（Sartorius AG 公司）

圖2 混合對(duì)照品 (A) 與板藍(lán)根樣品 (B) 的HPLC 色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of mixed references (A) and sample (B)

1.2 試藥

對(duì)照品(R,S)-告依春（批號(hào)111753-201706，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.9%）、尿苷（批號(hào)110887-201803，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.5%）、鳥苷（批號(hào)111977-201501，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為93.6%）、腺苷（批號(hào)110879-201703，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.7%）均由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供，胞苷（批號(hào)B20073，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98%）由源葉生物有限公司提供，直鐵線蓮寧B（批號(hào)hysC201811，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99%）由廣州呼研所制藥有限公司提供。甲醇（色譜純，美國(guó)Tedia 公司），甲醇（分析純，廣州化學(xué)試劑廠），水為超純水。

板藍(lán)根（批號(hào)1807003、1805015、1808008、1805011、1805012、1805013、18wdct、18bjz、18nm、18dtly、18mLsb、18gjwzc、1805010、1806004、18nxgy、2017dq、1805014、18dtxh、18mLxt、18esyc、18dsc、18ftkfq、18gfc）由廣州白云山和記黃埔中藥有限公司提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相為水（A）-甲醇（B），梯度洗脫：0～3 min，3% B；3～20 min，3%～8%B；20～25 min，8%～22% B；25～35 min，22%B；35～36 min，22%～25% B；36～48 min，25%B；48～50 min，25%～90% B；50～60 min，90%B；體積流量0.8 mL/min；柱溫30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)254、230 nm；進(jìn)樣體積10 μL。色譜圖見(jiàn)圖1。

2.2 混合對(duì)照品溶液的制備

精密稱取 (R,S)-告依春、直鐵線蓮寧B、胞苷、尿苷、鳥苷和腺苷對(duì)照品適量，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成含(R,S)-告依春質(zhì)量濃度為 28.96、57.92、115.8、289.60、579.20 μg/mL，直鐵線蓮寧 B 質(zhì)量濃度為 3.2、6.4、12.7、25.4、63.6 μg/mL、胞苷質(zhì)量濃度為2.2、4.3、8.6、17.3、43.2 μg/mL，尿苷質(zhì)量濃度為3.8、7.7、15.4、30.7、76.8 μg/mL，鳥苷質(zhì)量濃度為3.8、7.8、15.5、31.0、77.6 μg/mL 和腺苷質(zhì)量濃度為2.8、5.6、11.2、22.4、56.0 μg/mL的混合對(duì)照品溶液，并于 4 ℃冰箱中避光保存，備用。

2.3 供試品溶液的制備

取板藍(lán)根藥材1 g（過(guò)60 目篩），精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入5%甲醇溶液25 mL，稱定質(zhì)量，超聲提?。?0～50 ℃，250 W，80 kHz）1 h，放冷，稱定質(zhì)量，用5%甲醇補(bǔ)足超聲過(guò)程減失的質(zhì)量，濾過(guò)，取續(xù)濾液，過(guò)0.22 μm 微孔濾膜，即得供試品溶液。

2.4 方法學(xué)驗(yàn)證

2.4.1 線性關(guān)系考察 分別精密吸取6 個(gè)系列濃度的混合對(duì)照品溶液，各 10 μL，注入高效液相色譜儀，按上述色譜條件測(cè)定，測(cè)定各對(duì)照品的峰面積，取平均值。以各溶液質(zhì)量濃度（X）對(duì)峰面積積分值（Y）進(jìn)行回歸處理，得(R,S)-告依春、直鐵線蓮寧 B、胞苷、尿苷、鳥苷和腺苷的線性方程和相關(guān)系數(shù)（R2）。結(jié)果表明，各對(duì)照品的進(jìn)樣量與峰面積均呈良好的線性關(guān)系（表1）。

表1 6 種成分的線性回歸方程Table 1 Linear regression equations of six components

2.4.2 精密度試驗(yàn) 精密吸取“2.2”項(xiàng)下的混合對(duì)照品溶液10 μL，按“2.1”項(xiàng)下條件，連續(xù)進(jìn)樣6 次。結(jié)果顯示在230 nm 下，(R,S)-告依春、直鐵線蓮寧B 的RSD 分別為0.33%、0.58%；在254 nm下(R,S)-告依春、胞苷、尿苷、鳥苷和腺苷的RSD分別為0.35%、0.58%、0.45%、0.41%、0.45%。

2.4.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取批號(hào)為1808008 的板藍(lán)根藥材，按照“2.3”項(xiàng)平行制備供試品溶液6 份，按“2.1”項(xiàng)下條件，進(jìn)行測(cè)定，在254 nm 下(R,S)-告依春、胞苷、尿苷、鳥苷和腺苷的RSD 分別為0.81%、1.56%、1.96%、1.65%、3.15%；在230 nm下(R,S)-告依春、直鐵線蓮寧B 的RSD 分別為1.04%，1.79%。

2.4.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取批號(hào)為1808008 的板藍(lán)根藥材，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，室溫放置，于0、8、12、16、20、24 h，按“2.1”項(xiàng)下條件進(jìn)樣測(cè)定，在254 nm 下(R,S)-告依春、胞苷、尿苷、鳥苷、腺苷的RSD 分別為0.85%、1.88%、1.36%、0.87%、6.84%；在230 nm 下，(R,S)-告依春、直鐵線蓮寧B 的RSD 分別為0.5%、1.72%。腺苷的峰面積在不同時(shí)間段波動(dòng)較大，說(shuō)明板藍(lán)根供試品溶液中(R,S)-告依春、直鐵線蓮寧B、胞苷、尿苷、鳥苷在室溫放置24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好，但是腺苷不穩(wěn)定。

2.4.5 加樣回收試驗(yàn) 取已測(cè)定的樣品（批號(hào)1808008）9 份，精密稱定，分別精密加入相當(dāng)于供試品中待測(cè)成分含量的50%、100%、150%的混合對(duì)照品溶液，按照“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算得到(R,S)-告依春、直鐵線蓮寧B、胞苷、尿苷和鳥苷的平均加樣回收率分別為 98.25%、99.57%、100.53%、102.29%、102.59%、99.30%，RSD 分別為 2.25%、2.45%、3.35%、1.62%、2.96%、2.79%。結(jié)果見(jiàn)2。

2.5 相對(duì)校正因子（fk/m）的建立

精密吸取混合對(duì)照品溶液5、10、15、20、30 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，每個(gè)濃度分別進(jìn)樣3 次，取平均值，記錄各對(duì)照品的色譜峰面積，根據(jù)fk/m計(jì)算公式[2-3]。計(jì)算待評(píng)價(jià)成分直鐵線蓮寧B、胞苷、尿苷、鳥苷、腺苷的相對(duì)校正因子（表2）。

fk/m＝fk/fm＝(Wk×Am)/(Wm×Ak)

Wk為(R,S)-告依春內(nèi)標(biāo)物的含量，Ak為(R,S)-告依春內(nèi)標(biāo)物的峰面積，Wm為被測(cè)指標(biāo)組分m的含量，Am為被測(cè)成分m的峰面積

2.6 fk/m 的耐用性評(píng)價(jià)

2.6.1 不同色譜柱對(duì)fk/m的影響 取“2.2”項(xiàng)下的混合對(duì)照品溶液，分別精密吸取10 μL，采用Agilent C18色譜柱，分別在Agilent 1260、Agilent 1100、Waters2695-2996 高效液相色譜儀上進(jìn)樣檢測(cè)，求算以(R,S)-告依春作為參照成分時(shí)，5 種成分的fk/m，結(jié)果說(shuō)明fk/m在使用不同儀器時(shí)的耐用性良好，結(jié)果見(jiàn)表3。

考察了Agilent ZORBAX C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Waters Xbridge C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Phenomenex Kinetex C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）共3 種色譜柱對(duì)各成分fk/m的影響。使用以上色譜柱各成分均能達(dá)到較好的分離效果，結(jié)果胞苷、尿苷、鳥苷、腺苷、直鐵線蓮寧 B 的 RSD 依次為 2.69%、3.41%、3.15%、3.09%、2.60%。表明色譜柱的更換對(duì)各成分fk/m無(wú)顯著影響（表3）。

表2 5 種成分的fk/mTable 2 Relative correction factors (fk/m) of five components

表3 不同色譜柱對(duì)fk/m 的影響Table 3 fk/m of different columns

2.6.2 不同流動(dòng)相體積流量對(duì)fk/m的影響 考察了不同體積流量（1.0、1.1、1.2 mL/min）對(duì)各成分fk/m的影響。結(jié)果表明（表4），各成分的RSD 依次為1.30%、0.33%、0.79%、1.00%、2.16%。表明體積流量的波動(dòng)對(duì)各成分fk/m無(wú)明顯影響。

2.6.3 不同儀器對(duì)fk/m的影響 考察了不同儀器（安捷倫1260、戴安U-3000、沃特世2695）對(duì)各成分fk/m的影響，結(jié)果（表5）各成分的RSD%依次為2.91%、3.11%、3.32%、4.16%、3.09%。表明儀器的更換對(duì)各成分fk/m無(wú)顯著影響。

表4 不同體積流量對(duì)fk/m 的影響Table 4 fk/m factor of different flow rates

表5 不同儀器對(duì)fk/m 的影響Table 5 fk/m of different instruments

2.7 色譜峰定位參數(shù)考察

為了在僅采用(R,S)-告依春為對(duì)照品時(shí)，能夠確認(rèn)直鐵線蓮寧B、胞苷、尿苷、鳥苷、腺苷色譜峰的位置，從而通過(guò)獲得的相對(duì)校正因子同時(shí)計(jì)算另外5 種成分的含量，達(dá)到一測(cè)多評(píng)的目的，考察了采用不同儀器、不同色譜柱和不同實(shí)驗(yàn)人員時(shí)直鐵線蓮寧B、胞苷、尿苷、鳥苷、腺苷和 (R,S)-告依春色譜峰之間的保留時(shí)間差和相對(duì)保留時(shí)間2 個(gè)參數(shù)?？疾旖Y(jié)果發(fā)現(xiàn)，另外5 種成分和參照物 (R,S)-告依春之間的保留時(shí)間差波動(dòng)較大，而相對(duì)保留時(shí)間波動(dòng)較小，RSD 均小于5%（表6、7）。因此，可利用相對(duì)保留時(shí)間進(jìn)行定位。

表6 不同因素對(duì)保留時(shí)間差值的影響Table 6 Influence of different factors on retention time difference

表7 不同因素對(duì)相對(duì)保留時(shí)間的影響Table 7 Influence of different factors on relative retention time

2.8 QAMS 法與外標(biāo)法結(jié)果比較研究

采用了HPLC法，以(R,S)-告依春作為“一測(cè)多評(píng)”的參照成分，測(cè)定其在板藍(lán)根中的含量，并通過(guò)測(cè)得的直鐵線蓮寧B、胞苷、尿苷、鳥苷和腺苷的fk/m，分別計(jì)算出這5 種成分的含量。同時(shí)，使用外標(biāo)法測(cè)定了板藍(lán)根中(R,S)-告依春、直鐵線蓮寧B、胞苷、尿苷、鳥苷和腺苷的含量，將外標(biāo)法測(cè)定含量與QAMS 法計(jì)算的含量采用相對(duì)偏差法進(jìn)行比較，從而驗(yàn)證QAMS 法用于測(cè)定板藍(lán)根中的多種類成分測(cè)定的準(zhǔn)確性（表8）。

表8 QAMS 法與外標(biāo)法測(cè)定26 批藥材中6 種成分的比較Table 8 Comparison of determination of six components in 26 batches of medicinal materials by QAMS and ESM

3 討論

3.1 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇

本研究測(cè)定的化學(xué)成分種類較多，包括核苷類、生物堿類和木脂素類，共6 種化合物。采用DAD 全波長(zhǎng)掃描對(duì)照品溶液，分別對(duì)(R,S)-告依春、直鐵線蓮寧B、胞苷、尿苷、鳥苷、腺苷進(jìn)行紫外波長(zhǎng)掃描。結(jié)果顯示，(R,S)-告依春和胞苷、尿苷、鳥苷、腺苷在254 nm 處同時(shí)有較大吸收，(R,S)-告依春和直鐵線蓮寧B 在230 nm 處同時(shí)有較大的吸收，且干擾少，峰形良好，基線平穩(wěn)，因此檢測(cè)波長(zhǎng)最終設(shè)定為254 nm 和230 nm。

3.2 內(nèi)標(biāo)物和質(zhì)量控制指標(biāo)的選擇

現(xiàn)有QAMS 法測(cè)定(R,S)-告依春和核苷類成分的研究[1]，但是該方法選擇腺苷作為內(nèi)標(biāo)物，測(cè)定了(R,S)-告依春、鳥苷、尿苷、胞苷的含量。本研究發(fā)現(xiàn)腺苷并不穩(wěn)定，不適合作為內(nèi)標(biāo)物和質(zhì)量控制指標(biāo)成分；而其他核苷類成分和(R,S)-告依春較穩(wěn)定，板藍(lán)根中另一關(guān)鍵抗病毒性成分直鐵線蓮寧B 亦有良好的穩(wěn)定性，均可作為質(zhì)量控制指標(biāo)成分；且(R,S)-告依春與其他5 種成分都可實(shí)現(xiàn)同波長(zhǎng)下的較大吸收。因此，本研究選擇(R,S)-告依春為內(nèi)標(biāo)物，結(jié)果顯示各成分的相對(duì)校正因子穩(wěn)定，重現(xiàn)性良好。

3.3 QAMS 法用于板藍(lán)根質(zhì)量控制的合理性

本研究的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差表明，外標(biāo)法和QAMS 法計(jì)算的含量相似性極高，表明2 種含量測(cè)定方法計(jì)算得到的含量值之間無(wú)顯著性差異。此外，在不同高效液相色譜儀、不同色譜柱等條件下均有良好的重復(fù)性。板藍(lán)根中化學(xué)成分眾多，以外標(biāo)法測(cè)定各成分含量需要對(duì)照品的數(shù)量多，部分對(duì)照品價(jià)格昂貴且難以獲取，采用QAMS 法測(cè)定各成分含量能極大的減少對(duì)照品使用數(shù)量，節(jié)約成本，增加檢測(cè)便利性。因此，QAMS 法用于板藍(lán)根質(zhì)量控制具有極高的實(shí)用性、便利性和科學(xué)性。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突