宰后成熟過程中羊肉食用品質(zhì)及蛋白穩(wěn)定性的變化研究

魏燕超，劉滿順，劉永峰

(陜西師范大學 食品工程與營養(yǎng)科學學院，陜西 西安，710062)

近年來，陜北橫山羊肉產(chǎn)業(yè)迅速發(fā)展，橫山羊肉因其有營養(yǎng)豐富、蛋白質(zhì)含量高、脂肪含量適中、膽固醇含量低、肌纖維細嫩、柔軟、味美多汁、無膻味、香味濃郁等特點被譽為“肉中之人參”，深受廣大消費者青睞[1]。食用品質(zhì)是決定肉類商品價值的最重要因素，而食用品質(zhì)中嫩度、持水性等指標對肉的品質(zhì)影響較大[2]。剪切力是衡量肌肉嫩度的一個重要指標，羊肉肩部肌肉、背最長肌、臀部肌肉等不同部位肉塊的剪切力值之間有極顯著差異[3]。肉的持水性是肉品保持自身水分的能力，也是評價肉品質(zhì)的重要指標，常用汁液流失率(drip loss)和蒸煮損失率(cooking loss)2個指標進行評價。正常情況下，宰后肌肉汁液流失是不可避免的，然而大量汁液流失不但降低肉的營養(yǎng)價值，而且使肉品重量減少，肉色和嫩度劣變[4]。巴吐爾等研究發(fā)現(xiàn)，羊肉的嫩度、持水性在不同分割部位間、不同成熟期間差異顯著[2]。除此之外，羊宰后胴體分割部位和肌肉中蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能特性對肉與肉制品的品質(zhì)影響也較顯著，宰后羊肉在成熟期間，發(fā)生的一系列生化變化，使肌肉蛋白結(jié)構(gòu)和組成發(fā)生變化，從而對肉品質(zhì)產(chǎn)生影響[5]。LI等[6-7]研究結(jié)果說明肌原纖維蛋白結(jié)構(gòu)的破壞和肌肉蛋白質(zhì)的水解能提高肉的嫩度，且隨著宰后成熟時間的延長以及胴體pH變化，肌肉蛋白逐漸降解；而蛋白溶解度也能反映肌肉蛋白降解情況[8]。

鑒于不同部位羊肉在嫩度、持水性、蛋白結(jié)構(gòu)等方面具有顯著差異，且具有地方特色的橫山羊肉品質(zhì)鮮有研究。因此，本研究以剪切力、汁液流失率、蒸煮損失、肌漿蛋白和肌原纖維蛋白溶解性變化和肌原纖維蛋白的降解情況來探討宰后橫山羊肉品質(zhì)的變化，以期為橫山羊肉的宰后適時選擇提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗原料與試劑

1.1.1 試驗原料

本試驗所用羊肉采自榆林洋洸農(nóng)牧業(yè)有限公司。屠宰選取體重相近、飼養(yǎng)方式相同的10月齡的陜北白絨山羊10只(公羊，未去勢，體重(23.12±1.62) kg)。分別在宰后4、8、12、24、48 h取10只山羊的背最長肌(HQ)和腹部肌肉(LQ)作為樣品，并置于50 mL離心管中，于干冰中運回實驗室后，儲存于-80 ℃冰箱中。

1.1.2 主要儀器

Multiskan Go全波長酶標儀,美國熱電公司；TA.XT.Plus質(zhì)構(gòu)儀,英國Stable Micro System公司；TS-1脫色搖床,海門市其林貝爾儀器制造有限公司；Mini-PROTEAN Tetra System蛋白電泳儀,美國Bio-Rad公司； JA2003N電子天平,上海精密儀器有限公司；BIO-BEST200E凝膠成像儀,美國西盟；TGL-16gR高速冷凍離心機,上海安亭科學儀器廠；DW-HL398S超低溫冰箱,中科美菱低溫科技股份有限公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋,金壇市岸頭儀都儀器廠。

1.1.3 主要試劑

BCA試劑盒、上樣緩沖溶液,北京康為試劑公司；蛋白Marker,北京康潤生物技術(shù)有限公司；乙醇、乙酸、KH2PO4，天津科密歐化學試劑有限公司；二硫蘇糖醇(DTT)、三羥甲基氨基甲烷(Tris Base)、十二烷基硫酸鈉(SDS)、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、過硫酸銨(APS)、四甲基乙二胺(TEMED)，美國Sigma公司；SYPRO Ruby染色液，美國Invitrogen 公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 羊肉剪切力的測定

參照農(nóng)業(yè)行業(yè)標準NY/T1180—2006測定[9]。從冰箱中取出羊肉樣品，剔除筋膜，并沿肌纖維方向修整成均勻的肉塊(6 cm×6 cm×3 cm)，放入80 ℃恒溫水浴鍋中加熱至肉樣中心溫度達到70 ℃時，將肉樣取出冷卻至室溫，切成較為規(guī)則的小塊(1 cm×1 cm×3 cm)，用質(zhì)構(gòu)儀垂直于肌肉纖維方向剪切測定其剪切力。探頭距離為25 mm，速度為60 mm/min。每個樣品測定5次。

1.2.2 汁液流失率和蒸煮損失的測定

參照夏安琪等[10]方法測定汁液流失率。肉樣稱重并記質(zhì)量為W1，用S型鉤鉤住肉樣的一端，將肉置于一個已吹氣膨脹的保鮮袋中，確保羊肉不與袋子接觸，用細線將口扎緊，放在4 ℃恒溫箱靜置24 h后，取出肉樣，再次稱重并記質(zhì)量為W2。肉的汁液流失率計算公式：

(1)

蒸煮損失測定方法參照HONIKEL等[11]的方法。肉樣稱重并記質(zhì)量為W1，放入蒸煮袋中封口包裝，于80 ℃水浴45 min后，冷卻至室溫并置于4 ℃過夜。將肉塊取出，用濾紙輕輕吸干表面汁液，再次稱重記質(zhì)量為W2。羊肉蒸煮損失計算方法如下：

(2)

1.2.3 蛋白質(zhì)溶解度的測定

參照BOWKER等[12]的方法測定。肌漿蛋白溶解度測定：取約1 g樣品置于10 mL預冷的磷酸緩沖液中(0.25 mol/L，pH 7.2)，冰上勻漿，然后置于搖床上4 ℃過夜。次日2 500 r/min離心20 min后，取上清，用BCA(bicinchoninic acid)法測定蛋白濃度，得到肌漿蛋白溶解度。全蛋白溶解度測定：取約1 g肉樣，置于10 mL預冷的含1.1 mol/L KI的磷酸緩沖液中(0.1 mol/L，pH 7.2)，冰上勻漿，然后置于搖床上4 ℃放置過夜，之后2 500 r/min離心20 min，取上清用BCA法測定蛋白濃度，即為全蛋白溶解度。肌原纖維蛋白溶解度測定：為全蛋白溶解度和肌漿蛋白溶解度的差值。

1.2.4 蛋白質(zhì)的SDS-PAGE電泳

蛋白提?。簠⒄誋UANG等[13]的方法，稱取約1 g肉樣置于離心管中，加入6 mL預冷的緩沖溶液(0.1 mol/L Tris pH 8.3、0.01 mol/L DTT)，均質(zhì)后于4 ℃條件下10 000 r/min離心20 min，收集上清液用作肌漿蛋白分析，剩余沉淀主要是肌原纖維蛋白；在沉淀中加入25 mL 5% SDS緩沖溶液，渦旋混勻后，使沉淀溶解后，于80 ℃水浴30 min，分裝后置于-80 ℃保存，用于后續(xù)分析。采用BCA法測定蛋白濃度，用全波長酶標儀檢測吸光度。

SDS-PAGE電泳：SDS-PAGE電泳用12%分離膠和4%的濃縮膠。提取得到的肌原纖維蛋白樣品與一定量的上樣緩沖液混合后，沸水水浴3 min，之后冷卻至室溫，于3 000 r/min離心2 min，取上清，上樣。上樣量為8 μg。電泳初始電壓為70 V，待溴酚藍進入分離膠后，將電壓上調(diào)到120 V，待溴酚藍泳動至離凝膠底部約0.5 cm處停止電泳即可。

SYPRO Ruby染色：將膠浸入到約100 mL固定溶液(含40%甲醇和10%乙酸)中，置于脫色搖床上固定2 h后，棄去浸泡凝膠的固定液，并以100 mL雙蒸水洗膠2～3次，每次10 min；洗膠結(jié)束后加入適量SYPRO Ruby染色沒過凝膠，避光染色過夜。染色完成后，棄去上述染色液，加入已配好的100 mL脫色液(含10%乙醇和7%乙酸)浸沒凝膠，置于脫色搖床上避光脫色30 min。

凝膠成像：脫色完后，用BIO-BEST200E凝膠成像儀采集圖像。光源波長設(shè)置為254 nm。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析采用SPSS 17.0軟件，多重比較方法采用Duncan法，結(jié)果以“平均值±標準差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 剪切力變化的結(jié)果分析

宰后48 h的HQ、LQ組橫山羊肉剪切力的變化結(jié)果見圖1。

圖1 宰后48 h HQ、LQ組橫山羊肉剪切力的變化Fig.1 Changes of shearing force of Hengshan mutton with HQ and LQ group after slaughter 48 h注：所有柱子上不同小寫字母表示任意2組間差異顯著(p<0.05)，不同大寫字母表示差異極顯著(p<0.01)。

宰后早期(4～8 h)2組羊肉的剪切力均極顯著增加(p<0.01)，在宰后12 h時羊肉剪切力較早期極顯著減小(p<0.01)，并且在12 h之后羊肉剪切力持續(xù)減?。辉缀?8 h時，HQ、LQ組剪切力分別減小至最高剪切力時的52%和60%。同一時間段，HQ組羊肉的剪切力極顯著小于LQ組(p<0.01)。說明了隨著宰后時間的延長，宰后早期2組肉嫩度較差，從宰后12 h開始，肉質(zhì)又逐漸變嫩且最終嫩度優(yōu)于宰后早期；在同一時間段，HQ組的肉質(zhì)均嫩于LQ組，且剪切力隨時間變化程度較大。

2.2 持水性變化的結(jié)果分析

宰后48 h的HQ、LQ組橫山羊肉持水性的變化結(jié)果見表1。隨著宰后時間的延長，羊肉的汁液流失率和蒸煮損失率均顯著增加(p<0.05)，而且2組的汁液流失率和蒸煮損失率變化程度基本一致；在同一時間段，除了宰后24 h的汁液流失率外，HQ組羊肉的汁液流失率和蒸煮損失均顯著小于LQ組(p<0.05)。汁液流失率和蒸煮損失率與肉的持水性緊密相關(guān)，說明了隨著宰后時間延長HQ組的持水性較好。

表1 宰后48 h HQ、LQ組質(zhì)橫山羊肉持水性的變化Table 1 Changes of swater-holding capacity of Hengshan mutton with HQ and LQ group after slaughter 48 h

注：同一指標中不同小寫字母表示任意2組間差異顯著(p<0.05)，不同大寫字母表示差異極顯著(p<0.01)。

2.3 蛋白溶解度變化的結(jié)果分析

2.3.1 肌漿蛋白溶解度

宰后48 h的HQ、LQ組橫山羊肉肌漿蛋白溶解度的變化結(jié)果見圖2。2組羊肉肌漿蛋白溶解度均隨著宰后時間延長逐漸增大(p<0.01)，且兩組的增加速率較一致；同一時間段，HQ組羊肉的肌漿蛋白溶解度始終極顯著高于LQ組羊肉(p<0.01)。蛋白的溶解度反映了蛋白的降解程度，結(jié)果說明HQ組羊肉的肌漿蛋白降解程度較大。

2.3.2 肌原纖維蛋白溶解度

圖2 宰后48 h HQ、LQ組橫山羊肉肌漿蛋白溶解度的變化Fig.2 Changes of sarcoplasmic protein solubility of Hengshan mutton with HQ and LQ group quality after slaughter 48 h注：2條折線上不同小寫字母表示任意2組間差異顯著(p<0.05)，不同大寫字母表示差異極顯著(p<0.01)。

宰后48 h的HQ、LQ組橫山羊肉肌原纖維蛋白溶解度的變化結(jié)果見圖3。在宰后12 h內(nèi)兩組肉樣肌原纖維蛋白溶解度均顯著下降(p<0.05), 12 h后，溶解度逐漸增加，但在48 h時兩組肌原纖維蛋白的溶解度均顯著小于最初的溶解度(p<0.05)。說明了2組肉樣的肌原纖維蛋白在宰后前12 h無降解或降解程度較小，在12 h之后降解程度持續(xù)增加，肉質(zhì)嫩度增加，所以宰后12 h是肉質(zhì)變化的關(guān)鍵點。此外，2組肉樣的肌原纖維蛋白溶解度差異顯著(p<0.05)，宰后4、8和12 h內(nèi)，LQ組羊肉的蛋白溶解度顯著大于HQ組(p<0.05)，而在宰后24 h和48 h時LQ組羊肉的蛋白溶解度顯著小于HQ組(p<0.05)。說明在宰后肉質(zhì)成熟過程中，24 h之前LQ組肌原纖維蛋白溶解較大，在24 h左右被HQ組反超。

圖3 宰后48 h HQ、LQ組橫山羊肉肌原纖維蛋白溶解的變化Fig.3 Changes of myofibrillar protein solubility of Hengshan mutton with HQ and LQ group after slaughter 48 h注：2條折線上不同小寫字母表示任意兩組間差異顯著(p<0.05)，不同大寫字母表示差異極顯著(p<0.01)。

2.4 肌原纖維蛋白降解的結(jié)果分析

為了更詳細分析肌原纖維蛋白降解的復雜情況，我們又采用了SDS-PAGE電泳分析法，宰后48 h的HQ、LQ組橫山羊肉肌原纖維蛋白降解的變化結(jié)果見圖4。

a-HQ組羊肉；b-LQ組羊肉圖4 宰后48 h HQ、LQ組橫山羊肉肌原纖維蛋白SDS-PAGE圖譜Fig.4 Changes of DS-PAGE spectrum of myofibrillar protein of Hengshan mutton with HQ and LQ group after slaughter 48 h

肌肉中主要的肌原纖維蛋白從上到下依次是肌球蛋白重鏈(220 kDa)、α-輔肌動蛋白(100 kDa)、肌動蛋白(43 kDa)及的肌球蛋白輕鏈1(23 kDa)。由圖4-a可知HQ組羊肉肌原纖維蛋白在成熟4～12 h新條帶產(chǎn)生增多，尤其表現(xiàn)在40～30 kDa的肽段，24～48 h新產(chǎn)生條帶又逐漸消失且恢復原狀，與圖3的走勢基本一致。由圖4-b可知，LQ組羊肉肌原纖維蛋白與HQ組的表現(xiàn)時間也基本一致；與圖4-a相比，LQ組12 h前條帶更彌散一些，而24 h和48 h彌散程度又弱于HQ組。因此，本電泳圖基本與肌原纖維蛋白降解圖的現(xiàn)象保持一致。

3 討論

羊肉的嫩度不僅反映肉的質(zhì)地，而且是消費者最重視的肉品質(zhì)之一，也是評判肉質(zhì)優(yōu)劣的最常用指標，對肉的商業(yè)價值影響較大[14]。本研究發(fā)現(xiàn)2組肉樣在宰后過程中剪切力先增大后減小的趨勢與劉漢麗的研究結(jié)果相似[15]。該變化趨勢可能由于宰后胴體進入了僵直期，且胴體進行無氧反應產(chǎn)生ATP含量不足以使得肌動蛋白與肌球蛋白結(jié)合后再分開，進而導致肌原纖維收縮，剪切力逐漸變大[16]；但宰后12 h開始，胴體開始解僵，剪切力又逐漸減小，肉質(zhì)又逐漸變嫩，且最終嫩度優(yōu)于宰后早期。研究還發(fā)現(xiàn)，在同一時間段，背最長肌肉的剪切力始終小于腹部肌肉，且兩者之間的差值不穩(wěn)定，這可能是由于不同部位肉樣的肌原纖維、結(jié)締組織、肌肉脂肪含量與分布，以及各種蛋白結(jié)構(gòu)特性等存在差異所致[17]。

以汁液流失率和蒸煮損失率計算的肉持水性，也是肉食用品質(zhì)優(yōu)劣的重要體現(xiàn)[18]。本研究發(fā)現(xiàn)汁液流失率和蒸煮損失率隨時間延長顯著增加，其中蒸煮損失的增加一定范圍內(nèi)會增強肉的嫩度，但汁液流失會伴隨水、可溶性蛋白質(zhì)、無機鹽類、維生素等物質(zhì)流失，從而導致嫩度、風味、營養(yǎng)價值等品質(zhì)的下降，且汁液流失率對肉品質(zhì)的影響較蒸煮損失率更大；該結(jié)果可能是由于宰后肌原纖維蛋白和細胞膜鏈接在一起的蛋白的降解，為肌肉汁液的流失提供了通道[19-20]；還可能因為肌肉成熟過程中產(chǎn)生的乳酸使pH值下降至主要蛋白質(zhì)的等電點時，蛋白質(zhì)的正負電荷相等，蛋白質(zhì)開始相互吸引，肌原纖維之間間隔的減小使得對水分的吸引和滯留空間減小[21]。

肌漿蛋白溶解度變化受宰后短時間內(nèi)肉樣的溫度和pH值改變而影響。本研究發(fā)現(xiàn)，羊肉肌漿蛋白溶解度隨著時間延長而逐漸增大，可能是因為宰后短時間內(nèi)肉樣的溫度和pH值改變，使得肌漿蛋白重鏈發(fā)生部分伸展和重新折疊，部分表面疏水基團暴露和伸展，導致其表面界面活力增加，乳化能力提高，溶解度增加[22]。此外，同一時間段，背最長肌肉的肌漿蛋白溶解度始終顯著高于腹部肌肉，可能是不同部位羊肉的pH值、溫度等下降速率不同導致溶解度存在差異，與肉的持水力也顯著相關(guān)[23]。

肉成熟期間，肌原纖維蛋白降解及其降解形成的多肽與肉的嫩度、持水性等食品品質(zhì)密切相關(guān)[24-26]。本研究發(fā)現(xiàn)，羊肉的肌原纖維蛋白溶解度在前12 h逐漸下降，12 h之后持續(xù)增加，這與魏秀麗等人的研究結(jié)果相一致[8]，該結(jié)果原因可能是促使肌原纖維蛋白聚合和降解的鈣蛋白酶(μ-calpain)在僵直期活性較低，而解僵后μ-calpain被肌漿網(wǎng)中釋放的Ca2+活化，其活性迅速增加，而影響肌原纖維蛋白溶解度；也可能是肌原纖維蛋白中的肌動蛋白、肌球蛋白結(jié)合形成的肌動球蛋白易被解離生成小分子蛋白，增強與水分子相互作用而增加了溶解度[27]。本研究發(fā)現(xiàn)的宰后24 h之前背最長肌肉的溶解和降解更為嚴重，而在24 h之后腹部肌肉的溶解和降解更為嚴重，這可能是2組肉樣pH值、溫度等下降速率不同所致。SDS-PAGE電泳圖檢測結(jié)果進一步驗證了肌原纖維蛋白溶解結(jié)果，在降解過程在產(chǎn)生的多肽條帶可能是細胞凋亡酶Capases家族降解的肌肉細胞骨架蛋白[28-29]；多肽條帶也可能是胞漿Ca2+誘導Caspases家族級聯(lián)反應而使Caspase-3活化，促使肌鈣蛋白T降解并出現(xiàn)30 kDa特征性降解產(chǎn)物[30-31]；多肽條帶還可能是Caspase-6能降解肌間線蛋白(Desmin)生成的降解產(chǎn)物(33 kDa和50 kDa)[32]。

4 結(jié)論

宰后2 d內(nèi)，橫山羊肉的剪切力明顯減少，嫩度優(yōu)化；羊肉通過汁液流失率、蒸煮損失率指標反映出持水性逐漸減弱；其蛋白溶解性也反映了蛋白質(zhì)穩(wěn)定性逐漸減弱。經(jīng)比較背最長肌、腹部肌肉的橫山羊肉食用品質(zhì)和蛋白質(zhì)穩(wěn)定性，背最長肌較腹部肌肉的嫩度和持水性較優(yōu)、蛋白穩(wěn)定性較差。