免疫分子MHC-Ⅰ在小鼠不同腦區(qū)的分布

李慧萍 徐 秀

（復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院兒童保健科 上海 201102）

由于血腦屏障的存在，中樞神經(jīng)系統(tǒng)一直被認(rèn)為是一個(gè)“免疫豁免器官”。近年來(lái)越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)免疫系統(tǒng)在神經(jīng)發(fā)育及認(rèn)知、社交功能中發(fā)揮調(diào)控作用［1］。多種免疫相關(guān)分子與哺乳動(dòng)物大腦發(fā)育和功能有關(guān)［2］。

主要組織相容性復(fù)合物（major histocompatibility complex，MHC）是一組高度多態(tài)性、緊密連鎖的基因簇，在脊椎動(dòng)物中編碼蛋白參與免疫應(yīng)答。MHCⅠ類(lèi)分子（MHC classⅠ molecule，MHC-Ⅰ）特異性表達(dá)于有核細(xì)胞表面，提呈細(xì)胞內(nèi)抗原給特定的細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞及自然殺傷細(xì)胞介導(dǎo)免疫應(yīng)答［3］。MHC-Ⅰ具有異三聚體結(jié)構(gòu)，由1條跨膜重鏈、1條非共價(jià)附加的β-2-微球蛋白亞單位（β2m）及1條8～15個(gè)氨基酸的短肽（主要用于區(qū)分自身蛋白或外來(lái)蛋白）組成［4］。MHC-Ⅰ在不同細(xì)胞類(lèi)型中表達(dá)水平有所差異［3］。由于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中極少見(jiàn)淋巴細(xì)胞及自然殺傷細(xì)胞，大腦被認(rèn)為缺乏MHC-Ⅰ表達(dá)［5-6］。但是動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，MHC-Ⅰ在神經(jīng)元中表達(dá)［7-8］，并參與突觸形成、重構(gòu)、可塑性等與免疫應(yīng)答完全無(wú)關(guān)的生理過(guò)程［9-12］，MHC-Ⅰ調(diào)節(jié)活性依賴的視覺(jué)投射修剪，負(fù)向調(diào)節(jié)神經(jīng)元突觸密度，并且在海馬依賴的記憶以及NMDAR門(mén)控依賴的海馬LTD中發(fā)揮重要作用［11］。

已知MHC-Ⅰ分子表達(dá)于神經(jīng)細(xì)胞，但是其在腦中不同腦區(qū)的分布情況尚不清楚。本研究運(yùn)用OX-18抗體標(biāo)記成年野生型小鼠腦片，從不同腦區(qū)觀察MHC-Ⅰ蛋白分布情況，以深入了解MHC-Ⅰ在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的表達(dá)譜。

材料和方法

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物C57BL/6J小鼠購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，聯(lián)合免疫缺陷（severe combined immuno-deficiency，SCID）小鼠購(gòu)自美國(guó)Jackson實(shí)驗(yàn)室。動(dòng)物均在清潔標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境飼養(yǎng)，12 h/12 h光暗周期。實(shí)驗(yàn)操作符合復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院倫理委員會(huì)對(duì)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理的要求。

免疫熒光染色組織制備出生后2月齡小鼠用過(guò)量12%水合氯醛處死，打開(kāi)胸腔，從心臟灌流預(yù)冷的0.1 mol/L PBS，然后灌流4%PFA固定。打開(kāi)顱骨，分離出小鼠全腦，4℃下浸沒(méi)于4%多聚甲醛（paraformaldehyde，PFA），固定4 h。同樣在4℃下分別使用15%及30%蔗糖溶液梯度脫水48 h，直至組織沉底。組織脫水后吸干表面液體，低溫包埋于OCT（日本Sakura公司）。使用德國(guó)LEICA公司冰凍切片機(jī)，冠狀切片，切片厚度為40μm，切片漂浮保存于4℃0.1 mol/L PBS中，用于免疫熒光染色。

免疫熒光染色取3～4片腦片于24孔板中，用PBS清洗3次，去除多余的PFA及OCT。使用含5% 牛血清蛋白（bull serum albumin，BSA）、0.2%Triton X-100和0.1%Tween20的PBS溶液作為封閉液，在室溫環(huán)境下封閉1 h。標(biāo)記一抗：去除封閉液，加入相應(yīng)的一抗，按照抗體要求濃度稀釋于封閉液中。一抗使用小鼠來(lái)源OX-18抗體（1∶500，英國(guó)AbDSerotec公司）及兔源Alex Fluor 647-NeuN抗體（1∶500，英國(guó)Abcam公司）。4℃孵育過(guò)夜，PBS漂洗3次，每次15 min。熒光標(biāo)記二抗，室溫下避光孵育1.5 h，根據(jù)一抗來(lái)源確定抗體特異性。細(xì)胞核使用二脒基苯基吲哚（4′，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）（美國(guó)Sigma公司）標(biāo)記，PBS漂洗3次，每次15 min。然后貼片，待組織微干，使用封片液封片。

圖像采集及分析圖像采集使用德國(guó)Leica公司TCS SP8型共聚焦顯微鏡。圖像分析使用FIJI軟件（美國(guó)國(guó)家衛(wèi)生研究院）。小鼠腦區(qū)分布參考Allen小鼠腦圖譜（Allen Mouse Brain Atlas）。

結(jié) 果

MHC-I分子在各腦區(qū)分布廣泛小鼠大腦冠狀切面染色如圖1所示，分別為2月齡野生型小鼠（圖1A）和相應(yīng)月齡SCID小鼠（圖1B）。野生型小鼠MHC-Ⅰ陽(yáng)性細(xì)胞廣泛分布于大腦皮層、海馬、丘腦、下丘腦、杏仁核等腦區(qū)，但不同腦區(qū)蛋白表達(dá)水平不同，同一腦區(qū)中不同細(xì)胞間MHC-Ⅰ表達(dá)水平也不相同。B細(xì)胞、T細(xì)胞均缺失的SCID小鼠中，MHC-Ⅰ同樣在大腦各腦區(qū)分布，與野生型小鼠基本相仿。

圖1 MHC-Ⅰ在小鼠大腦廣泛表達(dá)Fig 1 MHC-Ⅰwildly expressed in the brains of mice

初級(jí)軀體感覺(jué)皮層MHC-Ⅰ表達(dá)模式野生型小鼠初級(jí)軀體感覺(jué)皮層MHC-Ⅰ染色如圖2所示，距Bregma點(diǎn)-1.70 mm，距中線1 mm左右。MHC-Ⅰ集中分布于2/3層、5層神經(jīng)元胞體，4層部分神經(jīng)元胞體表達(dá)MHC-Ⅰ，而6層神經(jīng)元僅有少量神經(jīng)元細(xì)胞高表達(dá)MHC-Ⅰ，并可見(jiàn)MHC-Ⅰ表達(dá)延伸至樹(shù)突及樹(shù)突末梢（1層）。

圖2 MHC-I陽(yáng)性細(xì)胞在野生型小鼠初級(jí)軀體感覺(jué)皮層的分布Fig 2 The expression pattern of MHC-Ipositive cells in primary somatosensory cortex of wild-type mice

海馬MHC-Ⅰ表達(dá)模式從野生型小鼠的冠狀切面海馬來(lái)看，在齒狀回（dentate gyrus，DG）、海馬角1（cornuammonis 1，CA 1）、CA 2、CA 3顆粒細(xì)胞層及錐體細(xì)胞層MHC-Ⅰ表達(dá)水平均不高。許多散在分布的神經(jīng)元核特異性標(biāo)記（NeuN）陽(yáng)性細(xì)胞高表達(dá)MHC-Ⅰ（圖 3）。

圖3 MHC-I高表達(dá)神經(jīng)元在野生型小鼠海馬中散在分布Fig 3 MHC-Ihighly expressed neurons scattered in the hippocampus of wild-type mice

杏仁核MHC-Ⅰ表達(dá)模式MHC-Ⅰ高表達(dá)神經(jīng)元特異性聚集于底外側(cè)杏仁核前部（basolateral amygdala nucleus，anterior part，BLAa），而在相鄰的外側(cè)杏仁核（lateral amygdalar nucleus，LA）及底外側(cè)杏仁核后部（basolateral amygdalar nucleus，posterior part，BLAp）僅有少量細(xì)胞低表達(dá)MHC-Ⅰ（圖4）。

圖4 野生型小鼠底外側(cè)杏仁核前部MHC-I陽(yáng)性神經(jīng)元密度高Fig 4 The density of MHC-Ipositive neurons was high in the basolateral amygdala nucleus，anterior part（BLAa）of wild-type mice

MHC-Ⅰ在中腦、丘腦核團(tuán)高表達(dá)距Bregma點(diǎn)-2.8 mm的小鼠大腦切面（圖5）可見(jiàn)：在中腦位置的 環(huán) 狀 核（nucleus circularis，NC）、后 連 合 核（nucleus of the posterior commissure，NPC）、運(yùn)動(dòng)相關(guān)上丘，灰質(zhì)間層，b亞層（superior colliculus，motor related，intermediate gray layer，sublayer b，SCig-b）、頂蓋前核（anterior pretectal nucleus，APN）、黑質(zhì)網(wǎng)狀 帶（substantia nigrareticular parts，SNr）高 表 達(dá)MHC-Ⅰ；在部分丘腦結(jié)構(gòu)中，外側(cè)膝狀體背部（dorsal part of the lateral geniculate complex，LGd）、外側(cè)膝狀體腹部（ventral part of the lateral geniculate complex，LGv）、內(nèi) 側(cè) 膝 狀 體（medial geniculate complex，MG）高表達(dá) MHC-Ⅰ。

討 論

本文檢測(cè)了MHC-Ⅰ在小鼠大腦中的分布情況。結(jié)果表明，MHC-Ⅰ在大腦分布非常廣泛，各個(gè)腦區(qū)均可見(jiàn)到在不同神經(jīng)元細(xì)胞間的非均勻分布。

OX-18是一種特異性單克隆小鼠抗體，多篇文獻(xiàn)曾報(bào)道OX-18抗體用于檢測(cè)MHC-Ⅰ表達(dá)水平［13］，OX-18 抗體抗 MHC-Ⅰ RT 1A 的胞外段 α3 結(jié)構(gòu)域在多種MHC-Ⅰ變體中保守結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，一直以來(lái)被用于免疫親合純化、免疫染色等檢測(cè)MHC-Ⅰ分子。OX-18抗體可以特異性識(shí)別非神經(jīng)組織MHC-Ⅰ蛋白，也可以識(shí)別中樞神經(jīng)系統(tǒng)MHC-Ⅰ。已有研究使用OX-18抗體檢測(cè)MHC-Ⅰ蛋白在大鼠視皮層中的表達(dá)情況［13］：在出生7天后的大鼠中，MHC-Ⅰ在視皮層5層高表達(dá)，淺層表達(dá)水平低，6層基本無(wú)表達(dá)。在年紀(jì)較大的動(dòng)物中，MHC-Ⅰ在整個(gè)淺層大腦皮層分布，但在6層表達(dá)水平仍較低［13］。孕中期小鼠大腦中同樣檢測(cè)到MHC-Ⅰ蛋白表達(dá)于胚胎期神經(jīng)元及神經(jīng)前體細(xì)胞［14］。本研究中大腦皮層 MHC-Ⅰ染色結(jié)果與 Needleman 等［13］的視皮層染色結(jié)果基本一致，外側(cè)膝狀體也與Corriveau等［15］報(bào)道的該部位神經(jīng)元高表達(dá)MHC-Ⅰ相一致，說(shuō)明MHC-Ⅰ染色準(zhǔn)確可信。

圖5 MHC-I陽(yáng)性神經(jīng)元在野生型小鼠中腦和丘腦部分核團(tuán)中聚集性分布Fig 5 MHC-I selectively high-expressed in the nucleiof midbrain and thalamusof wild-type mice

MHC-Ⅰ被認(rèn)為參與神經(jīng)元突觸形態(tài)和功能調(diào)控，與神經(jīng)環(huán)路形成有關(guān)，且在SCID小鼠神經(jīng)元中的表達(dá)分布與普通小鼠基本相仿。為什么在不同的神經(jīng)元中會(huì)出現(xiàn)如此明顯的表達(dá)差異？哪些神經(jīng)元需要更高的 MHC-Ⅰ水平？Needleman 等［13］認(rèn)為，神經(jīng)元具有MHC-Ⅰ儲(chǔ)存庫(kù)作用，當(dāng)神經(jīng)突觸需要修剪時(shí)，MHC-Ⅰ可被運(yùn)輸表達(dá)于神經(jīng)元突觸前膜及后膜，而當(dāng)突觸修剪減少時(shí)MHC-Ⅰ回流至胞體儲(chǔ)存。按照該理論，本研究MHC-Ⅰ高染色的神經(jīng)元為突觸修剪較少的神經(jīng)元，但目前尚無(wú)充足的實(shí)驗(yàn)證實(shí)該假設(shè)。有文獻(xiàn)報(bào)道MHC-Ⅰ受到神經(jīng)元活化鈣信號(hào)調(diào)控［15-17］。外側(cè)膝狀體（lateral geniculate nuclei，LGN）灌注河豚毒素（tetrodotoxin，TTX）降低神經(jīng)興奮性，局部MHC-ⅠmRNA水平降低。通過(guò)單眼注射TTX下調(diào)視網(wǎng)膜膝狀體活性，也可以下調(diào) LGN MHC-Ⅰ mRNA 水平［15］。然而，在神經(jīng)元激活即刻MHC-Ⅰ與早期基因c-fos共染實(shí)驗(yàn)中，MHC-Ⅰ與c-fos并不完全共定位。參考海馬區(qū)域GABA能神經(jīng)元分布及形態(tài)特征研究［18］，在海馬區(qū)域MHC-Ⅰ高表達(dá)的神經(jīng)元從分布及形態(tài)來(lái)看是GABA能神經(jīng)元。此外，黑質(zhì)是大腦皮層直接或間接通過(guò)紋狀體與網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)發(fā)生聯(lián)系的中間站，分為背側(cè)的致密帶和腹側(cè)的網(wǎng)狀帶，致密帶細(xì)胞富含黑色素顆粒，能合成多巴胺，而網(wǎng)狀帶主要為GABA能神經(jīng)元［19］。從染色來(lái)看，網(wǎng)狀帶可見(jiàn)的神經(jīng)元均為MHC-Ⅰ陽(yáng)性，而致密帶多巴胺能神經(jīng)元均MHC-Ⅰ陰性。我們猜測(cè)MHC-Ⅰ更傾向于在GABA能神經(jīng)元中表達(dá)。但杏仁核中，MHC-Ⅰ陽(yáng)性神經(jīng)元高度集中于BLAa。BLA參與恐懼記憶及成癮的行為過(guò)程［20］，包括 LA、BLAa、BLAp。BLAa有靶向特異性投射神經(jīng)元，這些神經(jīng)元胞體及樹(shù)突形態(tài)互不相同。該區(qū)域GABA能神經(jīng)元占比據(jù)估計(jì)在10%～15%，顯然低于被染色的MHC-Ⅰ陽(yáng)性神經(jīng)元比率。而LA、BLAp區(qū)域的GABA能神經(jīng)元未見(jiàn)同樣MHC-Ⅰ染色。因此GABA能神經(jīng)元高表達(dá)MHC-Ⅰ并不能解釋MHC-Ⅰ表達(dá)特點(diǎn)。軀體感覺(jué)皮層染色來(lái)看也可見(jiàn)到有一批MHC-Ⅰ陽(yáng)性神經(jīng)元為椎體神經(jīng)元。

MHC-Ⅰ在中樞神經(jīng)系統(tǒng)表達(dá)不僅在發(fā)育中存在并發(fā)揮作用［11］，而且在成年期大腦中同樣表達(dá)。已知MHC-Ⅰ表達(dá)異常參與孤獨(dú)癥譜系障礙、帕金森癥等神經(jīng)精神疾病進(jìn)程［21-23］。研究發(fā)現(xiàn)MHC-Ⅰ在大腦多數(shù)腦區(qū)表達(dá)，但僅局限于腦區(qū)中的部分神經(jīng)元，MHC-Ⅰ選擇性表達(dá)的因素尚不明確，深入探究其決定因素對(duì)了解MHC-Ⅰ在中樞神經(jīng)元中的作用具有重要意義，可能為理解孤獨(dú)癥譜系障礙、帕金森癥等難治性神經(jīng)精神疾病提供幫助。

致謝Jonathan kipms教授及付忠孝博士給予建議及指導(dǎo)。

作者貢獻(xiàn)聲明李慧萍 完成實(shí)驗(yàn)，分析數(shù)據(jù)，撰寫(xiě)論文。徐秀 研究構(gòu)思，論文修訂。

利益沖突聲明所有作者均聲明不存在利益沖突。