基于EKR/AKT 信號通路探討濕熱中阻方改善脾胃濕熱小鼠癥狀的分子機(jī)制

尤 文，周麗雅*，魏 巖，曹 路，張益蒴

（1.長春中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，長春 130117；2.長春科技學(xué)院醫(yī)藥學(xué)院，長春 130600）

脾胃濕熱證是濕熱蘊(yùn)結(jié)脾胃，致脾失健運(yùn)、胃失納降而形成的證候[1]。脾胃是先天之本，氣血生化之源[2]，若感受濕邪、飲食不節(jié)制，就會導(dǎo)致痰濕內(nèi)生，郁久化熱，從而生成濕熱之邪，故“清熱祛濕”是治療的根本[3]。本研究中濕熱中阻方是王氏連樸飲[4]加海螵蛸、白及、瓦楞子而成，具有燥濕化濁、清透蘊(yùn)熱、理氣宣通、調(diào)達(dá)中州功效。經(jīng)查閱文獻(xiàn)可知，脾胃濕熱證的改善與炎癥通路、自噬通路相關(guān)[5-6]，炎癥反應(yīng)的發(fā)生將影響局部細(xì)胞的免疫反應(yīng)增強(qiáng)，釋放炎癥因子的同時(shí)，會釋放氧自由基[7-8]，直接或者間接影響到血管內(nèi)皮的損傷[9]。本實(shí)驗(yàn)選取ERK/AKT 通路展開研究，探究濕熱中阻方改善具脾胃濕熱癥狀患鼠的分子機(jī)制。報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 動物與材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 SPF 清潔級昆明小鼠（18～20 g）60 只，雌雄各半，周齡6～8 周，購自遼寧長生生物技術(shù)有限公司[生產(chǎn)許可證號SCXK（遼）2015-0001]。所有小鼠飼養(yǎng)于潔凈級別大于10 000 的飼養(yǎng)室內(nèi)，噪音（無動物時(shí)＜50 dB），晝夜循環(huán)（12 h/12 h），室溫22～24℃，相對濕度50%～55%，動物自由攝食飲水。實(shí)驗(yàn)開始前動物適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，實(shí)驗(yàn)期間實(shí)驗(yàn)動物倫理嚴(yán)格按照減少，替代，優(yōu)化原則進(jìn)行管理[10]。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)用藥與主要試劑 濕熱中阻方，長春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院提供；RIPA 裂解液（P0013B），BCA 蛋白濃度測定試劑盒（P0012S），上海碧云天生物技術(shù)有限公司；胃泌素（GAS）試劑盒（H239）、胃東素（MTL）試劑盒（H182），南京建成生物工程研究所有限公司；極超敏ECL 化學(xué)發(fā)光即用型底物（AR1191），武漢博士得生物工程有限公司；ERK（4695T）、p-AKT（3787S）、GAPDH（5174S），美國Cell Signaling Technology 公司；羊抗兔IgG[Goat Anti-Rabbit IgG（H+L）HRP，ZJ2020-R]、羊抗鼠IgG[Goat Anti-Mouse IgG（H+L）HRP，ZJ2020-M]，美國Bioworld Technology 公司；引物序列（ERK、AKT、GAPDH），生工生物工程（上海）股份有限公司；白酒（紅星二鍋頭55 度，SC11511160310087），北京紅星股份有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)用藥制備與儲存 濕熱中阻方由王氏連樸飲加海螵蛸、白及、瓦楞子成方。按照《醫(yī)療機(jī)構(gòu)中藥煎藥室管理規(guī)范》制備中藥復(fù)方湯劑，濃縮后每1 mL 藥液中含生藥量1.2 g，干燥器儲存。

1.2.2 模型制備與藥物干預(yù) 所有小鼠隨機(jī)分配6 組：空白組（A 組）、模型組（B 組）、濕熱中阻方低劑量組（C 組）、濕熱中阻方中劑量組（D 組）、濕熱中阻方高劑量組（E 組）、陽性藥組（F 組）。除空白組外，其余各組小鼠建立脾胃濕熱模型，即喂養(yǎng)普通飼料同時(shí)，添加200 g/L 蜂蜜水自由飲用，隔日按照m/m 對每只小鼠灌服油脂（10 g/kg），再隔日v/m灌服白酒。30 d 后，采集小鼠生理信息，追蹤鼠精神狀態(tài)、日?；顒?、反應(yīng)情況等一般生理指標(biāo)，并每組隨機(jī)抽取小鼠，剖腹分離胃組織，利用HE 染色對模型進(jìn)行評價(jià)。篩選模型成功小鼠，治療各組按照《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》（徐叔云，主編）人鼠等效劑量比值換算，小鼠給藥劑量為成人9.1倍，給予濕熱中阻方（濃縮復(fù)方選取蒸餾水稀釋），每只鼠每日1 次進(jìn)行灌胃，空白組、模型組給予相同條件的蒸餾水刺激，實(shí)驗(yàn)中對各組小鼠進(jìn)行一般情況記錄。實(shí)驗(yàn)共干預(yù)7 d，隨后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)取材。

1.2.3 酶聯(lián)免疫吸附法（Enzyme linked immunosorbent assay，Elisa）檢測胃腸激素水平 給藥7 d 后，眼球取血置離心管內(nèi)，室溫靜置0.5 h 后，離心15 min（3 000 r/min），回收上清，按照試劑盒說明書進(jìn)行檢測并計(jì)算比較各組GAS、MLT 含量的表達(dá)。

1.2.4 蘇木精-伊紅染色法（Hematoxylin-Eosin staining,HE）觀察組織形態(tài)學(xué)改變 取血后斷頸法處死小鼠，剖腹分離胃組織，置于4%多聚甲醛中固定過夜，修剪組織后置于脫水盒中，按組標(biāo)記并利用組織脫水機(jī)進(jìn)行脫水處理，隨后進(jìn)行組織包埋，-20 ℃進(jìn)行蠟塊成形固定，修整蠟塊后進(jìn)行組織切片，片厚為4 μM，烘烤后進(jìn)行HE 染色，并在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察，從病理學(xué)角度，判斷各組組織情況，做出病理學(xué)描述。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量法（q-PCR）檢測關(guān)鍵基因表達(dá) 取血后斷頸法快速處死小鼠，剖腹分離胃組織，進(jìn)行總RNA 提取，并對其純度以及完整性進(jìn)行檢測，之后按照cDNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明配制溶液，進(jìn)行梯度反應(yīng)，時(shí)間為30 min，隨后按照試劑盒說明進(jìn)行試劑配制，進(jìn)行RNA 定量檢測，時(shí)間為90 min，目的基因（引物序列見表1）均與內(nèi)參（GAPDH）進(jìn)行相對比較，計(jì)算相對基因表達(dá)。

表1 PCR 引物及產(chǎn)物大小

1.2.6 蛋白免疫印跡法（WB）檢測目的蛋白 取胃組織，在液氮中研磨后，加入RIPA 蛋白裂解液，4℃用勻漿機(jī)細(xì)碎組織，離心去除多余雜質(zhì)后，利用WB 實(shí)驗(yàn)檢測已經(jīng)提取的胃組織目的蛋白表達(dá)水平，主要步驟為配置8%～12% SDS-PAGE 分離凝膠和5% SDSPAGE 濃縮凝膠，電泳濃縮凝膠部分用80～110 v 進(jìn)行電泳，30 min 后調(diào)整電壓為110 v 進(jìn)行分離凝膠部分電泳，時(shí)間為90 min，之后利用聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF）進(jìn)行濕法轉(zhuǎn)膜，進(jìn)行凝膠-PVDF 膜蛋白轉(zhuǎn)移，5% BSA 溶液進(jìn)行1 h 封閉，一抗孵育，濃度為1:1000-1:2500，4℃搖床過夜，TBST 清洗液清洗5 次，1 次5 min，后進(jìn)行二抗孵育，均都為1:2 000-1:5 000，室溫?fù)u床1 h，清洗后，通過增強(qiáng)的ECL 進(jìn)行化學(xué)顯色，令蛋白表達(dá)可視化，最終用Image J得到目的蛋白灰度值，并計(jì)算目的蛋白表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法使用SPSS 21.0、GraphPad Prism 8.0數(shù)據(jù)處理軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)可視化、整理和分析，數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，采用單向方差分析法、Turkey檢驗(yàn)用于各組間比較，P＜0.05 被認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 濕熱中阻方對脾胃濕熱小鼠血清中胃腸激素表達(dá)的影響如表2 所示，與空白組比較，造模后，小鼠血清中GAS、MTL 含量表達(dá)下降，分別為65.81%、40.98%，具顯著性差異（P＜0.05）。在給予濕熱中阻方后，GAS、MTL 表達(dá)抑制均得到改善，其中高劑量組抑制效果最佳，與模型組比較，分別回調(diào)65.99%和46.14%，且效果強(qiáng)于陽性藥組，與陽性藥組比較，高劑量組表達(dá)GAS 含量高于3.87%、MTL 含量高于2.97%，但數(shù)據(jù)間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。以上結(jié)果表明，濕熱中阻方能顯著性的改善脾胃濕熱癥狀小鼠的胃腸激素表達(dá)水平，并且與劑量呈正相關(guān)，這與臨床結(jié)果一致。

表2 小鼠血清中胃腸激素表達(dá)（，n=10） ng/L

表2 小鼠血清中胃腸激素表達(dá)（，n=10） ng/L

注：與A 組比較，## P＜0.01，### P＜0.001；與B 組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01

2.2 濕熱中阻方對脾胃濕熱小鼠胃組織形態(tài)學(xué)影響根據(jù)HE 染色結(jié)果，可看出空白組小鼠胃組織黏膜層結(jié)構(gòu)完整，上皮細(xì)胞排列緊密，固有層胃腺豐富，未見炎癥反應(yīng)（圖1-A）。而模型組胃組織黏膜層上皮細(xì)胞脫落（黑色箭頭），固有層和黏膜下層可見少量炎性細(xì)胞浸潤（圖1-B）；與模型組比較，胃組織黏膜層的上皮細(xì)胞脫落、固有層胃腺減少，主細(xì)胞、壁細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)異常，黏膜下層水腫、結(jié)締組織排列疏松的情況，治療藥各組均有改善（圖1-C、D、E），并且比對各治療組后，發(fā)現(xiàn)隨著濕熱中阻方給藥劑量增加，具有脾胃濕熱癥狀的小鼠胃組織固有層和黏膜下層的淋巴細(xì)胞、肥大細(xì)胞與中性粒細(xì)胞浸潤情況得到改善，但還是和陽性藥組存在差距（圖1-F）。

2.3 濕熱中阻方對脾胃濕熱小鼠胃組織中ERK、AKT mRNA 表達(dá)的影響由于陽性藥僅是作為本文中濕熱中阻方對脾胃濕熱癥狀小鼠影響的對比，所以涉及藥物對于疾病干預(yù)的生物學(xué)機(jī)制探討，本文僅列出模型組與濕熱中阻方的實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3 所示，與空白組比較，造模后ERK mRNA、AKT mRNA表達(dá)升高1.8 倍和1.69 倍；與模型組比較，濕熱中阻方各劑量組ERK 和AKT 的基因表達(dá)水平降低，并且與給藥濃度有關(guān)系，其中低劑量組與模型組數(shù)據(jù)無明顯差異。說明濕熱中阻方是通過ERK/AKT 通路改善小鼠的脾胃濕熱癥狀，且由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，同模型組比較，給藥后ERK mRNA 的表達(dá)顯著性要高于AKT mRNA 的表達(dá)。

圖2 小鼠胃組織中ERK、AKT mRNA 相對表達(dá)量

2.4 濕熱中阻方對脾胃濕熱小鼠胃組織中p-ERK、p-AKT 表達(dá)的影響為了進(jìn)一步炎癥ERK/AKT 通路是否參與濕熱中阻方對脾胃濕熱小鼠的影響，通過WB實(shí)驗(yàn)法檢測小鼠胃組織中p-ERK、P-AKT 的蛋白表達(dá)，詳見圖3。根據(jù)圖4 的數(shù)據(jù)可知，蛋白水平檢測實(shí)驗(yàn)結(jié)果與基因水平相一致，患有脾胃濕熱的小鼠在給予溫?zé)嶂凶璺胶?，ERK 和AKT 蛋白磷酸化水平表達(dá)得到抑制，并且高劑量組的顯著性要高于中、低劑量組（P＜0.05）。經(jīng)過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證后，本文中涉及蛋白質(zhì)只通過磷酸化表達(dá)水平反應(yīng)藥物干預(yù)對通路的影響，且不涉及多通路間的交互作用，故此本文中不展示總蛋白表達(dá)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，僅列出蛋白的磷酸化水平表達(dá)。以上表明，ERK/AKT 通路與改善脾胃病小鼠癥狀相關(guān)，并且根據(jù)已知文獻(xiàn)報(bào)道，這可能與抑制腫瘤形成有關(guān)[10]。

圖3 小鼠胃組織ERK 和p-AKT 的相對表達(dá)

圖4 小鼠胃組織p-ERK 和p-AKT 的相對表達(dá)量

3 討論

為探究濕熱中阻方對脾胃濕熱小鼠的影響，本實(shí)驗(yàn)分別從胃腸激素水平、基因水平、蛋白水平、病理學(xué)角度開展研究。脾胃濕熱證由飲食內(nèi)傷、濕熱之邪引起，已有文章報(bào)道，脾胃濕熱證多表現(xiàn)為胃炎急性發(fā)作階段，這會損傷胃黏膜屏障，導(dǎo)致胃黏膜發(fā)生糜爛，這與本文HE 染色實(shí)驗(yàn)中有脾胃濕熱癥狀的小鼠胃組織黏膜層病理學(xué)結(jié)果相一致，而當(dāng)濕熱中阻方作用后，不僅改善了小鼠的胃黏膜損傷時(shí)炎癥反應(yīng)癥狀，并且根據(jù)胃腸激素水平實(shí)驗(yàn)結(jié)果，相較于模型組，給藥后GAS、MLT 的回調(diào)，說明了濕熱中阻方可以改善脾胃濕熱小鼠的腸激素水平，從而減輕患鼠病癥。為了進(jìn)一步探究胃組織的黏膜層、固有層損傷癥狀減輕、炎性細(xì)胞浸潤減少是否與ERK/AKT 通路有關(guān)，本實(shí)驗(yàn)從基因水平、蛋白水平雙重進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，較模型組比，濕熱中阻方治療后，ERK、AKTmRNA 的表達(dá)得到抑制，說明濕熱中阻方改善脾胃濕熱小鼠癥狀與ERK/AKT 有關(guān)，但是基因水平僅是代表DNA 中的某一編碼蛋白質(zhì)的片段[11]，為了探討分子機(jī)制，還應(yīng)該從胞內(nèi)蛋白質(zhì)水平加以實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明一致。ERK 為脯氨酸導(dǎo)向的絲氨酸/蘇氨酸激酶，從細(xì)胞受到刺激至細(xì)胞出現(xiàn)相應(yīng)的生物學(xué)效應(yīng)，這可能是通過MAPK 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路多級激酶的級聯(lián)反應(yīng)[12-13]，與改善小鼠體內(nèi)氧化應(yīng)激環(huán)境有關(guān)[14]，更多的關(guān)聯(lián)性已經(jīng)有文獻(xiàn)報(bào)道，抑制活性氧會刺激PI3K/AKT/NF-κB活化，從而可以抑制炎癥[15-16]。這與從基因水平檢測得到的小鼠胃組織AKT mRNA 在治療后被顯著性抑制的實(shí)驗(yàn)結(jié)果是一致的，說明濕熱中阻方改善脾胃濕熱小鼠的癥狀能與炎癥反應(yīng)有關(guān)，AKT 的表達(dá)與細(xì)胞存活和凋亡有關(guān)[17]，AKT 是經(jīng)典炎癥通路中NF-κB 因子的上游因子[18]，AKT 磷酸化可以使IKBα 磷酸化、泛素化，從而導(dǎo)致NF-κB 活化并轉(zhuǎn)移到核中，進(jìn)行目的基因的轉(zhuǎn)錄，從而影響炎癥反應(yīng)，預(yù)防腫瘤類疾病的形成[19]。

綜上所述，濕熱中阻方改善脾胃濕熱小鼠胃黏膜損傷以及炎癥反應(yīng)癥狀與ERK/AKT 通路有關(guān)，是通過從磷酸化水平抑制ERK、AKT 的相對表達(dá)從而不同程度的減少脾胃濕熱引起的胃組織損傷，提高胃腸的正常生理能力，達(dá)到有效拮抗?jié)駸崴l(fā)的胃腸疾病的效果。