RNA原位雜交技術(shù)在昆蟲嗅覺(jué)相關(guān)基因定位中的應(yīng)用

何麗云,王帆,林濤

(上饒師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院,江西 上饒 334001)

昆蟲作為地球上種類最豐富的類群,進(jìn)化出了非常精確和有效的嗅覺(jué)系統(tǒng)[1]。嗅覺(jué)介導(dǎo)昆蟲完成寄主選擇、配偶尋找、天敵躲避等行為,實(shí)現(xiàn)生存和繁衍[2－3]。通過(guò)研究昆蟲的嗅覺(jué)感受的分子機(jī)制,闡明昆蟲識(shí)別氣味分子的方式,可為設(shè)計(jì)高效和特異性的農(nóng)藥提供分子模型。目前研究揭示,參與昆蟲嗅覺(jué)感受的主要包括以下幾類功能蛋白,氣味結(jié)合蛋白(odorant binding protein,OBP)、化學(xué)感受蛋白(chemosensory protein,CSP)、氣味受體(odorant receptor,OR)、離子型受體(ionotropic receptor,IR)、神經(jīng)元膜蛋白(sensory neuron membrane protein,SNMP)和氣味降解酶(odor degrading enzyme,ODE)等[4]。當(dāng)環(huán)境中的氣味分子經(jīng)由昆蟲觸角或下顎須化學(xué)感器表面的孔道進(jìn)入水溶性感器淋巴液(seneillar lymph)后,存在于感器內(nèi)的OBP或CSP與氣味分子結(jié)合,并將氣味分子轉(zhuǎn)運(yùn)至嗅覺(jué)感受神經(jīng)元膜周圍,并激活OR或IR[3]。OR或IR接收氣味信息后,即對(duì)氣味信息的強(qiáng)度和反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行初步的編碼,將化學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)換為電信號(hào)[5],并經(jīng)嗅覺(jué)神經(jīng)元傳遞到昆蟲的中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)。也有研究表明在這個(gè)過(guò)程中,SNMP在昆蟲外周嗅覺(jué)系統(tǒng)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中也起到了重要作用[6]。當(dāng)氣味分子激活OR或IR后,感器內(nèi)的ODE開(kāi)始發(fā)揮作用,它將氣味分子進(jìn)行降解,這避免了化學(xué)信號(hào)持續(xù)地刺激嗅覺(jué)神經(jīng)元,同時(shí)還減小了信號(hào)過(guò)飽和的影響[4,7]。嗅覺(jué)感器通過(guò)表達(dá)不同類型功能性蛋白,并選擇性的與氣味分子結(jié)合,這賦予了感器能夠識(shí)別特異性氣味分子的功能[7－8],因此通過(guò)探測(cè)不同感器中調(diào)控嗅覺(jué)相關(guān)蛋白的基因表達(dá)情況,能夠?yàn)殛U明不同感器的功能特點(diǎn),為明確OR或IR對(duì)氣味編碼機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization,FISH)是一門新興的分子細(xì)胞遺傳學(xué)技術(shù),是20世紀(jì)80年代末期在原有的放射性原位雜交技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種非放射性基因定位技術(shù),具有快速、檢測(cè)信號(hào)強(qiáng)、雜交特異性高和可多重染色等特點(diǎn),能夠可視化的定位出基因在細(xì)胞水平的表達(dá)模式,被廣泛的用于昆蟲嗅覺(jué)相關(guān)基因在觸角上的分布模式和不同基因之間的共定位研究[9－10],為闡明昆蟲感受氣味信息的分子機(jī)制提供了證據(jù)。通過(guò)綜述熒光原位雜交技術(shù)的原理、實(shí)驗(yàn)方法及其在昆蟲嗅覺(jué)相關(guān)蛋白基因組織定位中的應(yīng)用,以期為可視化的研究昆蟲嗅覺(jué)感受的分子機(jī)制提供參考。

1 熒光原位雜交技術(shù)的原理

熒光原位雜交技術(shù)是根據(jù)核酸分子堿基互補(bǔ)配對(duì)原理的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。通過(guò)半抗原標(biāo)記DNA或RNA作為探針,并與經(jīng)過(guò)變性的單鏈核酸序列進(jìn)行互補(bǔ)配對(duì),再通過(guò)攜帶熒光基團(tuán)的抗體去識(shí)別與探針耦聯(lián)的半抗原,在熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡下觀察目標(biāo)序列在組織中的分布情況,進(jìn)而實(shí)現(xiàn)定位靶標(biāo)核酸序列的目標(biāo)[11]。早期的原位雜交技術(shù)使用的是放射性元素對(duì)探針進(jìn)行標(biāo)記,然而這種標(biāo)記方式存在諸多弊端,限制了原位雜交技術(shù)的應(yīng)用。Rudkin等[12]首次利用熒光分子標(biāo)記RNA探針,對(duì)果蠅的染色體基因進(jìn)行定位分析,開(kāi)創(chuàng)了非放射性標(biāo)記的雜交技術(shù)。因熒光原位雜交技術(shù)克服了放射性探針檢測(cè)周期長(zhǎng)且危害人體健康的缺點(diǎn),被廣泛用于染色體的識(shí)別、DNA序列的定位和細(xì)胞內(nèi)m RNA表達(dá)定位等[13]。

2 RNA原位雜交操作程序

2.1 探針制備

相比DNA探針而言,RNA探針因具有易獲得、與m RNA結(jié)合更穩(wěn)定、背景低等優(yōu)勢(shì)而被廣泛應(yīng)用[14]。目前,主要以RNA作為探針對(duì)昆蟲觸角中調(diào)控嗅覺(jué)相關(guān)蛋白的基因表達(dá)進(jìn)行定位研究。RNA原位雜交技術(shù)的探針標(biāo)記分為直接標(biāo)記和間接標(biāo)記兩種方法。直接標(biāo)記是將熒光分子直接標(biāo)記在探針上;間接標(biāo)記是先在RNA探針上連接半抗原物,再用經(jīng)熒光物質(zhì)標(biāo)記的抗體與探針上的半抗原特異性結(jié)合進(jìn)行檢測(cè)目標(biāo)RNA。由于昆蟲觸角中嗅覺(jué)相關(guān)基因表達(dá)量各異,對(duì)于低表達(dá)量的蛋白(如OR),常采用間接標(biāo)記法放大熒光信號(hào),提高檢測(cè)的靈敏度[9]。在間接標(biāo)記法中,最常用的半抗原是生物素(biotin)和地高辛(digoxigenin,Dig)。生物素是一種維生素,其與天然配體親和素(avidin)或鏈霉親和素(streptavidin,SA)具有極高的親和力。地高辛是從洋地黃類植物中提取的類固醇物質(zhì),因大多數(shù)生物體內(nèi)不含該物質(zhì),因此采用地高辛標(biāo)記的探針對(duì)原位雜交檢測(cè)目標(biāo)RNA時(shí),無(wú)背景干擾問(wèn)題[15]。

在制備RNA原位雜交探針時(shí),主要采用體外轉(zhuǎn)錄的方法獲得探針。首先將編碼昆蟲的嗅覺(jué)相關(guān)蛋白目標(biāo)基因克隆至載體的多克隆位點(diǎn)上,其中目標(biāo)基因的兩側(cè)須含有T7和SP6或T7和T3的RNA聚合酶啟動(dòng)子序列。之后,利用合適的限制性內(nèi)切酶將載體線性化,以獲得體外轉(zhuǎn)錄的模板。再應(yīng)用T7和SP6或T7和T3 RNA聚合酶及帶有地高辛標(biāo)記的三磷酸尿苷(uridine triphosphate,UTP)進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄獲得含有地高辛標(biāo)記的正義和反義RNA探針。在合成探針后一般會(huì)用碳酸鹽緩沖液60℃水解若干分鐘將RNA探針進(jìn)行水解以獲得目標(biāo)長(zhǎng)度。不同嗅覺(jué)基因的探針長(zhǎng)度各異,一般探針的長(zhǎng)度為200～800 bp[16－18]。此外,也有通過(guò)化學(xué)合成法將熒光分子連接至探針上,并直接用于原位雜交檢測(cè)目標(biāo)RNA。如Lin等[19]將花氰染料(Cy3)熒光分子直接連接在探針的5′端,并用于檢測(cè)斜紋夜蛾Spodopteralitura觸角上的受體SlituOR3。然而在探針上直接標(biāo)記熒光分子時(shí),雜交后,探針的信號(hào)較弱,且熒光易猝滅和雜交后片子無(wú)法長(zhǎng)久保存等問(wèn)題而限制了其使用范圍。體外轉(zhuǎn)錄法合成RNA原位雜交探針是目前研究昆蟲嗅覺(jué)相關(guān)蛋白基因定位中最常用的方法。首先,通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄合成的探針,其轉(zhuǎn)錄和終止均可有效定位在精確位置,起始于目的DNA上游的啟動(dòng)子,終止于限制性內(nèi)切酶酶切末端。其次,以線性化的載體為模板經(jīng)過(guò)反復(fù)轉(zhuǎn)錄可以合成數(shù)量很多的RNA探針。最后合成的RNA雜交探針活性高,可以檢測(cè)組織中表達(dá)量相對(duì)較低的mRNA,并與之形成穩(wěn)定的二聚體[9]。

2.2 雜交樣品的制備

在制備原位雜交試驗(yàn)樣品時(shí),常用的檢測(cè)材料是觸角的冷凍切片和全觸角(whole mount)。制備觸角冷凍切片樣品時(shí),將觸角從昆蟲的頭部切下,立即用包埋劑進(jìn)行包埋,將樣品放于－24℃～－20℃中冷凍,待冷凍后進(jìn)行固定并進(jìn)行切片,每個(gè)切片的厚度在8～15μm。之后將切片固定于載玻片上,解凍并自然風(fēng)干,隨后將切片置于－80℃環(huán)境中保存?zhèn)溆没蛑苯舆M(jìn)行固定處理。全觸角的原位雜交時(shí),將整個(gè)觸角從新鮮的昆蟲頭部解剖下來(lái),并立即置于固定劑中固定。值得注意的是,在制備雜交樣品時(shí),需要格外注意RNase對(duì)樣品和RNA探針的降解,因此除要嚴(yán)格地對(duì)試劑、耗材進(jìn)行去除RNase的操作外,還應(yīng)該保持實(shí)驗(yàn)環(huán)境的潔凈以減少與RNase的接觸。材料固定的質(zhì)量直接影響組織中mRNA的完整性和原位雜交結(jié)果的可靠性。因此,為獲得較好的結(jié)果,應(yīng)使材料獲得充分的固定。觸角原位雜交實(shí)驗(yàn)中通常采用的固定劑是4%的多聚甲醛。整個(gè)觸角和觸角冷凍切片樣品固定的時(shí)間各不相同,冷凍切片樣品只需在4℃下固定20～30 min,而整個(gè)觸角的固定則時(shí)間更長(zhǎng),6℃下需要固定20～24 h。

2.3 RNA原位雜交

昆蟲觸角m RNA的原位雜交主要包括預(yù)雜交和雜交處理兩個(gè)過(guò)程。預(yù)雜交可以使探針更接近靶標(biāo)RNA,同時(shí)也可以降低非特異性雜交背景。預(yù)雜交的溶液中不包含RNA探針,其他組分與雜交液相同。雜交液的組分在不同的研究中也有變化,但都包含了甲酰胺、檸檬酸鈉緩沖液、硫酸葡聚糖和RNA傳遞體(如酵母t RNA)等[9]。高濃度的檸檬酸鈉緩沖液促進(jìn)整個(gè)溶液體系的穩(wěn)定,甲酰胺可以降低雜交所需的溫度,硫酸葡聚糖可以析出雜交液中的水分進(jìn)而增加探針的濃度以提高雜交的效率,RNA傳遞體可以使探針在整個(gè)觸角中分布均勻。另外,還有一些成分如Denhardt's溶液,吐溫20、Chaps去污劑和EDTA加入雜交液中,其中Denhardt’s溶液和去污劑的用途是減少探針的非特異性雜交,EDTA可增強(qiáng)組織通透性有利于核酸探針穿透進(jìn)入組織,同時(shí),EDTA也可保護(hù)核酸不受濃度、溫度等條件影響,也不會(huì)引起細(xì)胞結(jié)構(gòu)的破壞。通常在預(yù)雜交前需要利用HCl和Triton X－100處理觸角樣品。其中鹽酸處理是為了打斷mRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu),分離多核糖體,Triton X－100是為了增加組織細(xì)胞的通透性有利于探針等大分子進(jìn)入細(xì)胞。

雜交處理過(guò)程中,雜交結(jié)果的特異性和敏感性與雜交的條件密切相關(guān)。雜交條件主要包含雜交的溫度、探針的濃度和雜交持續(xù)的時(shí)間等參數(shù)。常用的雜交溫度為55℃,但其范圍可以為37℃～65℃。雖然雜交信號(hào)在幾個(gè)小時(shí)內(nèi)便可檢測(cè)到,但常用的雜交時(shí)間為48～72 h[9]。探針的濃度對(duì)雜交效果有明顯影響,濃度過(guò)低則使得信號(hào)微弱,難以檢測(cè)到靶標(biāo)RNA,濃度過(guò)高則容易提高背景,同時(shí)也造成探針浪費(fèi)。因此,在雜交前需要對(duì)合成的探針濃度進(jìn)行定量分析以確定最終合適的濃度。預(yù)雜交與雜交處理的溫度相同,預(yù)雜交的時(shí)間范圍為6～72 h。

2.4 雜交后的處理

昆蟲觸角m RNA原位雜交后的處理包括對(duì)樣品的洗滌、抗體雜交和顯色觀察等。雜交結(jié)束后需對(duì)非特異性結(jié)合的探針進(jìn)行洗滌,同時(shí)利用單鏈核酸酶進(jìn)行消化去除多余的探針。常規(guī)的洗滌條件為用含有Triton X－100的檸檬酸鈉緩沖液在60℃下沖洗數(shù)次。隨后是利用特異性抗體識(shí)別探針上所標(biāo)記的半抗原分子,進(jìn)行免疫組織化學(xué)標(biāo)記。免疫標(biāo)記前需要對(duì)樣品進(jìn)行封閉處理,目的是防止抗體的非特異性結(jié)合而出現(xiàn)假陽(yáng)性的結(jié)果,同時(shí)可以降低背景的干擾。例如利用生物素或地高辛標(biāo)記的探針標(biāo)記的樣品,常放置在含Triton X－100的Tris－HCl緩沖鹽溶液中進(jìn)行6℃封閉。封閉后再進(jìn)行抗體孵育反應(yīng),通常是在保濕容器中進(jìn)行6℃孵育48 h?？贵w結(jié)合后,在含吐溫20的緩沖液中進(jìn)行數(shù)次的洗滌,以去除多余的抗體。免疫染色過(guò)程中,抗地高辛的抗體(anti－dioxigenin)或抗生物素的抗體通常會(huì)偶聯(lián)辣根過(guò)氧化酶(horse radish poxidase,HRP)或堿性磷酸酯酶(alkaline phosphatase,AP)。這兩種酶可以催化底物而顯色,實(shí)現(xiàn)目標(biāo)基因的標(biāo)記。HRP可催化底物3,3－二氨基聯(lián)苯胺四鹽酸(3,3－diaminobenzidine tertrahydrochloride,DAB)形成棕色的沉淀,進(jìn)而達(dá)到顯色目的,該反應(yīng)靈敏度高、特異性好,生成的顯色產(chǎn)物不溶于乙醇,故可在DAB顯色后繼續(xù)使用溶于乙醇的染料進(jìn)行雙染色。AP和底物對(duì)甲苯胺蘭(5－bromo－4－chloro－3－indolyl phosphate,BCIP)/氯化硝基四氮唑藍(lán)(nitroblue tetrazolium chloride,NBT)構(gòu)成的顯色系統(tǒng),在AP的催化下,BCIP會(huì)被水解,其產(chǎn)物會(huì)和NBT發(fā)生反應(yīng),形成不溶性的深藍(lán)色至藍(lán)紫色沉淀。HRP和AP的底物顯色反應(yīng)后可使用普通的顯微鏡鏡檢,且顯色可永久保留。該檢測(cè)手段能滿足大部分研究的靈敏度需求。另外,AP還有一種用于熒光檢測(cè)的底物HNPP/Fast Red TR(羅氏公司),可用于激光共聚焦顯微鏡下檢測(cè)雜交信號(hào),可提高熒光檢測(cè)的靈敏度。

3 RNA原位雜交在昆蟲嗅覺(jué)相關(guān)基因定位中的應(yīng)用

3.1 在OBP、CSP和ODE等基因定位中的應(yīng)用

昆蟲OBP和CSP蛋白均參與氣味分子的運(yùn)輸,在氣味信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中起重要作用。Missbach等[20]通過(guò)體外聚合酶轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)制備出地高辛標(biāo)記的RNA探針,與石蛃Lepismachilisy－signata觸角進(jìn)行原位雜交,并通過(guò)HNPP/Fast Red TR顯色系統(tǒng),分別標(biāo)記出Lsig OBP2和LsigOBP5蛋白主要表達(dá)在觸角端部和中部的錐形感器基部細(xì)胞中。Jacquin－Joly等[21]通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄合成一個(gè)600 bp地高辛標(biāo)記的RNA探針,與甘藍(lán)夜蛾Mamestrabrassicae觸角進(jìn)行雜交,通過(guò)NBT/BCIP顯色系統(tǒng),發(fā)現(xiàn)化學(xué)感受蛋白CSPMbra A6主要表達(dá)在觸角長(zhǎng)毛型感器的基部。Schultze等利用該技術(shù)成功的定位了岡比亞按蚊Anophelesgambiae雌成蟲的9個(gè)OBPs在觸角中的表達(dá)區(qū)域,它們主要分布在觸角鞭節(jié)的5～13個(gè)節(jié)段內(nèi),但每種OBP的分布模式不同[16,22－23]。除成蟲外,原位雜交發(fā)現(xiàn)棉貪夜蛾Spodopteralittoralis的幼蟲也會(huì)表達(dá)專門與性信息素結(jié)合的蛋白[10]。昆蟲的ODE能夠快速降解氣味物質(zhì),例如酯酶能夠快速使日本金龜子Popilliajaponica的性信息素失去活性[24]。RNA原位雜交結(jié)果表明,ODE表達(dá)于昆蟲觸角嗅覺(jué)感器的基部,如甘藍(lán)夜蛾的酯酶Mbra－EST表達(dá)于雌雄成蟲觸角的長(zhǎng)毛型感器和短毛型感器中[25],棉貪夜蛾的羧酸酯酶Sl-CXE10主要表達(dá)在雄蟲觸角嗅覺(jué)感器基部和血淋巴液中,另一種酯酶Slit－EST則表達(dá)于雄蟲觸角毛型感器的基部[26－27]。除酯酶外,有研究指出昆蟲觸角中的醛氧化酶、醛脫氫酶和谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶也可能參與氣味的降解過(guò)程,但其分布位置尚不完全清楚[7]。通過(guò)RNA原位雜交技術(shù),Merlin等[28]可視化地提供甘藍(lán)夜蛾觸角中的醛脫氫酶Mbra－AOX選擇性的表達(dá)于嗅覺(jué)感器中,表明其可能參與性信息素或植物揮發(fā)物中醛類的降解。

3.2 在OR、IR和SNMP等基因定位中的應(yīng)用

昆蟲的氣味受體分布于觸角嗅覺(jué)感器內(nèi)神經(jīng)元的樹(shù)突膜上,包含氣味共受體(odorant receptor coreceptor,Orco)和傳統(tǒng)氣味受體OR兩種類型。其中Orco是昆蟲非典型氣味受體,本身不與氣味分子結(jié)合,但能夠提高OR對(duì)氣味的反應(yīng)能力,因此可以利用是否表達(dá)Orco來(lái)間接判斷感器是否參與氣味的識(shí)別。如趙慧婷等[29]通過(guò)RNA原位雜交實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)中華蜜蜂Apisceranacerana的Orco主要在觸角上的毛型感器和板型感器基部表達(dá),間接表明兩種感器均屬于嗅覺(jué)感器。類似的,通過(guò)定位分析發(fā)現(xiàn)飛蝗Locustamigratoria與沙漠蝗Schistocercagregaria的Orco主要在觸角的毛形感器和錐形感器中表達(dá),但不表達(dá)于刺形和腔錐形感器中[30]。傳統(tǒng)氣味受體OR,具有豐富的多樣性,能夠選擇性的與不同類型氣味結(jié)合[7]。RNA原位雜交研究表明棉貪夜蛾氣味受體Slit OR6主要表達(dá)在雄蟲觸角的長(zhǎng)毛形感器中,而雌蟲觸角中并不表達(dá),結(jié)合功能研究表明該氣味受體主要感知雌蟲釋放的性信息素[31]。同樣的家蠶Bombyx mori的氣味受體Bm OR1定位于長(zhǎng)毛型感器內(nèi)部的神經(jīng)元中,能夠特異性的識(shí)別雌蟲釋放的性信息素[32]。除OR外,昆蟲嗅覺(jué)感器中的神經(jīng)元會(huì)表達(dá)一些離子型的受體IR,同樣能夠?qū)Σ煌瑲馕斗肿赢a(chǎn)生反應(yīng),通過(guò)RNA原位雜交研究表明,IR主要表達(dá)于腔錐型感器內(nèi)的神經(jīng)元中[33],其對(duì)氣味的反應(yīng)譜與OR存在差異[34－35]。通過(guò)cDNA文庫(kù)篩選及RNA原位雜交發(fā)現(xiàn)昆蟲中存在SNMP蛋白[7,36],它主要表達(dá)于毛型和錐形兩種感器內(nèi)的神經(jīng)元或支持細(xì)胞中,并參與信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)[37－38]。例如Sun等[17]應(yīng)用該技術(shù)定位出茶尺蠖Ectropisobliqua成蟲2種神經(jīng)元膜蛋白EoblSNMP1和EoblSNMP2在觸角中的表達(dá)位置,其中EoblSNMP1僅在部分I型毛形感器的基部表達(dá),而EoblSNMP2在幾乎所有的I型毛形感器和錐形感器中都有表達(dá)。

3.3 嗅覺(jué)相關(guān)基因的共定位研究

嗅覺(jué)感受是多蛋白質(zhì)相互作用的過(guò)程,RNA原位雜交為闡明嗅覺(jué)蛋白互作提供了最直接的可視化證據(jù)。通過(guò)分別對(duì)地高辛和生物素兩種半抗原來(lái)標(biāo)記OR和OBP探針,并與岡比亞按蚊觸角雜交表明,氣味結(jié)合蛋白AgOBP47分別與氣味受體Ag OR11、AgOR13和Ag OR55共定位于觸角同一感器細(xì)胞內(nèi)[16],AgOBP1與AgOR1、AgOBP4與AgOR2共定位于同一感器細(xì)胞中[22]。類似的蝗蟲氣味結(jié)合蛋白Obp1與氣味受體OR2共定位于下顎須的錐形感器中,Obp2a與IR8a共定位于下顎須的刺形感器中[39]。Krieger等[40]應(yīng)用原位雜交發(fā)現(xiàn)煙芽葉蛾Heliothisvirescens兩個(gè)受體HR11和HR13與性信息素結(jié)合蛋白PBP共定位于長(zhǎng)毛型感器基部,并且這兩種受體同時(shí)成對(duì)出現(xiàn),推測(cè)這兩個(gè)受體是感知雌蟲釋放的性信息素中的不同組分。冬尺蠖Operophterabrumata的Orco廣泛表達(dá)于嗅覺(jué)相關(guān)感器內(nèi),并且在部分長(zhǎng)毛型感器的基部Orco與Obru OR1存在共定位[41]。在沙漠蝗Schistocercagregaria中觸角中表達(dá)IR的細(xì)胞與表達(dá)的Orco基因的細(xì)胞并不重疊,這說(shuō)明IR與OR識(shí)別不同類型氣味信息[42]。通過(guò)這些研究能夠?yàn)槊鞔_昆蟲嗅覺(jué)相關(guān)蛋白之間的互作方式提供可視化的證據(jù),同時(shí)也為進(jìn)一步研究嗅覺(jué)感受的分子機(jī)制指出具體的方向。

4 小結(jié)及展望

熒光原位雜交技術(shù)以其靈敏度高、特異性強(qiáng)、探針可通過(guò)體外反轉(zhuǎn)錄獲得等優(yōu)勢(shì)被廣泛用于基因表達(dá)定位中。近20年來(lái),該技術(shù)先后被用于多種昆蟲的嗅覺(jué)蛋白定位研究中,提供的可視化的研究結(jié)果為闡明嗅覺(jué)感受的分子機(jī)制提供了重要的基礎(chǔ)。然而,該技術(shù)在進(jìn)行定位研究中并不容易實(shí)現(xiàn),其要求實(shí)驗(yàn)環(huán)境無(wú)RNA酶污染、RNA探針在觸角內(nèi)部的滲透性強(qiáng),背景噪聲低及雜交后熒光信號(hào)不猝滅等。此外,由于不同昆蟲觸角內(nèi)的嗅覺(jué)相關(guān)基因表達(dá)量各不相同,因此需要反復(fù)摸索相應(yīng)的探針濃度,過(guò)高會(huì)導(dǎo)致背景染色強(qiáng),容易出現(xiàn)假陽(yáng)性,過(guò)低則容易導(dǎo)致信號(hào)難以檢出。針對(duì)RNA在觸角內(nèi)低表達(dá)量的問(wèn)題,Xu等[9]利用酪酰胺信號(hào)放大(tyramide signal amplification,TSA)技術(shù),使探針標(biāo)記后的細(xì)胞周圍產(chǎn)生大量的熒光信號(hào),實(shí)現(xiàn)了極微量的RNA的可視化定位。隨著成像技術(shù)和基因編輯技術(shù)等的發(fā)展與應(yīng)用,相信未來(lái)會(huì)有更多新的技術(shù)手段被應(yīng)用于熒光原位雜交中,必將極大地推動(dòng)該技術(shù)在昆蟲嗅覺(jué)相關(guān)基因定位應(yīng)用中的發(fā)展。