根瘤菌多樣性研究技術(shù)進展

馬蓮菊, 朱 淼, 汪雅楠, 朱夢卓, 趙曉妍, 董芮萌, 王 澤

(沈陽師范大學 生命科學學院, 沈陽 110034)

0 引 言

根瘤菌屬于革蘭氏陰性菌,呈桿狀或球狀,與特定宿主植物結(jié)瘤形成共生固氮體系[1]。共生固氮體系的形成由多方面因素共同調(diào)節(jié),植物在根瘤菌刺激下產(chǎn)生類黃酮物質(zhì)激活結(jié)瘤基因nod,根瘤菌內(nèi)部會產(chǎn)生根瘤菌粘附素(rhicadhesin)以及胞外多糖等物質(zhì),在這一系列物質(zhì)共同作用下使其附著于根部[2]。根瘤菌借助于植物的根毛尖端位置進入宿主植物的皮層,在皮層處進行大量繁殖。皮層細胞則由于根瘤菌的分泌物刺激而快速分裂,最后根瘤菌被包裹于該皮層細胞中央,二者結(jié)合形成根瘤。豆科植物為根瘤菌提供水、有機物和礦物質(zhì)等,根瘤菌則幫助豆科植物將空氣中游離的氮還原為銨態(tài)氮,為植物提供氮源,同時使土壤肥力得到提升[3]。

根瘤菌在農(nóng)業(yè)、環(huán)境和生態(tài)等方面起著可持續(xù)發(fā)展的作用[4]。根瘤菌多樣性是指不同根瘤菌在生理結(jié)構(gòu)、生化特征和基因結(jié)構(gòu)等方面表現(xiàn)的特異性差異。根瘤菌在長期進化過程中不僅受宿主的選擇,而且也受環(huán)境因素影響,因而根瘤菌不斷地朝著多個方向演變和進化,致使其生物多樣性豐富[5]。目前,在生物固氮研究領(lǐng)域內(nèi),根瘤菌多樣性研究是一個熱點,研究技術(shù)體現(xiàn)出多學科的交叉、滲透與綜合[6]。系統(tǒng)發(fā)育是現(xiàn)代根瘤菌分類系統(tǒng)得以建立的一個重要基礎(chǔ),通過對根瘤菌系統(tǒng)發(fā)育開展進一步的分析,能夠把握根瘤菌與其他相關(guān)菌種之間的聯(lián)系,同時也能分析根瘤菌演變的歷程,進而可以確定根瘤菌在系統(tǒng)中的地位。本文對根瘤菌表型多樣性和遺傳型多樣性的研究技術(shù)進行綜述,以期為根瘤菌的系統(tǒng)分類提供理論依據(jù)。

1 表型多樣性

根瘤菌的表型分群是指在根瘤菌的形態(tài)特征、血清學反應(yīng)及其生理功能等方面,利用數(shù)值分類[7]、全細胞可溶性蛋白電泳[8]、多位點酶電泳[9]和細胞脂肪酸組成分析[10]等技術(shù)進行初步分群,揭示根瘤菌的生物多樣性。

1.1 數(shù)值分類

數(shù)值分類法是細菌分類中常用的一種方法,主要是借助計算機系統(tǒng)對所需要分類的細菌或根瘤菌表型性狀的相似程度進行數(shù)值分析歸類。數(shù)值分類結(jié)果與傳統(tǒng)方法分類結(jié)果一致,但與傳統(tǒng)方法相比具有一定優(yōu)點。通過借助計算機對表型特征數(shù)據(jù)進行比較,計算機的分析可以在一定程度上有效避免人為主觀性對結(jié)果造成的影響[11]。另外,實驗過程經(jīng)過對表型系統(tǒng)分析可得到聚類分析圖譜,能夠準確揭示表型一致或差異的根瘤菌菌株,此過程以相似性80%作為種群劃分標準[12]。

數(shù)值分類通常被用在根瘤菌多樣性和分類的初步研究中,谷峻等[13]通過采用表型數(shù)值分類等方法,對20株甘草根瘤菌在碳、氮源以及生理生化性狀等方面進行測定分析,結(jié)果表明,與甘草共生的根瘤菌分為3個菌屬,具有豐富表型多樣性。劉洋等[14]主要對30株巖黃芪根瘤菌不同方面進行研究,從營養(yǎng)利用、抗生素抗性到抗逆性等方面分析結(jié)果進行數(shù)值分類,得出不同地域或不同宿主的根瘤菌都具有豐富表型多樣性的結(jié)論。韋革宏等[15]也通過采用數(shù)值分類的方法,在唯一碳、氮源的利用等方面對40株菌株進行測定,同樣證實了供試菌株具有表型多樣性。

1.2 全細胞可溶性蛋白電泳

全細胞可溶性蛋白電泳,即SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳,是應(yīng)用于細胞表型多樣性研究的重要基礎(chǔ)。該電泳技術(shù)既能夠準確地分析各種可溶性蛋白的組成成分,又能夠?qū)ι锏鞍踪|(zhì)圖譜的信息進行分析和研究。根瘤菌的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)復(fù)雜,多態(tài)性信息量大,利用全細胞可溶性蛋白電泳技術(shù)研究根瘤菌,從蛋白質(zhì)電泳圖譜上表現(xiàn)出來的多態(tài)性能夠反映出根瘤菌的多樣性[16]。隨著技術(shù)的發(fā)展,凝膠掃描以及分析軟件的出現(xiàn)與普及,SDS-PAGE在原本基礎(chǔ)上變得更加快速、簡便且重復(fù)性好。近年來,SDS-PAGE技術(shù)被用于菌種相互之間與種內(nèi)差異的分析與研究[17]。汪恩濤等[18]運用凝膠電泳技術(shù),對40余種根瘤菌菌株的可溶性蛋白進行分析測定,結(jié)果證明此方法可用來分析根瘤菌表型多樣性。閆愛民等[19]對干旱地區(qū)根瘤菌菌株進行電泳分析,結(jié)果證明蛋白分析的聚類結(jié)果與數(shù)值分類結(jié)果相近。劉曉云等[20]也采用了SDS-PAGE分子標記法,對篩選的120株根瘤菌進行初步分群得到 104個類型。

1.3 多位點酶電泳

多位點酶主要是指不同位點上的基因序列所編碼的具有相同作用的酶。通過多位點酶電泳技術(shù)(MLEE)對根瘤菌多樣性進行分析是利用酶的特異性的原理對酶進行分離,即不同種類的酶與特異性底物反映顯示不同顏色,最后對電泳的遷移率進行比較,得到酶譜推理根瘤菌多樣性[21]。利用多位點酶電泳技術(shù)分析菌落多樣性在根瘤菌表型多樣性分析中具有重要地位。在根瘤菌分類與表型多樣性研究中,多位點酶電泳技術(shù)已被證明是初步分群的有效辦法。王素英等[22]對黃芪根瘤菌,許曉東等[23]對天山根瘤菌利用多位點酶電泳技術(shù)進行研究分析,結(jié)果表明,多位點酶電泳圖譜聚類分析結(jié)果與數(shù)值分類的結(jié)果基本一致,可以作為根瘤菌分群手段。李穎[24]對寧夏沙坡頭地區(qū)的17種根瘤菌進行多位點酶電泳分析,結(jié)果表明異檸檬酸脫氫酶、超氧化物歧化酶等酶譜更有利于區(qū)分不同根瘤菌種群。

1.4 細胞脂肪酸組成與脂多糖分析

脂肪酸是酯類和其他脂多糖的重要構(gòu)成部分,在細胞膜上廣泛存在。不同種屬細菌對應(yīng)的脂肪酸碳鏈的取代基團、雙鍵位置和長度等方面存在較大差異。微生物學研究表明,細菌的DNA與細胞結(jié)構(gòu)中常見的脂肪酸具有高度的同源性,不同類型的細菌含有的脂肪酸在含量或組成成分上存在差異,且差異具有穩(wěn)定性。因此,建立具有不同種類細菌獨特特征的細胞脂肪酸指紋圖譜,可得到目的菌株的表型多樣性[25]。根瘤菌的脂多糖結(jié)構(gòu)和根瘤菌豆科植物共生固氮體的形成有著密切關(guān)系。與細胞脂肪酸同理,對于不同種類根瘤菌,通過脂多糖分析可將糖的排列方式與種類的差異反映出來[26]。

目前,脂肪酸分析各部分技術(shù)均可高度自動化。張小平等[27]對分離自花生的22種根瘤菌的細胞脂肪酸組成進行測定,結(jié)果顯示花生根瘤菌的進化方向與大豆根瘤菌一致,說明細胞脂肪酸組成分析法結(jié)果具有可信性。程濤等[28]采用全細胞脂肪酸組分分析法,對分離自木本豆科植物的根瘤菌進行鑒定,結(jié)果發(fā)現(xiàn)所測的2株根瘤菌為根瘤菌屬中的新種。卜常松等[29]通過氣相色譜分析大豆根瘤菌的細胞脂肪酸,最終將供試菌株分為6種不同菌株。

2 遺傳型多樣性

表型特征能夠綜合反映出根瘤菌表型多樣性,但無法將根瘤菌的全部遺傳信息反映出來。有研究表明,在表型多樣性分析中即使將待測菌株的指標增加至300項,經(jīng)過聚類分析得到的結(jié)果也只能反映該生物的5%～20%的遺傳信息[30]。遺傳信息主要儲存在核酸內(nèi),通過對核酸信息變化進行分析,可以揭示根瘤菌間親緣關(guān)系。因此,選擇基因序列或一些特定基因片段進行檢測已成為建立根瘤菌系統(tǒng)發(fā)育系統(tǒng)的常規(guī)手段[31]。

2.1 基因組水平指紋圖譜

基因組水平指紋圖譜分析是指在基因組水平上檢測并分析基因的多態(tài)性。不同的生物個體或不同種群在基因上存在差異,利用基因組水平指紋圖譜分析可以對其進行分類?；蚪M水平研究的主要手段有基因組物理結(jié)構(gòu)分析、隨機擴增DNA片段的多態(tài)性分析、AFLP指紋分析技術(shù)、rep-PCR指紋分析技術(shù)和穩(wěn)定小分子RNA圖譜等。

1) 基因組物理結(jié)構(gòu)分析是通過對細菌全基因組DNA序列進行分析,得到目的菌株全部遺傳信息,是目前研究系統(tǒng)發(fā)育最為準確的方法,但對于大量待測菌株而言,耗資巨大。鄭君芳等[32]利用Ⅰ-CeuⅠDNA內(nèi)切酶對64株根瘤菌總DNA進行酶切,通過基因組物理結(jié)構(gòu)分析明確了根瘤菌系統(tǒng)的發(fā)育關(guān)系。

2) 隨機擴增多態(tài)性DNA標記技術(shù)(RAPD) 是通過對PCR產(chǎn)物開展分析,同時借助生物性狀表現(xiàn)規(guī)律和基因排列間的相互關(guān)聯(lián)完成一系列預(yù)測。該項技術(shù)需要選用寡核酸片段來作為引物,一般為8～10 bp核苷酸片段,利用PAGE電泳技術(shù)開展DNA多樣性的檢測[33]。陳麗云等[34]通過RAPD技術(shù)對分離自苜蓿和草木樨的根瘤菌進行分析,結(jié)果表明17株菌株分別來自6個不同菌系。隋新華等[35]利用RAPD等方法對分離自我國北方山黎豆屬和棘豆屬的植物根瘤菌進行研究,結(jié)果表明山黎豆屬植物主要與根瘤菌屬結(jié)瘤,而棘豆屬植物主要與中華根瘤菌屬結(jié)瘤。楊成運等[36]通過RAPD等方法對分離自我國亞熱帶地區(qū)42株豌豆根瘤菌進行研究,結(jié)果表明這些供試菌株具有明顯的地域特征。

3) AFLP指紋分析技術(shù)[37],即對擴增片段長度多態(tài)性進行分析。隨著儀器設(shè)備的更新,AFLP技術(shù)結(jié)合熒光標記技術(shù)稱為FAFLP技術(shù)。FAFLP技術(shù)使多態(tài)性分析技術(shù)反應(yīng)可在測序儀器上進行,數(shù)據(jù)更加標準,也使AFLP指紋圖譜相互比較更加方便[38]。建立AFLP指紋圖譜信息數(shù)據(jù)庫,便于AFLP比較,增加信息穩(wěn)定性和可靠性[39]。陳強等[40]運用AFLP等技術(shù)對四川省23株葛藤屬根瘤菌進行遺傳特性研究,經(jīng)過分析顯示,此批菌株分為7個遺傳群。賈騰飛等[41]在已建立的AFLP體系下,結(jié)合地理生物學因素,對青海省不同地區(qū)的蠶豆根瘤菌進行遺傳特性研究,結(jié)果可將這些根瘤菌分為2個AFLP遺傳群,2個主群又分為4個亞群。徐開未等[42]應(yīng)用RFLP,AFLP等技術(shù)對涼山州新銀合歡中分離的33株根瘤菌進行遺傳特性研究,結(jié)果表明,這些根瘤菌有豐富的多樣性,可分為4個菌屬。

4) rep-PCR指紋分析技術(shù)是指對根瘤菌基因組重復(fù)序列進行PCR的技術(shù)。根瘤菌基因組中分布較為廣泛的短基因序列有REP[43], ERIC[44]和BOX[45],這些短基因序列都存在于根瘤菌基因組中,堿基小于200 bp且含有多個拷貝。Mosbah等[46]運用rep-PCR技術(shù)對沙特阿拉伯西南部5種植物中分離得到的75株根瘤菌進行遺傳多樣性鑒定,結(jié)果表明可將其分為4個已知的結(jié)核桿菌屬,具有良好多樣性。孟頌東等[47]和李俊等[48]應(yīng)用rep-PCR技術(shù)對新疆大豆根瘤菌和中國花生根瘤菌進行指紋分析,結(jié)果表明來自同一地區(qū)根瘤菌具有較高遺傳相似性,不同地區(qū)根瘤菌間有豐富的遺傳多樣性。

5) 穩(wěn)定小分子(LWMRNAS)RNA圖譜包括5S rRNA和tRNA,該技術(shù)在微生物分類鑒定方面具有很大的潛力[49]。穩(wěn)定小分子RNA有穩(wěn)定且能反映種屬差異的特點,常被應(yīng)用于根瘤菌的分類研究中[49]。楊帆等[51]對穩(wěn)定小分子量RNA指紋圖譜技術(shù)的原理和發(fā)展歷程進行綜述,同時對該技術(shù)在根瘤菌分類研究中的應(yīng)用現(xiàn)狀和前景進行了闡述。

2.2 特殊基因擴增片段酶切圖譜分析

根瘤菌屬于原核生物,rRNA包括5S, 16S和23S 3種。5S rRNA片段小,能夠攜帶的遺傳信息少,不能體現(xiàn)微生物多樣性;16S rRNA, 23S rRNA, 16S-23S rRNA基因間隔區(qū)序列(IGS)等序列攜帶遺傳信息可以體現(xiàn)遺傳多樣性,因此可選擇16S rRNA, 23S rRNA, IGS序列的特異性片段、限制性片段進行研究[52]。特異性片段多態(tài)性分析(ARDRA)技術(shù)常被用于根瘤菌種、屬水平的分群和系統(tǒng)分類研究中[53]。李彪等[54]對在蘭坪鉛鋅尾礦區(qū)豆科植物分離的49株根瘤菌進行ARDRA分析,結(jié)果表明這些根瘤菌在系統(tǒng)發(fā)育樹中分別屬于3個系統(tǒng)發(fā)育分支,進一步說明其具有良好的遺傳多樣性。

16S rRNA序列是最早被用于根瘤菌分類揭示根瘤菌系統(tǒng)發(fā)育的保守基因[55],16S rRNA全序列的測定在細菌分類中占有不可或缺的地位[56]。研究發(fā)現(xiàn)種間有16S rRNA基因片段相互轉(zhuǎn)移的現(xiàn)象,即16S rRNA核苷酸序列中包含了不同來源的16S rRNA序列[57-58],這些研究結(jié)果表明如果僅依據(jù)根瘤菌的16S rRNA建立系統(tǒng)發(fā)育體系,確定菌株多樣性較為片面,確定菌株種屬應(yīng)建立在多個基因序列分析乃至全基因組序列分析的基礎(chǔ)上。

隨著基因組測序技術(shù)的發(fā)展與完善,有專家學者在研究根瘤菌系統(tǒng)發(fā)育時會選擇23S rRNA基因序列分析。Van等[59]通過對rrn操縱子內(nèi)3個位點的測序分析,比較一組具有代表性的α-變形桿菌之間的進化關(guān)系,得出23S rRNA與16S rRNA序列分析的結(jié)果有很大差異性。23S rRNA核苷酸序列有種間或菌株間特異性和高度變異區(qū),針對這一特性可以利用原位雜交探針鑒定根瘤菌遺傳型多樣性,該技術(shù)在根瘤菌遺傳多樣性研究中具有重要地位。潘峰等[60]采用16S-23S rRNA基因區(qū)間(intergenic spacer region, ISP)的PCR-RFLP對飯豆根瘤菌進行了遺傳型多樣性和系統(tǒng)發(fā)育分析,發(fā)現(xiàn)所有菌株最終形成了慢生型菌群與快生型菌群兩大菌群。高俊蓮等[61]選取40株未知斜莖黃芪根瘤菌與14株已知根瘤菌,通過23S rRNA PCR-RFLP比較分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)其具有良好的遺傳多樣性且與聚類分析樹狀圖譜有較好的一致性。

3 展 望

根瘤菌作為一種高效的自然微生物資源,其開發(fā)利用越來越引起人們的關(guān)注。近年來,根瘤菌多樣性研究技術(shù)取得了長足的發(fā)展,從早期利用數(shù)值分類和SDS-PAGE等方式研究表型多樣性,到目前利用根瘤菌基因序列研究遺傳多樣性,這樣既有助于人們對根瘤菌多樣性以及系統(tǒng)發(fā)育的深入研究,也提高了研究結(jié)果的準確性。在系統(tǒng)發(fā)育研究中,多技術(shù)的綜合應(yīng)用可提高實驗數(shù)據(jù)的準確性,對根瘤菌系統(tǒng)發(fā)育研究有著重要意義。

豆科植物除了有共生固氮改善土壤養(yǎng)分的作用,還可以起到保護水土、防風固沙和改善土壤環(huán)境等重要作用,而這些作用都離不開根瘤菌。我國豆科植物資源非常豐富,遍布于溫帶、亞熱帶等多個地區(qū),根瘤菌來源豐富。大力開發(fā)不同環(huán)境條件下、不同宿主植物中根瘤菌,以及分離篩選出人們能夠加以利用的優(yōu)勢菌種具有重要意義。目前,根瘤菌資源的開發(fā)利用率還較低,只有較少一部分的根瘤菌被制作菌劑,用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、環(huán)境改善和科學研究等方面。因此,現(xiàn)階段主要任務(wù)除了對已開發(fā)的菌種資源進行有效的保護和深入研究外,還應(yīng)繼續(xù)對自然界中新分離篩選的根瘤菌進行種屬分類,進一步豐富擴大根瘤菌菌種資源庫。