基于RNA-seq 技術(shù)的羅氏沼蝦(Macrobrachium rosenbergii)不同組織轉(zhuǎn)錄組比較分析*

李喜蓮 顧志敏 慎佩晶 徐 洋 張宇飛 高 強(qiáng) 程海華 陳雪峰

(農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水漁業(yè)健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 浙江省淡水水產(chǎn)遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 浙江省淡水水產(chǎn)研究所 湖州 313001)

羅氏沼蝦(Macrobrachium rosenbergii), 又稱淡水長(zhǎng)臂大蝦、馬來西亞大蝦, 動(dòng)物學(xué)分類上屬于節(jié)肢動(dòng)物門(Arthropoda), 軟甲綱(Malacostraca), 十足目(Decapoda), 長(zhǎng)臂蝦科(Palaemonidae), 沼蝦屬(Macrobrachium), 在各種類型的淡水和半咸水中都能生活, 易養(yǎng)殖且體型肥大, 肉質(zhì)鮮美。因其適應(yīng)能力強(qiáng)、生長(zhǎng)速度快, 羅氏沼蝦已成為我國(guó)重要的淡水養(yǎng)殖蝦類之一。

近年來對(duì)羅氏沼蝦的研究主要包括遺傳多樣性研究, 性腺發(fā)育、基因克隆及生長(zhǎng)等方面的研究。其中在多樣性研究中, 以微衛(wèi)星為研究對(duì)象的如呂敏等(2019)研究異型雄性羅氏沼蝦遺傳多樣性, 戴習(xí)林等(2017)對(duì)種群 SSR 分析中樣本量及標(biāo)記量對(duì)遺傳多樣性指標(biāo)的影響進(jìn)行分析; 或?qū)Ω鞑煌后w進(jìn)行遺傳多樣性研究(董丁健等, 2020; 馮藝, 2018; 孫成飛等, 2015); 周曉敏等(2020)選取60 個(gè)SNP 位點(diǎn)對(duì)養(yǎng)殖群體和選育群體進(jìn)行多樣性研究。羅氏沼蝦雌激素相關(guān)受體(Estrogen-related receptor, ERR)成為研究卵巢發(fā)育的一個(gè)重要基因(趙苗鑫等, 2017; 劉金磊,2018; 劉金磊等, 2018)。藥物對(duì)性腺分化及發(fā)育的影響研究主要包括壬基酚(薛海波, 2010; 李郁嬌, 2011;朱春華等, 2017; Guo et al, 2019)、十氯酮(Lafontaine et al, 2016, 2017)及三丁基錫(薛海波, 2010; 李郁嬌,2011; 吳維福等, 2013)這三種藥物, 以期研究對(duì)羅氏沼蝦卵黃蛋白原基因表達(dá)以及性腺發(fā)育的影響。Stalin 等(2019)研究了鈷-60 射線對(duì)淡水對(duì)蝦生殖障礙的影響; Tan 等(2019)研究了羅氏沼蝦性別逆轉(zhuǎn)與雄激素腺(AG)的關(guān)系。羅氏沼蝦基因研究集中在免疫相關(guān)(劉偉利等, 2017; 江婷佳, 2017; 邱慶慶等, 2019)、性別相關(guān)(俞炎琴, 2013; 姜建萍等, 2019; Abayed et al, 2019)、生長(zhǎng)相關(guān)(葉成凱等, 2019; 邱慶慶, 2019;楊光等, 2020; Dong et al, 2020)和酶類(田榮等, 2016;張夏青等, 2016; 盧志杰等, 2019)。羅氏沼蝦生長(zhǎng)研究集中在藥物對(duì)生長(zhǎng)的影響(程安達(dá)等, 2019; 潘忠超等,2019; Tadese et al, 2020)、微生態(tài)制劑(朱光來等, 2019;趙臣澤, 2019)、生長(zhǎng)環(huán)境(戴習(xí)林等, 2016; 陳建酬等,2017; 何竺柳, 2018; 朱其建等, 2019; 張俊功, 2019;Chen et al, 2019; Dong et al, 2020; Manickam et al,2020)、飼料中不同配比(楊樹浩等, 2018; 楊景豐等,2019; 張劍偉等, 2019; 單凡等, 2019; 黃黎明等,2019; Feng et al, 2019)和不同品系生長(zhǎng)對(duì)比試驗(yàn)(蔣飛等, 2013, 2014, 2016)。

隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展, 轉(zhuǎn)錄組技術(shù)也應(yīng)用于羅氏沼蝦的研究中。郭梁等(2018)利用高通量測(cè)序技術(shù)和數(shù)字基因表譜等技術(shù)對(duì)感染螺原體的羅氏沼蝦進(jìn)行免疫通路相關(guān)基因及其差異表達(dá)分析, 獲得轉(zhuǎn)錄本43405 個(gè); 嚴(yán)賽峰等(2018)、李俊杰等(2018)和鄧澤森等(2018)對(duì)感染螺原體的羅氏沼蝦高通量測(cè)序結(jié)果開展了 SSR 位點(diǎn)、SNP 位點(diǎn)和重要免疫通路相關(guān) microRNA 研究和分析; 李威霖(2018)對(duì)羅氏沼蝦肢體再生組織進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組及其差異表達(dá)基因研究, 得到 Unigenes 總數(shù)目為 87783; 王傳聰?shù)?2018)對(duì)羅氏沼蝦肝胰腺組織轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果進(jìn)行 SSR 檢測(cè)與分析, 獲得15356 個(gè)SSR 位點(diǎn); 陳雪峰等(2019)采用Illumina HiSeqTM4000 高通量測(cè)序研究羅氏沼蝦卵巢發(fā)育四個(gè)時(shí)期卵巢組織的差異, 卵巢發(fā)育四個(gè)時(shí)期共獲得 95379 個(gè) Unigenes。Jiang 等(2019a)通過高通量測(cè)序技術(shù)研究了羅氏沼蝦雌性(ZW)、雄性(ZZ)和超雌個(gè)體(WW)的性腺差異。Pasookhush 等(2019)采用轉(zhuǎn)錄組技術(shù)分析了羅氏沼蝦幼蝦感染新型冠狀病毒的反應(yīng)。Jiang 等(2019b)對(duì)未成年雌蝦和成年雌蝦的眼柄組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析, 共獲得 53878 個(gè)Unigenes; Cao 等(2017)研究羅氏沼蝦正常樣本和WSSV 感染樣本的淋巴組織轉(zhuǎn)錄組, 分別獲得73658和72374 個(gè)Unigenes; Rao 等(2016)分別研究了羅氏沼蝦正常樣本和 WSSV 感染樣本的肝胰腺轉(zhuǎn)錄組, 共獲得 63584 個(gè) Unigenes。

本研究以羅氏沼蝦7 個(gè)組織(眼柄、肝臟、卵巢、鰓、心臟、肌肉、精巢)為研究對(duì)象, 采用新一代高通量測(cè)序技術(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析, 通過 Trinity 軟件組裝、數(shù)據(jù)庫功能注釋、基因表達(dá)差異分析和SSR、SNP 位點(diǎn)篩選, 獲得羅氏沼蝦分子遺傳信息, 以期為進(jìn)一步研究羅氏沼蝦遺傳多樣性、功能基因及基因表達(dá)差異提供理論數(shù)據(jù), 同時(shí)為深入研究羅氏沼蝦生長(zhǎng)阻滯現(xiàn)象提供一定的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)用羅氏沼蝦(Macrobrachium rosenbergii)樣品取自浙江省淡水水產(chǎn)研究所八里店綜合試驗(yàn)基地,體重為(5.34±1.22) g, 體長(zhǎng)為(6.13±0.42) cm。樣品經(jīng)解剖后取各組織(眼柄、肝臟、卵巢、肝臟、心臟、肌肉、精巢), 共7 個(gè)組織。每個(gè)組織取自3 個(gè)個(gè)體(見表 1)。將分裝好的樣品迅速投入液氮中速凍, 置于-80°C 冰箱中保存, 干冰運(yùn)輸。

表1 組織及樣品名稱列表Tab.1 List of tissue and sample names

1.2 方法

1.2.1 RNA 提取 各組織樣品均選用3 個(gè)個(gè)體的混合樣組織, 使用 TRIzol?試劑按照制造商的說明從各組織中提取總 RNA (Invitrogen), 使用 DNase I(TaKaRa)去除基因組DNA。使用Nanodrop ND-2000分光光度計(jì)(美國(guó)賽默飛)、Aglient 2100 分析儀器對(duì)總RNA 的純度、濃度和完整性進(jìn)行檢測(cè)。RIN 值＞7的RNA 用于下游實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 mRNA-seq 文庫構(gòu)建和Illumina 測(cè)序 使用mRNA-seq 樣品制備試劑盒(Illumina, San Diego, CA)按照試劑說明書步驟構(gòu)建了 mRNA-seq 文庫和Illumina 測(cè)序文庫。

1.2.3 質(zhì)量控制和從頭轉(zhuǎn)錄組組裝 使用Fast QC程 序 (http://www.bioinformatics. babraham.ac.uk/projects/fastqc/)檢查Illumina Hiseq 2500 平臺(tái)在校準(zhǔn)前產(chǎn)生的原始序列讀取的質(zhì)量。低質(zhì)量讀數(shù)低于閾值質(zhì)量20; 將長(zhǎng)度小于50 bp 的reads 以及包含適配序列、ploy-N 和來自原始數(shù)據(jù)的測(cè)序引物的reads 去除,得到干凈的reads同時(shí), 對(duì)質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)的誤差率%、Q30、GC-含量%和sequence 重復(fù)水平進(jìn)行了評(píng)價(jià)。所有的后續(xù)分析和注釋都依賴于高質(zhì)量的clean reads。

使用Trinity (v 2.8.5)軟件(https://sourceforge.net/projects/trinityrnaseq/)對(duì)質(zhì)控后的數(shù)據(jù)進(jìn)行從頭組裝,獲得轉(zhuǎn)錄本序列和Unigenes 序列。最后, 只有長(zhǎng)度≥300 bp 的unique contigs 才能用于組裝后的下游研究。

1.2.4 生物信息學(xué)分析 功能注釋。拼接得到的Unigenes 序列, 使用 BLASTX 比對(duì)(BLAST+2.7.1, 比對(duì)標(biāo)準(zhǔn): E 值不大于 1e-5)與非冗余蛋白數(shù)據(jù)庫(Non-Redundant Protein Sequence Database, NR)、SWISS-PROT 蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(Manually Annotated and Reviewed Protein Sequence Database, SWISS-PROT)、基因本體數(shù)據(jù)庫(Gene Ontology, GO)、直系同源蛋白數(shù)據(jù)庫(Cluster of Orthologous Groups of Proteins,COG), 京都基因和基因組百科全書 KEGG 數(shù)據(jù)庫比對(duì)。使用Trinity 軟件自帶的ORF 預(yù)測(cè)模塊進(jìn)行開發(fā)閱讀框(ORF)預(yù)測(cè)。

1.2.5 差異表達(dá)分析 通過 Bowtie2 軟件將 reads映射到組裝的 Unigenes 序列, 使用 RSEM 軟件根據(jù)比對(duì)結(jié)果來計(jì)算特定轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)量水平。衡量基因表達(dá)水平的標(biāo)準(zhǔn)為 RPKM 值(Reads per kilobase of exon model per million mapped reads), 即每一百萬條序列中, 每個(gè)基因以一千個(gè)堿基為單位, 比對(duì)上的reads 個(gè)數(shù)。

使用DE-Seq 軟件分析各個(gè)組織之間的差異表達(dá),從而找到差異基因組。以差異倍數(shù)(Foldchange)＞ 2 和假發(fā)現(xiàn)率(FDR)調(diào)整顯著性值≤0.05 為判斷Unigenes表達(dá)顯著性的閾值。利用GO、egg NOG、KEGG 或thology (KO)和KEGG 通路富集分析對(duì)DEGs 進(jìn)行分類, 并對(duì)潛在的生物學(xué)途徑中的DEGs 進(jìn)行評(píng)價(jià)。GO和KEGG 途徑富集分析中P 值小于0.05 的過程、功能或成分在DEGs 中被認(rèn)為存在顯著差異。

2 結(jié)果

2.1 原始測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)控及統(tǒng)計(jì)

羅氏沼蝦7 個(gè)不同組織測(cè)序共得到344151324 條原始序列, 質(zhì)控后得到有效RNA-seq 311475706 條。每個(gè)個(gè)體的測(cè)序量為6.65—9.04 Gb, 平均7.38 Gb。去除接頭序列, 截去連續(xù)4 個(gè)堿基平均質(zhì)量值低于20的部分, 舍去長(zhǎng)度少于 50 bp 的 reads。共得到311475706 條reads。過濾后每個(gè)個(gè)體的測(cè)序量為5.3—8.45 Gb, 平均6.60 Gb(見表2)。每個(gè)個(gè)體的測(cè)序量為每4 個(gè)堿基的平均質(zhì)量值均大于20。

表2 質(zhì)控后數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)表Tab.2 Statistics of data after quality control

2.2 轉(zhuǎn)錄本拼接

轉(zhuǎn)錄本拼接后共獲得 95220 個(gè) Unigenes, 總Unigenes 長(zhǎng)度為 101401098 bp?？偟霓D(zhuǎn)錄本數(shù)量為145717 個(gè), 總的轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度為 207379988 bp。每個(gè)Unigenes 的平均長(zhǎng)度為 1064.9 bp, 最長(zhǎng)的 Unigenes長(zhǎng)為36137 bp, N50 值為1553。大部分功能基因長(zhǎng)度分布在401—600 bp, 占比達(dá)到34.27%(見圖1)。

2.3 功能注釋

在NR、GO、COG、KEGG、SWSS-PROT 五個(gè)公共數(shù)據(jù)庫中對(duì)獲得的 95220 個(gè) Unigenes 進(jìn)行功能注釋, 其余未在NR 數(shù)據(jù)庫中找到的Unigenes 可能為新的蛋白。

根據(jù)GO 數(shù)據(jù)庫, 總共有18485 個(gè)基因被歸類到三個(gè)主要的GO 類別中: 生物過程、分子功能和細(xì)胞成分。其中, 以“細(xì)胞”(14938)、“細(xì)胞部分”(14925)、“細(xì)胞器”(10827)、“生物調(diào)節(jié)”(9861)為主(見圖 2)。

根據(jù)COG 功能分類分成26 類, 其中數(shù)量前三位的為功能未知 2172 個(gè)(13.56%), 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制 2070個(gè)(12.92%), 翻譯后修飾, 蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)換, 伴侶1660 個(gè)(10.36%)(見圖 3)。

圖1 組裝序列長(zhǎng)度分布圖Fig.1 Assembly sequence length distribution diagram

圖2 GO 統(tǒng)計(jì)二級(jí)統(tǒng)計(jì)圖Fig.2 Secondary chart of GO level 2

五個(gè)數(shù)據(jù)庫 NR、GO、COG、KEGG、SWSS-PROT分別注釋到 19881、18485、15798、9147、13684 個(gè)Unigenes, 在 NR 數(shù)據(jù)庫中比對(duì)注釋的信息最多, 注釋19881 個(gè)Unigenes, 占比達(dá)20.88%。在NR、GO、COG、KEGG、SWSS-PROT 五個(gè)數(shù)據(jù)庫中都注釋到的 Unigenes 有 7848 個(gè)(見圖 4)。

將基因根據(jù)參與的 KEGG 代謝通路分為 5 個(gè)分支(見圖5): 細(xì)胞過程(A, Cellular Processes), 環(huán)境信息處理(B, Environmental Information Processing), 遺傳信息處理(C, Genetic Information Processing), 代謝(D, Metabolism), 有機(jī)系統(tǒng)(E, Organismal Systems)。以上5 個(gè)分支中含量的最多的類型分別為: 全局和概率地圖(Global and overview maps), 轉(zhuǎn)化(Translation),單組織過程(Signal transduction), 運(yùn)輸和分解代謝(Transport and catabolism)、內(nèi)分泌系統(tǒng)(Endocrine system)。

2.4 差異基因表達(dá)分析

圖3 COG 分類統(tǒng)計(jì)圖Fig.3 COG classification statistical chart

圖4 注釋信息統(tǒng)計(jì)韋恩圖Fig.4 Annotate the information with statistical Venn diagrams

7 個(gè)不同組織鑒定到的mRNA 數(shù)量由多到少排序?yàn)? G(鰓) ＞ T(精巢) ＞ H(心臟) ＞ L(肝臟) ＞ E(眼柄)＞ O(卵巢) ＞ M(肌肉)(見圖 6)。在 7 個(gè)組織中共同表達(dá)的基因數(shù)為15260 個(gè)。

2.5 KEGG 通路分析

對(duì)羅氏沼蝦轉(zhuǎn)錄組的 KEGG 分析顯示, 9148 個(gè)Unigenes 被注釋到330 條KEGG 通路中, 其中代謝途徑(1578 個(gè))、核糖體(540 個(gè))、次生代謝物的生物合成(528 個(gè))通路數(shù)量居前三(見圖7)。

330 條通路中, 其中信號(hào)通路包括: PI3K-Akt 信號(hào)通路、Rap1 信號(hào)通路、催產(chǎn)素信號(hào)通路、Hippo信號(hào)通路、MAPK 信號(hào)通路、胰島素信號(hào)通路、雌激素信號(hào)通路、Ras 信號(hào)通路、甲狀腺激素信號(hào)通路、鈣信號(hào)通路、HIF-1 信號(hào)通路、FoxO 信號(hào)通路、生成信號(hào)通路、Wnt 信號(hào)通路、PPAR 信號(hào)通路、促性腺激素信號(hào)通路、趨化因子信號(hào)通路、Adipocytokine信號(hào)通路、點(diǎn)樣受體信號(hào)通路、ErbB 信號(hào)通路、mTOR信號(hào)通路、Jak-STAT 信號(hào)通路、T 細(xì)胞受體信號(hào)通路、p53 信號(hào)通路、腫瘤壞死因子信號(hào)通路、VEGF 信號(hào)通路、B 細(xì)胞受體信號(hào)通路、Notch 信號(hào)通路、催乳激素信號(hào)通路、NF-kappa B 信號(hào)通路、Fc epsilon RI信號(hào)通路等。

2.6 SSR 分析

在得到的95220 條序列中篩選SSR 位點(diǎn)共找到SSR位點(diǎn)37751 個(gè), 這些位點(diǎn)存在于25520 條序列中, SSR 發(fā)生頻率為 26.80%。其中單條序列中含多個(gè)SSR 位點(diǎn)的序列有7962 條, 復(fù)合型的SSR 位點(diǎn)3384 個(gè)。SSR 位點(diǎn)中單堿基重復(fù)、二堿基重復(fù)、三堿基重復(fù)、四堿基重復(fù)、五堿基重復(fù)、六堿基重復(fù)個(gè)數(shù)分別為 14919(39.52%)、14715(38.98%)、7577、488、32 和 20, 其中單堿基和二堿基重復(fù)含量居第一和第二位(見圖8)。

2.7 SNP 分析

對(duì)獲得的序列進(jìn)行 SNP 位點(diǎn)分析, 共發(fā)現(xiàn)3228575 個(gè) SNP 標(biāo)記(見表 3), 其中包括 C:G-＞A:T、C:G-＞G:C、C:G-＞T:A、T:A-＞A:T、T:A-＞C:G、T:A-＞G:C6中類型, 其中T:A-＞C:G 和C:G-＞T:A 這兩種堿基替換占比較高, 分別占總數(shù)的 33.45%和 33.36%。7 個(gè)不同組織中發(fā)現(xiàn)的SNP位點(diǎn)數(shù)量在鰓(23.12%)上最高, 其次是心臟(17.89%)、精巢(17.51%)和肝臟(16.28%), 在肌肉組織中的SNP 位點(diǎn)數(shù)量最少(5.43%)。

圖 5 KEGG 注釋Fig.5 The KEGG annotation

圖6 每個(gè)樣本鑒定得到的mRNA Upset 圖Fig.6 The upstate map of mRNA from each sample

圖 7 KEGG 通路列表(前20)Fig.7 The KEGG pathway list (Top 20)

圖8 SSR 位點(diǎn)的分布情況Fig.8 The distribution of SSR sites

3 討論

3.1 轉(zhuǎn)錄組技術(shù)在其他蝦上的應(yīng)用

隨著轉(zhuǎn)錄組技術(shù)的迅速發(fā)展, 轉(zhuǎn)錄組技術(shù)被應(yīng)用在水產(chǎn)動(dòng)物的研究中。其中蝦類轉(zhuǎn)錄組研究主要集中在差異基因的篩選和候選基因的發(fā)掘上。

紅、黃和透明3 種純色米蝦皮膚組織的轉(zhuǎn)錄組獲得 45434 條 Unigenes(林師, 2017)。波紋龍蝦肝胰腺和卵巢組織進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得Unigenes 共74124個(gè)(李斌等, 2016)。脊尾白蝦成蝦樣品及胚胎樣品共獲得 47574 條 Unigenes(孫政, 2012)。

表3 不同SNP 類型在各組織之間的分布情況Tab.3 Distribution of different SNP types among different tissues

紅螯螯蝦肝臟、精巢和卵巢組織共獲得了67369個(gè) Unigenes(李喜蓮等, 2019); 次級(jí)卵黃發(fā)生時(shí)期卵巢組織共得到69261 條Unigenes(康鵬飛, 2017)。

日本沼蝦正常性成熟的和性早熟的卵巢組織中共獲得63336 個(gè)Unigenes(江紅霞, 2017); 感染白斑綜合征病毒(WSSV)個(gè)體的肝胰腺轉(zhuǎn)錄組共獲得 64049個(gè) Unigenes(趙才源等, 2018); 亞硝酸鹽脅迫下肝臟共獲得19022 個(gè)Unigenes, 氨氮脅迫下肝臟組織共獲得 63453 個(gè) Unigenes (于杰倫, 2019)。

凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeus vannamei)五個(gè)早期發(fā)育時(shí)期(卵裂期、囊胚期、原腸期、肢芽幼體期發(fā)育至膜內(nèi)無節(jié)幼體期)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序, 共得到 66815 條Unigenes(隗健凱, 2015); 性腺組織獲得 Unigenes 65218 個(gè)(韋嬪媛, 2017); 低溫脅迫下肝胰腺組織獲得50921 條 Unigenes (董麗君等, 2019)。

本研究從正常個(gè)體 7 個(gè)組織轉(zhuǎn)錄組文庫中共獲得99520 個(gè)Unigenes, 這個(gè)數(shù)量較前人對(duì)于蝦類轉(zhuǎn)錄組研究得到的 Unigenes 數(shù)量都高, 這可能與分析的組織數(shù)量大、覆蓋面廣有一定的關(guān)系。

3.2 功能注釋

本研究從七個(gè)組織共獲得 Unigenes 99520 個(gè),N501553, 平均長(zhǎng)度為1064.9 bp。在五個(gè)數(shù)據(jù)庫中注釋到的Unigenes 共有20368 個(gè), 占到總數(shù)的21.39%,這比前人研究的轉(zhuǎn)錄組結(jié)果Unigenes 的注釋率都低。肝胰腺注釋率31%和35.31%, 卵巢31.46%和54.44%,眼柄29.3%, 淋巴器官29.46%, 再生肢體基部注釋率37.23%。估計(jì)與本研究中首次對(duì)羅氏沼蝦的心臟、肌肉、精巢和鰓等組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組高通量測(cè)序, 引入了較多在這幾個(gè)組織中特異表達(dá)的基因, 這些新獲得的序列在以上五個(gè)數(shù)據(jù)庫中得不到注釋, 從而降低了注釋率。還有部分序列未能被注釋, 可能與序列的長(zhǎng)度有關(guān), 過短的序列也會(huì)造成無法注釋和分類; 無法注釋的另一種可能是近緣物種序列信息的缺乏,導(dǎo)致無法通過同源序列比對(duì)得到注釋。

3.3 KEGG 通路

對(duì)羅氏沼蝦轉(zhuǎn)錄組的 KEGG 分析顯示, 9148 個(gè)Unigeness 被注釋到 KEGG 數(shù)據(jù)庫中并分布在330 個(gè)已知途徑中, 與免疫相關(guān)的通路如FoxO 信號(hào)通路和Rap1 信號(hào)通路。FoxO 轉(zhuǎn)錄因子家族在細(xì)胞生理事件中調(diào)控基因的表達(dá), 包括凋亡、細(xì)胞周期控制、葡萄糖代謝、氧化應(yīng)激抵抗和壽命。FoxO 蛋白的一個(gè)主要調(diào)控機(jī)制是對(duì)磷脂酰肌醇3 激酶(PI3K)下游的絲氨酸蘇氨酸激酶Akt/蛋白激酶B(Akt/PKB)進(jìn)行磷酸化,這是對(duì)胰島素或幾種生長(zhǎng)因子的反應(yīng)。FoxO 信號(hào)通路在本研究結(jié)果中涉及 93 個(gè) Unigeness。Rap1 是一種小型GTPase, 它控制多種過程, 如細(xì)胞黏附, 細(xì)胞-細(xì)胞連接的形成和細(xì)胞極性。Rap1 通過調(diào)節(jié)多種細(xì)胞類型中整合素等黏附分子的功能, 在細(xì)胞-細(xì)胞和細(xì)胞-基質(zhì)相互作用的控制中發(fā)揮主導(dǎo)作用。Rap1 還以高度依賴于細(xì)胞類型的方式調(diào)控 MAPK 活性。Rap1 信號(hào)通路在本研究中共涉及201 個(gè)Unigeness。這些結(jié)果的獲得都將為進(jìn)一步研究羅氏沼蝦抗性相關(guān)基因提供科學(xué)依據(jù)。

4 結(jié)論

本研究對(duì)羅氏沼蝦 7 個(gè)不同組織的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析, 獲得99520 個(gè)Unigenes, 這比單一組織或較少組織受到環(huán)境脅迫或細(xì)菌、病毒感染獲得數(shù)據(jù)具有較高的可信度, 這一結(jié)果將大大豐富羅氏沼蝦的基因數(shù)據(jù)庫資源。與此同時(shí), 20368 個(gè)Unigenes 在五大數(shù)據(jù)庫中得到注釋。各個(gè)組織間差異基因也得到進(jìn)一步的分析, 本研究還篩選得到大量的 SSR 位點(diǎn)和SNP 位點(diǎn), 這些分子標(biāo)記也將在后續(xù)羅氏沼蝦分析標(biāo)記的開發(fā)中起到重要的作用, 為進(jìn)一步深入挖掘和開發(fā)利用羅氏沼蝦功能基因提供參考。