厚殼貽貝(Mytilus coruscus)養(yǎng)殖海域與天然生長(zhǎng)海域的微生物群落比較研究*

李斯遠(yuǎn) 何治江 呂泓玥 湯秋晗 廖 智王健鑫 嚴(yán)小軍, 張曉林,

(1. 浙江海洋大學(xué)海洋科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 舟山 316022; 2. 浙江海洋大學(xué) 國(guó)家海洋設(shè)施養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心舟山 316022)

厚殼貽貝Mytilus coruscus 屬軟體動(dòng)物門Mollusca、雙殼綱 Bivalvia、異柱目 Anisomyaria、貽貝科Mytilidae、貽貝屬M(fèi)ytilus(葉瑩瑩等, 2011), 俗稱淡菜,為溫水性種, 主要分布在我國(guó)黃海、渤海和東海沿岸,以浙江沿海資源量最大。厚殼貽貝具有肉質(zhì)鮮美、營(yíng)養(yǎng)豐富、蛋白質(zhì)含量高、生長(zhǎng)繁殖快、抗病能力強(qiáng)、易于人工養(yǎng)殖等諸多優(yōu)點(diǎn), 是浙江舟山海域具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的養(yǎng)殖貝類之一(徐晴晴等, 2018)。目前厚殼貽貝主要養(yǎng)殖區(qū)域?yàn)檎憬鱼艉Ｓ蚝蜄|極海域。厚殼貽貝在養(yǎng)殖過程中, 對(duì)于海域環(huán)境中的藻類和微生物多樣性具有較強(qiáng)的依賴性; 一方面, 藻類是貽貝的主要食物來源(朱雨瑞等, 2010), 另一方面, 貽貝在養(yǎng)殖過程中對(duì)海域微生物群落具有特異的富集作用(陳瑜等, 2016), 但目前尚不清楚微生物群落對(duì)貽貝的養(yǎng)殖具有哪些影響。

但近年來, 隨著厚殼貽貝的養(yǎng)殖區(qū)域的不斷擴(kuò)展和養(yǎng)殖密度逐漸增加, 其養(yǎng)殖過程顯現(xiàn)種種問題,例如貽貝個(gè)體的肥滿度下降, 生長(zhǎng)速度下降, 貽貝逃苗和病害也時(shí)有發(fā)生(林永添, 2007)。有研究顯示, 微生物群落變化能夠影響貽貝的附著和防病(楊娜,2018; 梁簫等, 2020)。國(guó)內(nèi)外已有針對(duì)不同貝類生長(zhǎng)區(qū)海域浮游群落的調(diào)查研究(陳雷等, 2013; 尹潔慧,2013; 金雷等, 2015; Fogel et al, 2015), 但其主要焦點(diǎn)集中于海域中浮游植物的種類和豐度對(duì)貝類攝食以及營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的影響。關(guān)于海域微生物群落與貽貝生長(zhǎng)過程以及生理生化的影響尚未見報(bào)道。厚殼貽貝作為我國(guó)東部海域最重要的養(yǎng)殖貝類之一, 其生存環(huán)境的微生物群落調(diào)查以及與其體內(nèi)微生物群落的對(duì)比分析將對(duì)貽貝養(yǎng)殖具有重要研究意義。為此, 本文將針對(duì)厚殼貽貝生長(zhǎng)海域的微生物群落結(jié)構(gòu)特征及其體內(nèi)微生物組成開展研究, 以期為厚殼貽貝的健康、生態(tài)養(yǎng)殖提供重要的理論依據(jù)。

本研究主要以厚殼貽貝為對(duì)象, 首先將調(diào)查嵊泗縣枸杞島和東極鎮(zhèn)廟子湖島厚殼貽貝養(yǎng)殖區(qū)和野生區(qū)海域的微生物群落的結(jié)構(gòu)特征, 并與厚殼貽貝體內(nèi)分離到的微生物組成情況相結(jié)合進(jìn)行比較分析,以探明厚殼貽貝生長(zhǎng)海域的微生物群落分布特征以及養(yǎng)殖和野生生長(zhǎng)海域的微生物組成差異。本論文的研究結(jié)果一方面能夠?yàn)楹駳べO貝的人工養(yǎng)殖和野生馴化的海域選擇提供強(qiáng)有力的參考, 另一方面可以維持海域微生物群落的動(dòng)態(tài)平衡, 促進(jìn)貝類養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的健康、可持續(xù)發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 厚殼貽貝生存海域的海水微生物群落分析

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料 于2019 年5—6 月, 選擇嵊泗縣枸杞島(30°42′N, 122°46′E)厚殼貽貝養(yǎng)殖區(qū)海域 5、10 m 水深和厚殼貽貝野生生長(zhǎng)區(qū)海域5、10 m 水深;東極鎮(zhèn)廟子湖島(30°11′N, 122°41′E)厚殼貽貝養(yǎng)殖海域5、10 m 水深和厚殼貽貝野生生長(zhǎng)區(qū)海域5、10 m水深, 共計(jì) 8 個(gè)點(diǎn)位, 具體采樣位置見圖 1。在調(diào)查期間, 每個(gè)點(diǎn)位采集3 個(gè)平行海水樣本, 送往實(shí)驗(yàn)室經(jīng)靜置沉淀并過濾后進(jìn)行16S rRNA 擴(kuò)增子測(cè)序。

圖1 枸杞島(右下)和東極島(右上)厚殼貽貝養(yǎng)殖和野生生長(zhǎng)海域采樣站位圖Fig.1 Location of the sampling points for M. coruscus in natural and cultural regions in Gouqi Island (lower right) and Dongji Island(upper right)

1.1.2 實(shí)驗(yàn)方法 取質(zhì)量合格的基因組DNA 樣品30 ng 及對(duì)應(yīng)的融合引物配置 PCR 反應(yīng)體系, 設(shè)置PCR 反應(yīng)參數(shù)進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增, 使用 Agencourt AMPure XP 磁珠對(duì)PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化, 并溶于Elution Buffer, 貼上標(biāo)簽, 完成建庫(kù)。 使用Agilent2100 Bioanalyzer 對(duì)文庫(kù)的片段范圍及濃度進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)合格的文庫(kù)根據(jù)插入片段大小, 選擇HiSeq 平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。然后對(duì)所有樣品的全部序列進(jìn)行聚類, 以97%的相似度將序列聚類成OUT, 然后對(duì)OTU 的代表序列進(jìn)行物種注釋, 確定16S rRNA 序列對(duì)應(yīng)的微生物名稱(趙立君等, 2019)。

1.1.3 生物信息學(xué)分析 下機(jī)數(shù)據(jù)過濾, 剩余高質(zhì)量的Clean data 用于后期分析(Magoc et al, 2011);通過 reads 之間的 overlap 關(guān)系將 reads 拼接成 Tags;將Tags 聚類成OTU 并與數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)、物種注釋; 基于 OTU 和注釋結(jié)果進(jìn)行樣品物種復(fù)雜度分析, 組間物種差異分析等。再利用 UCHIME(v 4.2.40)將 PCR擴(kuò)增產(chǎn)生的嵌合體從 OTU 代表序列中去除, 使用usearch_global 方法將所有 Tags 比對(duì)回 OTU 代表序列(Wang et al, 2007), 對(duì)每個(gè)樣品的OTU 豐度、多樣性指數(shù)等進(jìn)行分析, 同時(shí)對(duì)物種注釋在門分類水平上進(jìn)行群落結(jié)構(gòu)的統(tǒng)計(jì)分析。在以上分析的基礎(chǔ)上,進(jìn)行基于OTU 的主成分分析(PCA)。

1.2 厚殼貽貝體內(nèi)組織微生物分離與鑒定

1.2.1 培養(yǎng)基制備 第一類分離選用 2216E 普通海水培養(yǎng)基。為還原貽貝組織的營(yíng)養(yǎng)成分, 盡可能分離到貽貝體內(nèi)全部種類的微生物, 選取足量的厚殼貽貝全組織進(jìn)行勻漿并過濾, 120°C、21 min 高溫高壓處理, 加入適量瓊脂制備成厚殼貽貝肉湯培養(yǎng)基, 用于第二類分離。

1.2.2 微生物分離與篩選 選取來自同一生長(zhǎng)環(huán)境的厚殼貽貝 10 只, 解剖取其鰓、性腺、消化腺、外套膜、足并用無菌海水輕輕沖洗去除組織表面雜質(zhì),使用兩種不同方式分離微生物: (1) 第一類分離針對(duì)貽貝組織表面附著的微生物, 用無菌棉簽分別刮取不同組織的表面, 將棉簽伸至于放有玻璃珠的三角瓶中并加入少量無菌海水, 常溫振蕩培養(yǎng)1 h。(2) 第二類次分離針對(duì)可能在貽貝體內(nèi)生長(zhǎng)的微生物, 分別將上述5 類組織勻漿后, 加入放有玻璃珠的三角瓶中, 常溫振蕩培養(yǎng) 1 h。兩次分離都根據(jù)選用的不同組織分成5 組, 每組3 次重復(fù)。

取上述適量處理過的培養(yǎng)液接種到對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)基中, 28°C 過夜培養(yǎng), 分別挑取不同細(xì)胞形態(tài)、大小、顏色的菌落至海水LB 培養(yǎng)基上, 反復(fù)純化三次。

1.2.3 微生物鑒定 使用試劑盒(TaKaRa MiniBEST Bacteria Genomic DNA Extraction Kit)分別提取篩選菌落的基因組 DNA, 選用通用引物27F (5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和 1492R(5′-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′)PCR 擴(kuò)增 16S rDNA, PCR 產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)有限公司進(jìn)行進(jìn)一步的分析和鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 海水樣品測(cè)序結(jié)果

如表1、表2 所示, 兩個(gè)海域的所有樣品優(yōu)化后序列占優(yōu)化前序列的 80%以上, 因此可以很好地用于后續(xù)的進(jìn)一步分析。

表1 東極海域微生物群落16S rRNA 擴(kuò)增子測(cè)序序列結(jié)果優(yōu)化對(duì)比Tab.1 Comparison of microbes 16S rRNA sequencing in the Dongji sea area

表2 嵊泗海域微生物群落16S rRNA 擴(kuò)增子測(cè)序序列結(jié)果優(yōu)化對(duì)比Tab.2 Comparison of microbes 16S rRNA sequencing in the Shengsi sea area

2.2 各海域微生物群落多樣性特征

通過多樣性指數(shù)可以對(duì)兩個(gè)海域海水樣品中微生物多樣性進(jìn)行分析。從表 3 可得, 東極海域海水樣品有效序列共計(jì)245568 條, 其中養(yǎng)殖區(qū)海域10 m 水深樣品包含 60785 條, OTU 數(shù) 674 個(gè); 養(yǎng)殖區(qū)海域 5 m 水深樣品包含61905 條, OTU 數(shù)616 個(gè); 野生生長(zhǎng)區(qū)海域10 m 水深樣品包含 60756 條, OTU 數(shù) 635 個(gè); 野生生長(zhǎng)區(qū)海域 5 m 水深樣品包含62122 條, OTU 數(shù) 535 個(gè)。

從表 4 可得, 嵊泗海域海水樣品有效序列共計(jì)249809 條, 其中養(yǎng)殖區(qū)海域 10 m 水深樣品包含61514 條, OTU 數(shù) 592 個(gè); 養(yǎng)殖區(qū)海域 5 m 水深樣品包含64847 條, OTU 數(shù)584 個(gè); 野生生長(zhǎng)區(qū)海域10 m水深樣品包含61326 條, OTU 數(shù)623 個(gè); 野生生長(zhǎng)區(qū)海域5 m 水深樣品包含62122 條, OTU 數(shù)570 個(gè)。

綜上可以得, 東極海域養(yǎng)殖區(qū)微生物(OTU 為616—674)豐富度大于野生生長(zhǎng)區(qū)微生物(OTU 為535—635), 10 m 水深微生物(OTU 為 635—674)豐富度大于5 m 水深微生物(OTU 為535—616); 嵊泗海域野生生長(zhǎng)區(qū)區(qū)微生物(OTU 為 535—674)豐富度大于養(yǎng)殖區(qū)區(qū)微生物(OTU 為584—592), 10 m 水深微生物(OTU 為592—623)豐富度大于5 m 水深微生物(OTU為570—584)。嵊泗海域總體微生物(OTU 為570—623)豐富度大于東極海域(OTU 為535—674)。

表3 東極海域樣品OTU 數(shù)及多樣性指數(shù)Tab.3 The OTU and diversity index in the Dongji sea area

表4 嵊泗海域樣品OTU 數(shù)及多樣性指數(shù)Tab.4 The OTU and diversity index in the Shengsi sea area

本文通過包括Sobs 指數(shù)、Chao 指數(shù)、ACE 指數(shù)、Shannon 指數(shù)、Simpson 指數(shù)以及 Good- coverage 指數(shù)的 Alpha 多樣性來分析海水樣品中微生物多樣性差異(Schloss et al, 2009)。Sobs 指數(shù)、Chao 指數(shù)和ACE 指數(shù)反映樣品中群落的豐富度, 而Shannon 指數(shù)以及Simpson 指數(shù)反映群落的多樣性, Good-coverage反映了樣品文庫(kù)的覆蓋率。其中, Sobs 指數(shù)、Chao指數(shù)和ACE 指數(shù)和Shannon 指數(shù)越大, Simpson 指數(shù)越小, 說明樣品中的物種越豐富; Good-coverage 數(shù)值越高, 則表明樣品中序列沒有被測(cè)出來的概率越低,該值反映了測(cè)序結(jié)果是否代表樣品的真實(shí)情況, 所有樣品的 Good-coverage 指數(shù)均在 0.998 以上, 因此本次測(cè)序結(jié)果代表了樣本中微生物的真實(shí)情況。

由此可得, 東極海域不同采樣點(diǎn)微生物豐富度及多樣性由大到小分別為 culture.10m ＞ wild.10m ＞culture.5m ＞ wild.5m; 嵊泗海域不同采樣點(diǎn)微生物豐富度及多樣性由大到小分別為wild.10m ＞ culture.10m ＞culture.5m ＞ wild.5m。

Core-Pan OTU 以花瓣圖展示所有樣本共有和特有的 OTU, 分析數(shù)據(jù)與維恩圖相同, 但相比于維恩圖只展示 5 組(或 5 個(gè)樣品)以內(nèi)的數(shù)據(jù), 花瓣圖可以展示任意組(或樣品), 因此可以盡可能多的展示組間OTU 的異同。

從圖2 可知, 東極海域樣品微生物OTU 數(shù)為440—473, 共有 OTU 達(dá)到 436, 說明東極海域總體上微生物組成相似度較高, 養(yǎng)殖區(qū)海域 10 m 水深特有OTU 最高, 達(dá)到37; 野生生長(zhǎng)區(qū)5 m 水深特有OTU最低, 僅達(dá)到 4。從圖 3 可知, 嵊泗海域樣品微生物OTU 數(shù)為 455—473, 共有 OTU 達(dá)到 439, 說明嵊泗海域總體上微生物組成相似度也較高, 野生生長(zhǎng)區(qū)海域10m 水深特有OTU 最高, 達(dá)到34; 養(yǎng)殖區(qū)海域特有OTU 均最低, 僅達(dá)到16。

2.3 各海域微生物群落門分類水平組成分析

物種柱狀圖可以直觀地展示各樣本物種組成及比例, 反映樣本間物種的變化情況。 通過與數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì), 對(duì) OTU 進(jìn)行物種分類, 本文選取在門分類水平上(物種豐富度均大于 0.5%)對(duì)各樣品所作的物種豐度柱狀圖。

圖2 東極海域樣品OTU 分布Core-Pan 圖Fig.2 The Core-pan diagram of OTU distribution in the Dongji sea area

圖3 嵊泗海域樣品OTU 分布Core-Pan 圖Fig.3 The Core-pan diagram of OTU distribution in the Shengsi sea area

從圖 4 可知, 東極海域主要包含變形菌門Proteobacteria、擬桿菌門 Bacteroidetes、廣古菌門Euryarchaeota、放線菌門 Actinobacteria、泉古菌門Crenarchaeota 等在內(nèi)的 30 個(gè)門類, 其中變形菌門是四個(gè)采樣點(diǎn)的最大優(yōu)勢(shì)門類, 其在野生生長(zhǎng)區(qū) 10 m水深、野生生長(zhǎng)區(qū)5 m 水深、養(yǎng)殖區(qū)10 m 水深、養(yǎng)殖區(qū) 5 m 水深的百分比分別為 37.58%、28.53%、36.26%、37.13%, 擬桿菌門(19.72%—26.41%)、放線菌門(9.23%—20.86%)是東極海域第二、第三優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門, 這三大優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門類占據(jù)東極海域細(xì)菌比例的60%以上。

此外, 東極養(yǎng)殖區(qū)海域和野生生長(zhǎng)區(qū)海域微生物門類無明顯差異, 但可明顯得知野生生長(zhǎng)區(qū)海域各類優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門所占比例大于養(yǎng)殖區(qū)海域各類優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門所占比例。

從圖 4 可知, 東極海域主要包含變形菌門Proteobacteria、擬桿菌門 Bacteroidetes、廣古菌門Euryarchaeota、放線菌門 Actinobacteria、泉古菌門Crenarchaeota 等在內(nèi)的27 個(gè)門類, 其中變形菌門是四個(gè)采樣點(diǎn)的最大優(yōu)勢(shì)門類, 其在野生生長(zhǎng)區(qū)10 m 水深, 野生生長(zhǎng)區(qū)5 m 水深, 養(yǎng)殖區(qū)10 m 水深, 養(yǎng)殖區(qū)5 m 水深的百分比分別為51.48%、54.66%、61.88%、60.46%, 擬桿菌門(17.48%—19.72%), 放線菌門(9.08%—11.99%)是嵊泗海域第二、第三優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門, 這三大優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門類占據(jù)東極海域細(xì)菌比例的80%以上。

同樣, 嵊泗養(yǎng)殖區(qū)海域和野生生長(zhǎng)區(qū)海域微生物門類無明顯差異, 但可明顯得知野生生長(zhǎng)區(qū)海域各類優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門所占比例大于養(yǎng)殖區(qū)海域各類優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門所占比例。

綜合圖4、圖5 可知, 東極海域總體微生物豐富度要大于嵊泗海域, 但是在同樣優(yōu)勢(shì)菌門的條件下,嵊泗海域各類優(yōu)勢(shì)菌門所占的微生物總比例遠(yuǎn)高于東極海域的各類優(yōu)勢(shì)菌門。

2.4 各海域微生物群落屬分類水平組成分析

從圖6 可知, 東極海域主要包含厭氧氨氧化菌屬Candidatus Portiera (5.57%—8.03%), 海洋氨氧化古菌 屬 Nitrosopumilus (5.27%—6.94%), Fluviicola(4.21%—6.34%), 藍(lán)細(xì)菌聚球藻屬 Synechococcus(1.82%—3.09%), 弧菌屬Vibrio (0.33%—2.50%)等在內(nèi)的9 個(gè)屬類。從表5 可知, 東極海域厚殼貽貝養(yǎng)殖區(qū)和野生生長(zhǎng)區(qū)屬分類水平微生物豐度之間的比較無明顯規(guī)律。

圖4 東極海域微生物門分類水平物種豐度柱狀圖Fig.4 The phylum abundance in the Dongji sea area

圖5 嵊泗海域微生物門分類水平物種豐度柱狀圖Fig.5 The phylum abundance in the Shengsi sea area

圖6 東極海域微生物屬分類水平物種豐度柱狀圖Fig.6 The genus abundance in the Dongji sea area

從圖 7 可知, 嵊泗海域主要包含十八桿菌屬Octadecabacter (10.80%—15.04%), 假交替單胞菌屬Pseudoalteromonas (2.41%—8.77%), 厭氧氨氧化菌屬 Candidatus_Portiera (3.57%—6.69%), ZA3312c(1.80%—3.21%), 沉積物陸丹氏菌屬 Loktanella(3.26%—4.29%), 弧菌屬Vibrio (0.21%—6.36%)等在內(nèi)的13 個(gè)屬類。

從表6 可知, 嵊泗海域厚殼貽貝養(yǎng)殖區(qū)和野生生長(zhǎng)區(qū)屬分類水平微生物豐度之間可觀察到明顯的規(guī)律, 總體上養(yǎng)殖區(qū)海域各類優(yōu)勢(shì)屬微生物豐度大于野生生長(zhǎng)區(qū)海域。

2.5 各海域微生物群落相似度分析

本文采用主成分(PCA)分析, 通過分析不同樣品在圖上的分散和聚集的情況, 根據(jù)離散程度可以了解不同樣品的組成是否具有相似性(Jolliffe, 1986;Avershina et al, 2013)。從圖 8 可知: 軸 1 (PC1)貢獻(xiàn)值為72.72%, 軸2 (PC2)貢獻(xiàn)值為13.13%, 總貢獻(xiàn)值為85.85%。從整體上來看, 東極和嵊泗海域之間的微生物群落存在明顯差異, 兩個(gè)海域的野生生長(zhǎng)區(qū)5 m 和10 m 之間的微生物群落相似度明顯低于養(yǎng)殖區(qū)5 m和10 m 的微生物群落相似度, 而這種差異在嵊泗海域尤為明顯。

表5 東極海域微生物群落16S rRNA 擴(kuò)增子測(cè)序?qū)俜诸愃轿⑸锶郝浣Y(jié)構(gòu)表Tab.5 The community structure in genus level in the Dongji sea area

圖7 嵊泗海域微生物屬分類水平物種豐度柱狀圖Fig.7 The genus abundance in the Shengsi sea area

表6 嵊泗海域?qū)俜诸愃轿⑸锶郝浣Y(jié)構(gòu)表Tab.6 The community structure in genus level in the Shengsi sea area

圖8 各海域樣品PCA 分析圖Fig.8 The PCA analysis diagram of sea area samples

2.6 厚殼貽貝體內(nèi)分離微生物組成分析

由表7 可知, 從厚殼貽貝的鰓、性腺、足、消化腺中均分離出微生物, 主要包括: 黏著桿菌屬Tenacibaculum sp., 蠟樣芽孢桿菌屬 Bacillus cereus,紅色桿菌屬 Erythrobacter sp., 魯杰氏菌屬 Ruegeria sp., 弧菌屬Vibrio sp., 巨型弧菌屬Vibrio gigantis, 假交替單胞菌屬Pseudoalteromonas 這7 類菌屬。

結(jié)合上文圖7 可發(fā)現(xiàn), 在厚殼貽貝生長(zhǎng)海域水體中檢測(cè)分析得到的假交替單胞菌屬 Pseudoalteromonas,黏著桿菌屬 Tenacibaculum sp.以及弧菌屬 Vibrio sp.均在厚殼貽貝體內(nèi)組織中檢測(cè)到, 且這三類菌屬都出現(xiàn)于厚殼貽貝的鰓組織中。

3 討論

3.1 厚殼貽貝養(yǎng)殖環(huán)境及其體內(nèi)微生物群落多樣性分析

嵊泗海域總體微生物豐富度大于東極海域。嵊泗海域不同采樣點(diǎn)微生物豐富度由大到小分別為wild.10m ＞ culture.10m ＞ culture.5m ＞ wild.5m, 其中嵊泗海域野生生長(zhǎng)區(qū) 10 m 水深微生物豐富度最高,野生生長(zhǎng)區(qū)5 m 水深微生物豐富度最低; 東極海域不同采樣點(diǎn)微生物豐富度由大到小分別為 culture.10m＞ wild.10m ＞ culture.5m ＞ wild.5m, 東極海域養(yǎng)殖區(qū)10 m 水深微生物豐富度最高, 野生生長(zhǎng)區(qū)10 m 水深微生物豐富度最低。

表7 厚殼貽貝體內(nèi)分離微生物組成表Tab.7 The microbial composition inside the Mytilus coruscus

從屬分類水平來看, 東極海域的優(yōu)勢(shì)微生物群落主要為厭氧氨氧化菌屬 Candidatus_Portiera、海洋氨氧化古菌屬 Nitrosopumilus、Fluviicola、藍(lán)細(xì)菌聚球藻屬 Synechococcus 以及弧菌屬 Vibrio; 嵊泗海域的優(yōu)勢(shì)微生物群落主要為十八桿菌屬 Octadecabacter、假交替單胞菌屬 Pseudoalteromonas, 厭氧氨氧化菌屬Candidatus_Portiera、ZA3312c、沉積物陸丹氏菌屬Loktanella 以及弧菌屬Vibrio。

總體上, 東極海域4 個(gè)取樣點(diǎn)的微生物群落相似度比嵊泗海域高。由于受到厚殼貽貝長(zhǎng)期選擇性攝食的影響, 東極和嵊泗兩個(gè)海域的野生生長(zhǎng)區(qū) 5m 和10m 之間的微生物群落相似度明顯低于養(yǎng)殖區(qū)5m 和10m 的微生物群落相似度, 且這種差異在嵊泗海域尤為明顯。這可能是受嵊泗近海海域厚殼貽貝的大面積養(yǎng)殖的影響。從已有的文獻(xiàn)中可知(王芳等, 1998; 劉緒博, 2011; 周曦杰, 2014), 包括貽貝在內(nèi)的許多雙殼貝類有著選擇性濾食的習(xí)性, 即這些貝類會(huì)優(yōu)先選擇攝食水體中的一類浮游生物, 因而導(dǎo)致該區(qū)域水體中浮游生物種類相對(duì)單一, 相似度較高。相比于嵊泗海域, 東極海域4 個(gè)取樣點(diǎn)的微生物群落相似度較高, 而東極近海海域厚殼貽貝的養(yǎng)殖規(guī)模遠(yuǎn)不如嵊泗海域大, 因此近海微生物群落受厚殼貽貝的攝食影響較小, 和野生生長(zhǎng)區(qū)微生物群落相比, 相似度就更高。

Vezzulli 等人對(duì)位于意大利利古里亞海的地中海貽貝養(yǎng)殖場(chǎng)的水體微生物群落進(jìn)行了分析, 發(fā)現(xiàn)弧菌屬和假交替單胞菌屬是該海域的主要優(yōu)勢(shì)微生物(Vezzulli et al, 2018), 這與本文嵊泗海域的主要優(yōu)勢(shì)微生物結(jié)果相一致。而東極海域也發(fā)現(xiàn)假交替單胞菌這一種優(yōu)勢(shì)微生物, 同時(shí)也間接印證了東極海域的微生物豐富度不如嵊泗海域。

在厚殼貽貝生長(zhǎng)海域以及厚殼貽貝體內(nèi)組織都鑒定到了假交替單胞菌屬Pseudoalteromonas、黏著桿菌屬Tenacibaculum sp.以及弧菌屬Vibrio sp.這三類微生物, 初步推測(cè)厚殼貽貝和這些自然水域中存在的微生物產(chǎn)生了某種共生關(guān)系, 有報(bào)道說海洋雙殼貝類會(huì)將某些環(huán)境中的細(xì)菌甚至是致病菌富集在鰓上,以此到達(dá)幫助宿主攝食消化、阻止其他病原體侵入的作用, 這也是貽貝不易染病的原因之一(Yu et al,2019)。相似的研究在紫貽貝中也有報(bào)道, 通過對(duì)土耳其伊茲密爾沿海生長(zhǎng)的紫貽貝體內(nèi)微生物進(jìn)行宏基因組分析, 結(jié)果發(fā)現(xiàn)紫貽貝中也存在弧菌、變形桿菌、摩根氏菌等在內(nèi)的34 種菌屬(Bozcal et al, 2020)。

3.2 貽貝及其共生微生物的獨(dú)特適應(yīng)性

無論是厚殼貽貝生長(zhǎng)海域, 還是其體內(nèi)均分離鑒定到大量弧菌。而之前的報(bào)道顯示在紫貽貝體內(nèi)也大量存在弧菌(Bozcal et al, 2020)。其中弧菌是水產(chǎn)養(yǎng)殖中常見的致病菌, 在紫貽貝和厚殼貽貝體內(nèi)都存在大量的弧菌, 說明貽貝對(duì)弧菌具有特殊的適應(yīng)性,其特殊的適應(yīng)機(jī)制和病原識(shí)別模式還有待于進(jìn)一步研究。目前關(guān)于弧菌和宿主的共生已有一些研究, 例如有報(bào)道顯示在海洋魚類中, 弧菌會(huì)在進(jìn)入宿主腸道系統(tǒng)后, 通過其VI 型分泌系統(tǒng)分泌一些效應(yīng)分子,刺激宿主腸道產(chǎn)生收縮使得宿主腸道內(nèi)原有的常駐菌群被迫排出, 最終弧菌在宿主腸道微生物群落中占據(jù)主導(dǎo)地位, 然而在這一腸道微生物群落更替變化中似乎并不會(huì)對(duì)宿主的健康產(chǎn)生損害, 弧菌本身似乎也不受腸道運(yùn)動(dòng)增強(qiáng)的影響(Logan et al, 2018); 而Vezzulli 等人認(rèn)為貽貝體內(nèi)的弧菌與其宿主經(jīng)歷了一段較為漫長(zhǎng)的共同進(jìn)化史(Vezzulli et al, 2018); Septer等人的研究表明, 夏威夷魷魚在孵化后的數(shù)個(gè)小時(shí)內(nèi)就會(huì)被費(fèi)氏弧菌所感染, 這種感染將逐漸演變成一種共生, 并且持續(xù)至宿主的一生, 而這種共生關(guān)系和夏威夷魷魚的發(fā)光器官有直接的聯(lián)系(Septer, 2019)。

4 結(jié)論

總的來說, 目前對(duì)于海洋雙殼貝類共生菌的報(bào)道尚比較匱乏, 其識(shí)別微生物的機(jī)理及共生機(jī)制還尚不完全明確, 本文從厚殼貽貝體內(nèi)分離得到的微生物是否和厚殼貽貝發(fā)生了共生關(guān)系, 亦或是對(duì)厚殼貽貝的某些生理功能產(chǎn)生影響等問題, 還需進(jìn)一步探索。