醬油關鍵風味物質及其功能與發(fā)酵工藝研究進展

朱莉，許長華

(上海海洋大學 食品學院，上海水產品加工及貯藏工程技術研究中心，農業(yè)部水產品貯藏保鮮質量安全風險評估實驗室(上海)，國家淡水水產品加工技術研發(fā)分中心(上海)，上海，201306)

隨著餐飲業(yè)的發(fā)展，醬油的人均消費量逐漸提升，高品質的醬油市場需求逐漸增大[1]，這就加快了醬油的升級速度，并加快了對醬油更進一步的科學研究速度。

醬油俗稱豉油，主要由大豆、小麥、食鹽經制曲、發(fā)酵等程序釀制而成。醬油的成分比較復雜，除食鹽外，還有多種氨基酸、有機酸、糖類、香料及色素等成分[2]，不同的成分具有其獨特的功能。

對醬油研究較為深入的國家是韓國、日本等亞洲發(fā)達國家[3]。同時，中國各大品牌的醬油研發(fā)人員也在不斷改善和優(yōu)化醬油風味，本文綜述了醬油發(fā)酵工藝，并且對醬油關鍵風味物質研究進展以及醬油的功能進行了綜述，以期為后期醬油的相關研究提供參考。

1 醬油發(fā)酵工藝

1.1 高鹽稀態(tài)發(fā)酵

高鹽稀態(tài)發(fā)酵指從日本引進的釀造工藝，具有水分含量多、鹽分高、溫度適中、發(fā)酵周期長等特點?，F(xiàn)采用高鹽稀態(tài)發(fā)酵工藝的企業(yè)有和田寬、石家莊珍極、紹興至味、日本龜甲萬等。高鹽稀態(tài)發(fā)酵工藝的關鍵點在于發(fā)酵狀態(tài)，即高鹽度稀醪狀態(tài)，高鹽指鹽水19～20 °P，鹽度高于低鹽固態(tài)發(fā)酵，稀醪指加入鹽水的體積是原料體積的1.1～1.2倍，即醬醪較稀。高鹽稀態(tài)發(fā)酵由于鹽分含量高，即使發(fā)酵溫度降低，多種耐鹽微生物生存發(fā)酵也會產生較多的風味物質。此發(fā)酵工藝發(fā)酵周期長，通常180 d以上，有利于發(fā)酵更徹底，風味物質更豐富。同時高鹽稀態(tài)發(fā)酵經常添加乳酸菌、耐鹽酵母菌等能產生有機酸、醇、酯等改善醬油風味物質的菌株，這些菌株促成了高鹽稀態(tài)發(fā)酵醬油300多種香氣物質的生成[4]。高鹽稀態(tài)發(fā)酵醬油方法又分為浸出法和壓濾法，兩法成熟醬醪提取醬油的方法不同，浸出法發(fā)酵容器型式不限，發(fā)酵池、發(fā)酵缸均可，但使用材質應能防止腐蝕；壓濾法生產設備的投資很大，且發(fā)酵期長(一般 5～6 個月)，所以目前采用這種技術發(fā)酵的企業(yè)不多[5-6]。

1.2 低鹽固態(tài)發(fā)酵

低鹽固態(tài)發(fā)酵是我國20世紀70年代普遍推行的一種工藝，國內很多企業(yè)一直延用至今。此工藝通常以脫脂大豆及麩皮為原料，經蒸煮、冷卻，米曲霉制曲后與鹽水混合成固態(tài)醬醅，42 ℃保溫發(fā)酵。該工藝是在無鹽發(fā)酵基礎上改進而成，由于其拌曲鹽水濃度在12 °P左右，較低，故稱為低鹽。而其加水量與原料比例為 1∶1，為固態(tài)醬醅，發(fā)酵溫度在42 ℃以上，故稱為低鹽固態(tài)發(fā)酵。因為發(fā)酵鹽分低、水量少，反應物濃度變大，菌種繁殖代謝加快，發(fā)酵速度快，故成熟期縮短[7]。

低鹽固態(tài)發(fā)酵由于工藝簡單，相比于高鹽稀態(tài)發(fā)酵工藝其原料成本較低，需要的投資少，所以20世紀70年代后在全國很快推廣開來。但該工藝又存在產品口味單一、色澤暗淡、焦煳味重等缺陷，目前已經開發(fā)了一些其他改進工藝來降低發(fā)酵溫度，延長發(fā)酵周期，最普遍的是淋澆發(fā)酵工藝。

1.3 淋澆發(fā)酵

目前，很多醬油發(fā)酵工廠還采用醬缸發(fā)酵，但是醬缸中的溫度、氧濃度、酸堿度都不能很好的控制。于是南方就產生了一種普遍流行的大罐淋澆工藝，即在發(fā)酵前期或后期進行淋澆，這樣不僅能夠對溫度進行調節(jié)，還能夠使微生物得到氧氣，并且后期出油時，直接從淋澆的設備中抽出醬油即可，并且還可以避免壓榨設備對醬油發(fā)酵的影響。目前很多以低鹽固態(tài)工藝發(fā)酵生產醬油的企業(yè)在發(fā)酵初期就開始進行淋澆，即不降低溫度也不改變鹽度、pH、糖度等進行發(fā)酵，這種工藝對醬醅里的成分、溫度的均勻度都有好處，之后淋油也會暢通，且淋澆出來的醬油色澤光亮，沒有焦煳味，相比低鹽固態(tài)發(fā)酵醬油其風味可以大大改善[8-10]。

但是淋澆發(fā)酵工藝較易染菌，需要較高標準的衛(wèi)生環(huán)境，同時要有實時控制好發(fā)酵溫度、pH、糖度等參數的設備。

1.4 傳統(tǒng)發(fā)酵

傳統(tǒng)醬缸發(fā)酵也被稱為純天然發(fā)酵，主要原料是小麥、黃豆、黑豆或脫脂大豆，也有原料全部為面粉的傳統(tǒng)發(fā)酵，比如甜油[11]。發(fā)酵方式有液態(tài)和固態(tài)兩種。液態(tài)發(fā)酵需加入2倍多的鹽水，醬油以稀醪狀呈現(xiàn)，而固態(tài)發(fā)酵即只加入比原料多1倍的鹽水，以半固態(tài)狀呈現(xiàn)[12]，大缸露天發(fā)酵具有一般傳統(tǒng)發(fā)酵的共同特征。發(fā)酵過程中，晴天將醬缸蓋打開，日曬夜露，一般一個夏季的時間讓其充分發(fā)酵，秋季末榨出油。傳統(tǒng)醬缸發(fā)酵在曬醬時的溫度很高，酵母等其他低溫生長菌株難以生長，但其他菌種特別是耐高溫菌種的生長繁殖加快，這些菌種的代謝會產生大量的香味物質，這些香味物質往往促成了傳統(tǒng)發(fā)酵醬油獨特且不可替代的風味[13]。

表1 比較了不同發(fā)酵工藝的特點，可以發(fā)現(xiàn)不同醬油發(fā)酵工藝有自己的優(yōu)勢和不足，不同企業(yè)根據其不同需求選擇相應工藝。

表1 醬油工藝對比表Table 1 The correlation table of soy sauce process

2 醬油中關鍵風味物質研究進展

近些年來，醬油作為一種有著悠久歷史的調味品，其獨特的風味也是科學家們研究的重點。CHOI[16]等人基于42個大麥麩皮釀造的醬汁樣品，通過多元回歸分析(NfRA)法研究了醬油的氣相色譜(GC)圖譜與醬油感官分析中各香氣成分排列順序之間的關系，發(fā)現(xiàn)9，12-十八烷酸甲酯的含量最高，其次是2-呋喃甲醇和2-呋喃甲醛。YOSHIKAWA[17]等認為2-苯基乙醇(2-PE)和4-羥基-2(5)-乙基-5(2)-甲基-3(2H)呋喃酮(HEMF)和醬油發(fā)酵中產生4-乙基愈創(chuàng)木酚(4-EG)是醬油中的特征性風味化合物。ZHENG[18]等人比較了不同發(fā)酵過程(低溫固態(tài)發(fā)酵(LSSF)，高鹽稀釋態(tài)發(fā)酵(HSDF)和高鹽恒溫發(fā)酵(HSCT))培養(yǎng)的中國醬油中的揮發(fā)性香氣化合物，發(fā)現(xiàn)LSSF醪液中揮發(fā)性香氣化合物總濃度是最高的，LSSF醪液中還存在高含量的2，3-丁二醇和2，6-二甲基吡嗪；但亞油酸乙酯和油酸乙酯主要在HSCT醪液中，LSSF醪液中很少。LEE，SM[19]等人通過溶劑萃取和固相微萃取的分析方法，分別分離了發(fā)酵醬油和酸水解醬油中的揮發(fā)性化合物，總結發(fā)現(xiàn)發(fā)酵醬油的主要氣味活性化合物是乙酸，糠醇，2-甲氧基苯酚，苯乙醇，苯甲酸，丁酸，2-乙基-4-羥基-5-甲基-3(2H)呋喃酮和2-2-甲基丁醛，而酸水解醬油的主要氣味活性化合物是乙酸，2-甲氧基苯酚，甲酸，苯甲酸，2，5-二甲基吡嗪，2，6-二甲基吡嗪，丁酸，2，6-二甲氧基苯酚，3-羥基-2-甲基-4H-吡喃-4 - 酮，2-乙?；?5-甲基呋喃，2，5-二甲基-3-乙基吡嗪和2-甲基丁醛。SONG[20]等人通過GC-MS分析了醬油發(fā)酵過程中62種揮發(fā)性化合物的變化，發(fā)酵初期，醇、酮和吡嗪是主要的風味貢獻者，而隨著發(fā)酵的進行，酸與醛的豐度逐漸增加。KANEKO[21]等人通過芳香提取物稀釋分析技術(AEDA)，以日本醬油的香味濃縮物為研究對象，研究結果揭示了日本醬油中40種關鍵芳香化合物，其中包括7種新鑒定的化合物，其中，5(或2)-乙基-4-羥基-2(或5 -甲基-3(2H)-呋喃酮和3-羥基-4，5-二甲基-2 - 呋喃酮對醬油香氣貢獻度最高，(FD)因子為2048，3-(甲硫基)丙醛；4-乙基-2-甲氧基苯酚和4-羥基-2，5-二甲基-3(2H) - 呋喃酮貢獻度次之。KURODA[22]等人通過HPLC-MS和串聯(lián)質譜(LC / MS / MS)等方法，以6種商業(yè)品牌的深色醬油，2種品牌的淺色醬油和一種品牌的白色醬油為研究對象，研究了各醬油γ-Glu-Val-Gly的含量，結果表明所有研究的大豆醬中都存在γ-Glu-Val-Gly，且質量濃度范圍為0.15～0.61 mg/dL。

不同原料以及不同發(fā)酵工藝所生產出來的醬油，其風味物質的種類和數量不盡相同，并且采用不同的提取方法和分析儀器分析風味物質時，最終鑒定出的風味物質數量和種類也有較大差別，但無論在何種工藝發(fā)酵的醬油中，也無論采用何種分析方法，對醬油風味起著關鍵作用且貢獻較大的特征性香氣成分卻大致相同，如4-乙基愈創(chuàng)木酚、4-羥基-2(或5)-乙基-5(或2)-甲基-3(2H)-呋喃酮(HEMF)等[23]。

3 醬油的功能特性

3.1 殺菌作用與多種營養(yǎng)物質

實驗發(fā)現(xiàn)p3羥基苯甲酸在醬油中有殺死病原菌的作用[12]。目前能解釋醬油殺菌機理的相關報道表明：NaCl、酒精、防腐劑的存在有助于殺菌，特定的溫度、pH值加強了殺菌的作用。對食物中易引起食物中毒的微生物有一定的殺菌效果。除此之外，醬油可能還存在其他具有抗菌作用的成分，有待進一步鑒定[24]。醬油不僅僅含有豐富的蛋白質，多種人體所必須的氨基酸，糖分和VB12、VB1、VB2、VE，鋅、鈣、鐵、錳等微量元素也可以在醬油中找到[25]。

3.2 抗氧化作用

WANG[26]等發(fā)現(xiàn)，醬油中甲氨基酚、類黑精素等在體外抗氧化活性很高；KATAOKA等[35]實驗表明，HEMF, HDMF和HMF，Leu-Leu-Pro-His-His多肽對醬油抗氧化活性具有一定貢獻。醬油發(fā)酵中的美拉德反應是一類很重要的反應，而美拉德反應經常產生類黑精等一系列含N、S的棕褐色揮發(fā)性雜環(huán)化合物，這些物質的等電點一般在 pH 2～3范圍內，呈青色熒光，是酸性的高分子。這些揮發(fā)性雜環(huán)化合物的游離基比較穩(wěn)定，不易被水解酶水解且不易自己降解，所以這種物質能穩(wěn)定存在并能消除活性氧，提高過氧化物酶、過氧化氫酶等活性。這就是醬油具有一定的抗誘變、抗氧化和消除活性氧等功能的機理[27]，這些物質的抗氧化的功效有的甚至比VC和VE高十幾倍[24]。

3.3 抗癌作用

早在1991年，BENJAMIN等在醬油抗癌性動物實驗中，就已經發(fā)現(xiàn)醬油中的呋喃酮類，包括HEMF[(4-羥基-2(5)-乙基-5(2)-甲基-3(2H)呋喃酮] 、(HMF)4-羥基-5-甲基-3(2H)-呋喃酮和(HDMF) 4-羥基-2,5-二甲基-3(2H)-呋喃酮等，都能降低人多形核白細胞中的H2O2濃度，特別是HEMF[(4-羥基-2(5)-乙基-5(2)-甲基-3(2H)呋喃酮]，HEMF已經多次被證實為一種重要的，且具有較強的抗癌作用的風味物質，其抗氧化性強于VC，也有抑制腫瘤的效果[12, 24]。此外，醬油中有檢測到異黃酮類物質，比如黃豆苷和大豆苷，此類異黃酮苷類物質抗氧化活性也很高，并且在臨床中發(fā)現(xiàn)能預防前列腺癌、乳癌等疾病[28-29]，美國癌癥治療中心已經把諸如此類的異黃酮作為治療乳腺癌疾病的藥物[30]。

3.4 促進胃液分泌

KOJIMA等[32-33]將25 mL日式醬油加入300 mL熱水中，制成醬油稀釋液，讓15個人服用，他們的胃液分泌量平均為46.8 mL，對照組將25 mL咖啡因(常用于誘導胃液分泌)加入300 mL熱水，制成咖啡因稀釋液，讓15個人服用，他們的胃液分泌量平均為44.0 mL。因此醬油稀釋液誘導產生的胃液比咖啡因稀釋液還多。此項研究證明了醬油中可能存在某些特殊的生物活性物質,能起到促進胃液分泌的作用[31]。

3.5 其他功能

SASAKI等[38]發(fā)現(xiàn),HEMF, HDMF和HMF除了具有抗癌和抗腫瘤作用外，還具有一定的反癬作用。TSUCHIYA通過高效液相色譜分析醬油，發(fā)現(xiàn)醬油中含有能抗血小板產生的功能物質。表2將醬油的各種功能總結，顯示出醬油還有抗過敏，治療貧血等作用。

4 展望與總結

綜上所述，醬油工藝的發(fā)展速度逐漸加快，工藝種類也越來越多，但具體哪種發(fā)酵方式最受歡迎，風味最好，還受多方面因素影響。研究醬油關鍵風味物質的科學家雖然已經通過多種方法檢測出了多種風味物質成分，但每種成分的具體作用，以及它們之間的相互作用的相關報道太少，其機理有待進一步探索，并且根據各企業(yè)醬油的關鍵風味物質及其相互作用，開發(fā)或改善其發(fā)酵工藝是一件非常有意義的研究工作。

表2 醬油功能研究總結表Table 2 The conclusive table of the function of soy sauce

注：ABTS，2，2′-氮雜雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)； DPPH，1,1-二苯基-2-苦基肼； HDMF，4-羥基-2,5-二甲基-3(2H)-呋喃酮； HEMF，4-羥基-2(或5)- 乙基-5(或2)-甲基-3(2H)-呋喃酮； HMF，4-羥基-5-甲基-3(2H)-呋喃酮

醬油的眾多功能中抗氧化作用和抗癌作用是比較顯著的，值得注意的是HEMF, HDMF和HMF不僅僅在風味上有很大的貢獻，功能上還具備抗氧化作用和抗癌作用，然而其作用機制還有待研究。