丁酸鈉聯(lián)合X 射線照射對(duì)肺癌A549 細(xì)胞增殖的抑制作用及其對(duì)細(xì)胞周期的影響

李官虎, 郎慶旭, 劉純巖, 劉 沁, 耿夢(mèng)柔, 李曉倩, 王珍琦

（1. 吉林大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院 國(guó)家衛(wèi)健委放射生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 長(zhǎng)春 130021；2. 吉林大學(xué)第二醫(yī)院放射線科，吉林 長(zhǎng)春130041）

近年來(lái)，我國(guó)肺癌發(fā)病率逐年升高。肺癌在所有癌癥中死亡率排第1 位［1］，平均5 年存活率約為18%，其中非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC） 占85%，多數(shù)患者確診時(shí)難以手術(shù)切除，其治療主要依靠化療與放療相結(jié)合。近十幾年來(lái)，盡管放療技術(shù)和全身治療取得很大進(jìn)展，但在NSCLC 治療方面仍然收效甚微。

組蛋白去乙?；敢种苿╤istone deacetylase inhibitor，HDACi）可以抑制組蛋白的乙?；?，使染色質(zhì)結(jié)構(gòu)松散，從而改變基因表達(dá)，抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞凋亡來(lái)改變細(xì)胞應(yīng)答［2-5］。因此，近年來(lái)HDACi 作為一種新的抗癌藥物受到重視，超過(guò)28 種HDACi 正在研究過(guò)程中［6］。研 究［7］表 明：第2 代HDACi Quisinostat（JNJ-26481585）治療NSCLC 取得較好的效果，提示 組 蛋 白 去 乙 酰 化 酶 （histone deacetyl transferases，HADC） 和HDACi 可 為NSCLC 提供新的治療策略。然而，癌細(xì)胞對(duì)HDACi 的抗性常常限制了其應(yīng)用［8-9］。為了提高HDACi 治療癌癥的療效，目前已研究出多種治療方法的組合。在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中，已經(jīng)證明HDACi 與其他抗癌藥物可以在NSCLC 中產(chǎn)生協(xié)同或加成效應(yīng)［10-14］。有研究［15-16］報(bào) 道： HDACi 可 以 抑 制 同 源 重 組（homologous recombination，HR） 相關(guān)基因表達(dá)，為其輻射增敏作用提供了理論依據(jù)，但其具體機(jī)制尚需進(jìn)一步探討。

丁酸鈉（sodium butyrate，NaBt）是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的HDAC 非特異性抑制劑，是常用的Ⅰ、Ⅱ和Ⅳ類(lèi)HDACi［17］，與其他抑制劑比較，其對(duì)HDAC的抑制效果更明顯，可抑制結(jié)腸癌、前列腺癌、乳腺癌和白血病等多種腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，誘導(dǎo)其分化，使腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)出類(lèi)似正常細(xì)胞的行為，同時(shí)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤的侵襲和浸潤(rùn)，影響細(xì)胞周期調(diào)控等［18］，但其是否具有放射增敏作用及其分子機(jī)制尚未闡明。本研究通過(guò)檢測(cè)NaBt 單獨(dú)或聯(lián)合X 射線照射對(duì)肺癌A549 細(xì)胞的增殖抑制作用及對(duì)細(xì)胞周期的影響，探討NaBt 是否具有放射增敏作用，為NSCLC 的治療提供新的策略和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、主要試劑和儀器人NSCLC A549 細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)，采用常規(guī)培養(yǎng)。培養(yǎng)條件：含10%胎牛血清的高糖DMEM，37℃、5%CO2和100%飽和濕度，細(xì)胞每3～4 d（即細(xì)胞密度在鋪滿(mǎn)皿底70%～80%時(shí)）傳代1 次。NaBt（美國(guó)Sigma 公司），胎牛血清（浙江杭州四季青生物制品分公司），高糖DMEM（美國(guó)Gibco 公司），胰蛋白酶（上海生物技術(shù)有限公司），磷酸鹽緩沖液（PBS，美 國(guó)Solarbi 公 司），二 甲 基 亞 砜（DMSO，重慶東方試劑廠），CCK-8 試劑盒（美國(guó)Bimake 公司）。TDZ5 臺(tái)式低速離心機(jī)（湖南赫西儀器裝備有限公司），Pico&Fresco 臺(tái)式離心機(jī)（德國(guó)Heraeus 公司），X 射線深部輻照儀（型號(hào)X-RAD 320 ix，德國(guó)PXI 公司），高壓鍋（日本Yamato 公司），GAX-9240 干燥箱（上海博訊公司），細(xì)胞培養(yǎng)箱（新加坡ESCO 科技有限公司），Epoch 酶標(biāo)儀（美國(guó)BioTek 公司），F(xiàn)ACSCalibur流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD 公司）。

1.2 CCK-8 法檢測(cè)細(xì)胞增殖率將細(xì)胞接種于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔3×103個(gè)細(xì)胞，8 個(gè)復(fù)孔。細(xì)胞分為對(duì)照組、不同濃度（5、10、15、20 和25 mmol·L－1）NaBt 組、4 Gy X 射線照射組和不同濃度（5、10、15、20 和25 mmol·L－1）NaBt 聯(lián)合4 Gy X 射線照射組，同時(shí)設(shè)空白組。使用X 射線深部輻照儀照射，照射條件：電壓180 kV，電流20 mA，單次源靶距70 cm，劑量率1.0 Gy·min－1，照射時(shí)間4 min，照射劑量4 Gy。繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞24、48 和72 h 后，采用CCK-8 法測(cè)定細(xì)胞活力，將每孔中的培養(yǎng)液吸出，加入100 μL 新鮮培養(yǎng)液，再向每孔加入10 μL CCK-8 溶液，繼續(xù)孵育3 h，用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)450 nm 處檢測(cè)吸光度（A）值。按照以下公式計(jì)算細(xì)胞增殖率：細(xì)胞增殖率= （加藥組A 值－空白組A 值）/（對(duì)照組A 值－空白組A 值）×100%。

1.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同細(xì)胞周期細(xì)胞百分率將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種于6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，分 為 對(duì) 照 組、 10 mmol·L－1NaBt 組、20 mmol·L－1NaBt 組、4 Gy X 射 線 照 射 組、10 mmol·L－1NaBt 聯(lián) 合4 Gy X 射 線 照 射 組 和20 mmol·L－1NaBt 聯(lián)合4 Gy X 射線照射組（加入10 和20 mmol·L－1NaBt 24 h 后給予4 Gy X 射線照射）。培養(yǎng)24 h 后收集細(xì)胞，用0.25%胰酶消化成單細(xì)胞懸液后，1 000 r·min－1離心5 min，棄上清，加入1 mL 預(yù)冷的PBS 緩沖液洗滌2 次，加10 mg·L－1RNA 酶50 μL 和5 mg·L－1碘 化 丙 啶（PI） 150 μL，4 ℃避光孵育30 min，用尼龍布過(guò)濾，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同細(xì)胞周期細(xì)胞百分率。采用CellQuest 軟件收取細(xì)胞（每份樣品收取1.0×104個(gè)細(xì)胞），采用ModFit 軟件分析細(xì)胞周期，結(jié)果以細(xì)胞周期各時(shí)相細(xì)胞的百分率表示。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 24.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。各組細(xì)胞增殖率和不同細(xì)胞周期細(xì)胞百分率均符合正態(tài)分布，以表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組細(xì)胞增殖率不同濃度NaBt 單獨(dú)作用A549 細(xì)胞24 h 后，細(xì)胞增殖率無(wú)明顯變化；作用48 和72 h 后，與 對(duì) 照 組 比 較，5、15、20 和25 mmol·L－1NaBt 組細(xì)胞增殖率明顯降低（P＜0.05 或P＜0.01），并呈濃度和時(shí)間依賴(lài)性。

不同濃度NaBt 聯(lián)合4 Gy X 射線照射作用A549細(xì)胞24 h 后，細(xì)胞增殖率略有所升高。聯(lián)合作 用 48 h 后，與 對(duì) 照 組 比 較，15 、 20 和25 mmol·L－1NaBt 聯(lián)合4 Gy X 射線照射組細(xì)胞增殖率明顯降低（P＜0.01）；與4 Gy X 射線照射組比較，15、20 和25 mmol·L－1NaBt 聯(lián)合4 Gy X 射線照射組細(xì)胞增殖率明顯降低（P＜0.05 或P＜0.01）；分 別 與15、20 和25 mmol·L－1NaBt 組 比較，15、20 和25 mmol·L－1NaBt 聯(lián)合4 Gy X 射線照射組細(xì)胞增殖率均明顯降低（P＜0.05）。聯(lián)合作用72 h 后，與對(duì)照組比較，不同濃度NaBt 聯(lián)合4 Gy X 射線照射組細(xì)胞增殖率明顯降低（P＜0.01）；與4 Gy X 射線照射組比較，不同濃度NaBt聯(lián)合4 Gy X 射線照射組細(xì)胞增殖率均明顯降低（P＜0.01）；與相對(duì)應(yīng)濃度NaBt 組比較，20 和25 mmol·L－1NaBt 聯(lián)合4 Gy X 射線照射組細(xì)胞增殖率均明顯降低（P＜0.01）。見(jiàn)表1。

表1 不同濃度NaBt 單獨(dú)或聯(lián)合4 Gy X 射線照射24、48 和72 h 后各組A549 細(xì)胞增殖率Tab.1 Proliferation rates of A549 cells in various groups 24, 48 and 72 h after treated with different concentrations of NaBt alone or combined with 4 Gy X-irradiation

表1 不同濃度NaBt 單獨(dú)或聯(lián)合4 Gy X 射線照射24、48 和72 h 后各組A549 細(xì)胞增殖率Tab.1 Proliferation rates of A549 cells in various groups 24, 48 and 72 h after treated with different concentrations of NaBt alone or combined with 4 Gy X-irradiation

*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group；△P＜0.05，△△P＜0.01 vs NaBt group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs 4 Gy X-ray irradiation group.

Group Proliferation rate（t/h）24 1.00±0.00 48 1.00±0.00 Control NaBt(mmol·L－1)5 10 15 20 25 4 Gy X-ray irradiation NaBt+4 Gy X-ray irradiation 5 mmol·L－1+4 Gy 10 mmol·L－1+4 Gy 15 mmol·L－1+4 Gy 20 mmol·L－1+4 Gy 25 mmol·L－1+4 Gy 0.95±0.33 0.98±0.32 0.98±0.28 1.00±0.03 0.96±0.04 1.02±0.01 72 1.00±0.00 0.95±0.01**0.98±0.01 0.96±0.01*0.95±0.01**0.91±0.02**0.98±0.01 0.61±0.01**0.51±0.04**0.58±0.02**0.62±0.01**0.53±0.03**0.96±0.05 0.61±0.03**##0.53±0.04**##0.55±0.03**##0.49±0.01**△△##0.39±0.02**△△##1.06±0.02*1.15±0.06*1.08±0.01**1.06±0.02**1.02±0.01 0.99±0.03 0.99±0.04 0.91±0.02**△##0.91±0.02**△#0.89±0.01**△##

2.2 各組不同細(xì)胞周期A549 細(xì)胞百分率NaBt單獨(dú)或聯(lián)合4 Gy X 射線照射作用24 h 后，與對(duì)照組比較，10 mmol·L－1NaBt 組G0/G1期細(xì)胞百分率明顯升高（P＜0.01），S 期細(xì)胞百分率明顯降低（P＜0.01）；20 mmol·L－1NaBt 組G0/G1期和G2+M 期細(xì)胞百分率均明顯升高（P＜0.05 或P＜0.01），S 期細(xì)胞 百 分 率 明 顯 降 低（P＜0.01）；4 Gy X 射線照射組和10 mmol·L－1NaBt 聯(lián)合4 Gy X 射線照射組G2+ M 期細(xì)胞百分率均明顯升高（P＜0.01），G0/G1期和S 期細(xì)胞百分率均明顯降低（P＜0.01）。見(jiàn)表2。

3 討 論

隨著醫(yī)療技術(shù)的不斷創(chuàng)新發(fā)展，疾病的診斷與治療手段日益提高，但是肺癌的發(fā)病率仍居高不下，5 年生存率維持在15%左右［19］。目前放射治療是治療肺癌的主要方法之一，NSCLC 的放射性治療推薦劑量非常高，往往達(dá)到60～70 Gy，高劑量的放射治療對(duì)癌細(xì)胞非常有效，也能夠在一定程度上控制患者的病情［20］。但由于癌細(xì)胞的輻射抗性，治療效果與預(yù)期相比仍有很大差距；同時(shí)，正常組織細(xì)胞對(duì)射線敏感，容易產(chǎn)生放射性肺纖維化和放射性炎癥，嚴(yán)重影響了患者的生存質(zhì)量。增加腫瘤細(xì)胞對(duì)放療的敏感性無(wú)疑是提高療效的重要手段［21］。在影響腫瘤發(fā)生發(fā)展的諸多因素中，表觀遺傳學(xué)的改變是新的研究熱點(diǎn)。組蛋白修飾可以改變?nèi)旧|(zhì)的松散程度，也就增加了DNA 的暴露程度，表明組蛋白修飾成為放射增敏靶點(diǎn)的可能。

表2 不同濃度NaBt 單獨(dú)或聯(lián)合4 Gy X 射線照射作用24 h 后各組不同細(xì)胞周期A549 細(xì)胞百分率Tab.2 Percentages of A549 cells in different cell cycles in various groups 24 h after treated with different concentrations of NaBt alone or combined with 4 Gy X-ray irradiation

表2 不同濃度NaBt 單獨(dú)或聯(lián)合4 Gy X 射線照射作用24 h 后各組不同細(xì)胞周期A549 細(xì)胞百分率Tab.2 Percentages of A549 cells in different cell cycles in various groups 24 h after treated with different concentrations of NaBt alone or combined with 4 Gy X-ray irradiation

“－”：No data.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group.

Group Percentage of A549 cells G0/G1 83.057 ± 0.071 G2 + M 2.060 ± 0.839 S Control NaBt(mmol·L－1)10 20 4 Gy X-ray irradiation 10 mmol·L－1 NaBt+4 Gy X-ray irradiation 20 mmol·L－1 NaBt+4 Gy X-ray irradiation 14.883±0.783 2.873±0.062**3.823±0.049**3.403±0.057**3.270±0.162**—93.203±0.482**88.890±0.538**69.103±0.501**64.133±0.904**—3.923±0.245 7.287±0.345*27.490±0.540**32.593±0.952**—

NaBt 是 第Ⅰ類(lèi)HDACi。研 究［22］表 明：NaBt在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中具有抑制腫瘤生長(zhǎng)和誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡及分化的作用，且對(duì)機(jī)體有較低的細(xì)胞毒性。但其在肺癌中作用的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究結(jié)果顯示：NaBt 可以抑制肺癌A549 細(xì)胞增殖，呈時(shí)間和濃度依賴(lài)性，NaBt 和電離輻射聯(lián)合作用可增加A549 細(xì)胞的輻射敏感性，并且對(duì)細(xì)胞的增殖抑制更加明顯，表明對(duì)細(xì)胞毒性作用加強(qiáng)；NaBt 誘導(dǎo)A549 細(xì)胞發(fā)生G0/G1期阻滯，使細(xì)胞停滯在DNA合成前期，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖；而單純電離輻射和NaBt 聯(lián)合電離輻射則誘導(dǎo)A549 細(xì)胞發(fā)生G2+M 期阻滯，使細(xì)胞停滯在對(duì)輻射更為敏感的G2+M 期，表明NaBt 對(duì)A549 細(xì)胞具有增殖抑制作用，并呈濃度依賴(lài)性；NaBt 與電離輻射的聯(lián)合作用效果明顯優(yōu)于NaBt 單獨(dú)作用，對(duì)A549 細(xì)胞的抑制作用更強(qiáng)，而細(xì)胞周期的變化很可能是引起上述現(xiàn)象的因素之一，可能是NaBt 通過(guò)表觀遺傳的改變導(dǎo)致染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化，進(jìn)而引起的一系列變化，其詳細(xì)機(jī)制尚需從細(xì)胞凋亡、細(xì)胞自噬、細(xì)胞周期和DNA 損傷修復(fù)等方面進(jìn)行深入的研究。同時(shí)，在其他對(duì)HDACi 的研究中也得到了類(lèi)似的結(jié)果［23］。RIVERA 等［24］研究顯示： HDACi 阿貝司他（abexinostat） 與射線聯(lián)合應(yīng)用對(duì)NSCLC 的體內(nèi)外抗腫瘤作用增強(qiáng)。

另外，在本實(shí)驗(yàn)中，采用NaBt 作用24 h 后再給予4 Gy X 射線照射，而本課題組在前期實(shí)驗(yàn)中給藥后立即給予X 射線照射，并未出現(xiàn)聯(lián)合作用毒性作用的加強(qiáng)（結(jié)果未列出），表明表觀遺傳的改變需要一定的時(shí)間。

綜上所述，在體外實(shí)驗(yàn)中，NaBt 對(duì)A549 細(xì)胞具有增殖抑制作用和放射增敏作用，并呈濃度和時(shí)間依賴(lài)性，NaBt 和X 射線的聯(lián)合抑制效果明顯優(yōu)于二者單獨(dú)應(yīng)用，其機(jī)制可能是二者聯(lián)合作用引起A549 細(xì)胞G2+M 期阻滯。NaBt 聯(lián)合X 射線照射可提高NSCLC 患者治療的有效性，為NSCLC 的治療提供了新的方法。