白酒中揮發(fā)性苦澀味物質(zhì)的提取和分離

王尹葉，范文來(lái)，徐巖

(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院,釀造微生物與應(yīng)用酶學(xué)研究室，教育部工業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫，214122)

苦味和澀味是白酒中常見(jiàn)的異味[1]，直接影響著白酒的品質(zhì)。我國(guó)各香型白酒都不同程度地存在苦、澀味問(wèn)題。早期有學(xué)者推測(cè)白酒中呈苦味化合物可能是正丙醇、1-丁醇、異丁醇、異戊醇、糠醛、丙烯醛、單寧、硫化物、氨基酸等；呈澀味的化合物主要是乳酸、乳酸乙酯、異丁醇、異戊醇、糠醛和單寧等[2-3]。應(yīng)用現(xiàn)代味覺(jué)研究技術(shù)即味覺(jué)稀釋分析(taste dilution analysis，TDA)[4]研究發(fā)現(xiàn)，乳酸、2-糠酸、2-羥基-3-甲基丁酸、2,3-二羥基丙酸、富馬酸、馬來(lái)酸、3-苯基乳酸、檸檬酸和琥珀酸在白酒中呈澀味[5]。然而，到目前為止，鮮見(jiàn)白酒中揮發(fā)性呈味物質(zhì)的研究報(bào)道。

TDA技術(shù)是國(guó)際上研究食品味覺(jué)的常用方法[4]，即用感官評(píng)價(jià)與儀器分析結(jié)合的方法在食品中分離和鑒定不揮發(fā)的味覺(jué)活性物質(zhì)。如運(yùn)用TDA研究發(fā)現(xiàn)羥基苯甲酸乙酯和羥基肉桂酸乙酯是葡萄酒的重要苦味化合物；羥基苯甲酸、羥基肉桂酸、黃酮-3-醇糖苷和二氫黃酮-3-醇鼠李糖苷被確定為葡萄酒的關(guān)鍵澀味化合物[6]。TDA技術(shù)還用于糖/氨基酸混合物發(fā)生美拉德反應(yīng)的產(chǎn)物[4]、咖啡[7]、燕麥[8]、胡蘿卜[9]、啤酒[10]、榛子[11]和奶酪[12]中呈苦味化合物研究；黑茶[13]、紅醋栗[14]、菠菜[15]中呈澀味物質(zhì)研究。但是，目前尚未有對(duì)揮發(fā)性呈味物質(zhì)的研究報(bào)道。

本研究運(yùn)用TDA的思路，擬建立一種白酒中揮發(fā)性苦味和澀味化合物提取、分離和鑒定的方法，以期確定白酒中呈苦味和澀味的揮發(fā)性物質(zhì)，為消減白酒苦澀味，提升白酒品質(zhì)提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

白酒樣品：芝麻香型原酒(64%vol)。

標(biāo)準(zhǔn)品與試劑： 乙醇、正丙醇、1-丁醇、2-甲基丙醇、3-甲基丁醇、糠醛、乳酸乙酯、乳酸、蔗糖、鹽酸奎寧、NaCl、谷氨酸鈉、單寧酸、磷酸和戊烷均為色譜級(jí)，購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司；無(wú)水乙醚為分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)，使用前進(jìn)行重蒸。進(jìn)行感官分析所用水為娃哈哈純凈水(購(gòu)自杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司)，使用前用1 mol/L磷酸(GRAS列為食品和藥物中的添加劑[16])將pH值調(diào)節(jié)至3.8。

1.2 儀器與設(shè)備

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀R-300，瑞士Buchi公司；便攜式密度計(jì)DM 35，奧地利Anton Paar 公司；GC-6890N-MSD 5975，美國(guó)Agilent 公司；Waters半制備液相色譜(配有Waters 2627自動(dòng)進(jìn)樣器、Waters 2489紫外/可見(jiàn)光檢測(cè)器、Waters 2535 四元泵洗脫系統(tǒng))，美國(guó)Waters 公司； N-EVAP111 氮吹儀，美國(guó)Organomation 公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 味覺(jué)品評(píng)訓(xùn)練

味覺(jué)品評(píng)小組由從事白酒風(fēng)味研究的10名學(xué)生和1 名具有12 年以上感官分析經(jīng)驗(yàn)的教師組成，所有成員均沒(méi)有味覺(jué)障礙史，且定期參加味覺(jué)培訓(xùn)(至少每周1次，持續(xù)2年)[4]。為盡可能減少任何有毒化合物的攝入，采用吞-吐法[13]進(jìn)行感官分析，即試驗(yàn)材料1 mL放入口腔中，在口腔中保持10 s后吐出。

1.3.2 真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)

50 mL樣品在30 ℃水浴條件下進(jìn)行真空(10 kPa)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，得到揮發(fā)性組分和不揮發(fā)組分，揮發(fā)性組分直接用于品嘗，不揮發(fā)組分經(jīng)真空冷凍干燥[6]，并用純凈水復(fù)溶。采用0～5六點(diǎn)刻度法對(duì)2個(gè)組進(jìn)行味覺(jué)品評(píng)。為防止嗅覺(jué)的干擾，味覺(jué)品評(píng)需要戴鼻夾。

1.3.3 梯度減壓蒸餾提取白酒中呈苦味和澀味的化合物

取100 mL酒樣置于250 mL旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶中，進(jìn)行梯度減壓蒸餾(0.08、0.06、0.04、0.02 MPa)，設(shè)置不同水浴加熱溫度(40、50、60、70、80、85、90 ℃)，探索在最小真空度(0.08 MPa)能蒸餾出液體的最小加熱溫度，并在此溫度下進(jìn)行減壓蒸餾，收集接收相。每1個(gè)梯度真空度條件蒸餾至5 min內(nèi)沒(méi)有液體滴下記為蒸餾結(jié)束，記錄每1個(gè)梯度真空條件下蒸餾時(shí)間和餾出組分體積。共收集到4個(gè)餾出組分，標(biāo)記為組分A、B、C和D，對(duì)餾出組分進(jìn)行感官品評(píng)。

1.3.4 半制備分離

對(duì)梯度減壓蒸餾提取到的呈苦味和澀味的組分B進(jìn)行半制備分離。分離條件：進(jìn)樣量800 μL；流動(dòng)相A：乙醇，流動(dòng)相B：水；采用X Bridge?Pre C18色譜柱(10 mm×250 mm，1.8 μm，Waters公司)，流速3 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)277 nm。洗脫條件：乙醇和水初始體積比5∶95，乙醇在8 min內(nèi)上升至20%，20 min上升至50%，12 min升至100%，并維持25 min。按色譜峰收集到10 個(gè)亞組分，并標(biāo)記為B-1～B-10，制備分離運(yùn)行10 個(gè)回合，合并收集的相應(yīng)組分，對(duì)所有組分進(jìn)行溶劑萃取。

1.3.5 溶劑萃取

用密度計(jì)(DM 35)分別測(cè)量半制備組分B-1～B-10的酒精體積分?jǐn)?shù)，并用純凈水稀釋至10%，每1個(gè)組分分別使用戊烷和乙醚進(jìn)行萃取，每個(gè)溶劑萃取3次(萃取劑的使用體積是稀釋后組分總體積的50%)。收集到的有機(jī)相平均分成2份，1份氮吹濃縮至250 μL用于GC-MS進(jìn)樣；另1份用4 mL純凈水水洗，恢復(fù)到原始體積，水洗相使用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除有機(jī)溶劑，用于味覺(jué)品評(píng)，選擇強(qiáng)度較大的亞組分進(jìn)行TDA分析。其中戊烷萃取水洗相命名為“B-X-I” (X是指1～10)，乙醚萃取水洗相命名為“B-X-II”，殘留相標(biāo)記為“B-X-III”。

1.3.6 TDA

根據(jù)感官評(píng)價(jià)結(jié)果(表 3)，對(duì)所有呈味亞組分(1～3 mL)分別用純凈水1∶1，1∶2，1∶4，……，稀釋?zhuān)M(jìn)行品評(píng)，計(jì)算TD值。其中苦味用三角試驗(yàn)測(cè)定，澀味采用半舌測(cè)定[6]。

1.3.7 呈味化合物鑒定

對(duì)TD值較大的亞組分進(jìn)行GC-MS分析，呈味化合物基于質(zhì)譜庫(kù)檢索與標(biāo)準(zhǔn)品驗(yàn)證比對(duì)以及對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品感官驗(yàn)證鑒定。

13.8 GC-MS條件

色譜柱：FFAP極性柱(60 m×0.25 mm×0.25 mm)，進(jìn)樣口溫度250 ℃；升溫程序：初溫50 ℃，保持2 min，以6 ℃/min 速率升溫至230 ℃，保持45 min；載氣(He)，流速2 mL/min；進(jìn)樣1 μL，不分流進(jìn)樣。

質(zhì)譜條件：離子源230 ℃，EI電離源，電子轟擊能量70 eV，掃描范圍為35～350 amu。

2 結(jié)果與討論

2.1 真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)

通過(guò)真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，將白酒樣品分成揮發(fā)性組分和不揮發(fā)組分。感官品評(píng)結(jié)果表明，澀味、苦味和甜味主要集中在揮發(fā)性組分中(表 1)，這與葡萄酒[6]和啤酒[10]中的苦味和澀味物質(zhì)不同。

表1 真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)分離白酒中揮發(fā)和不揮發(fā)物質(zhì)的味覺(jué)評(píng)價(jià)Table 1 Sensory evaluation of the volatile and nonvolatile compounds in Baijiu separated by vacuum rotary evaporation

注：a：強(qiáng)度采用0～5六點(diǎn)強(qiáng)度法打分，0：沒(méi)有感覺(jué)到；5：感覺(jué)很強(qiáng)烈。

2.2 梯度減壓蒸餾

設(shè)置不同水浴加熱溫度(40、50、60、70、80、85、90℃)，探索最小真空度0.08 MPa條件下能蒸餾出液體的最低溫度。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，只有水浴溫度達(dá)85 ℃之后，接收相才有液體餾出，故選取85 ℃作為水浴加熱條件，對(duì)樣品進(jìn)行梯度減壓蒸餾。

通過(guò)減壓蒸餾分別接收到 A、B、C和D四個(gè)組分，對(duì)4個(gè)組分進(jìn)行味覺(jué)品評(píng)(表 2)。組分A體積最大為61 mL，主要呈甜味，強(qiáng)度為3.0；組分 B體積最小，9 mL，但呈現(xiàn)了最強(qiáng)烈的澀味(4.6)和苦味(4.4)；組分C表現(xiàn)出較低的澀味(2.1)和苦味(1.8)強(qiáng)度;組分D主要呈現(xiàn)酸味(4.8)和輕微收斂的澀味(2.0)。基于感官品嘗結(jié)果，重點(diǎn)研究組分B。

表2 梯度減壓蒸餾分離組分A-D的味覺(jué)品評(píng)Table 2 Sensorial evaluation of fractions A-D from gradient vacuum distillation

2.3 味覺(jué)活性物質(zhì)分離

為了減少干擾，方便揮發(fā)性呈苦、澀味化合物的鑒定，對(duì)組分B進(jìn)行半制備分離，根據(jù)色譜峰收集到10個(gè)亞組分B-1～B-10。由于分離出的呈苦味和澀味的化合物是揮發(fā)性的，因此選用戊烷和乙醚分別進(jìn)行萃取，收集每個(gè)亞組分的有機(jī)相，平均分成2份，1份進(jìn)行GC-MS分析，另1份水洗后真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑進(jìn)行味覺(jué)品評(píng)。

呈味化合物主要存在于乙醚萃取相中，即亞組分II中(表 3)，且既呈澀味又呈苦味。其中亞組分 B-8-II的苦味和澀味強(qiáng)度最大，分別為4.6和4；其次是亞組分B-2-II，強(qiáng)度分別為3.4和3.2；再次是亞組分B-3-II，強(qiáng)度分別為3和2.6。戊烷萃取相(亞組分I)幾乎沒(méi)有味覺(jué)活性；萃取后殘留相(亞組分III)中的B-4-III、B-6-III和B-8-III呈現(xiàn)輕微的味覺(jué)特征。

運(yùn)用三角試驗(yàn)和半舌試驗(yàn)對(duì)乙醚萃取相(亞組分II)進(jìn)行TDA分析。TD值最大的是亞組分B-8-II(表 4)，澀味TD值128，其次是亞組分B-2-II，為64；第3是亞組分B-3-II，稀釋32倍后仍能感受到澀味。此外，亞組分B-8-II也顯示了最強(qiáng)烈的苦味，其TD值為32(表 4)，亞組分B-2-II和B-3-II的苦味TD值均為16，亞組分B-4-II的TD值為8。

表3 戊烷三乙醚溶劑萃取組分的味覺(jué)特征及強(qiáng)度Table 3 Taste qualities and intensity of the fractions from pentane-diethyl ether solvent extraction

注：a組分B-1～B-10：指從半制備分離得到的10個(gè)亞組分； I是指半制備組分的戊烷萃取相；II是指半制備組分的乙醚萃取相；III是指半制備組分萃取后的殘留相。b表示沒(méi)有明顯味覺(jué)。

表4 乙醚萃取組分的味覺(jué)特征、味覺(jué)稀釋(TD)值及呈味化合物的鑒定Table 4 Taste qualities, taste dilution (TD) factors and identification of the compounds from diethyl ether extraction fractions

注：a測(cè)定TD因子時(shí)，澀味采用半舌試驗(yàn)測(cè)定，苦味采用三角試驗(yàn)測(cè)定。

為鑒定呈苦、澀味化合物，對(duì)相關(guān)組分進(jìn)行GC-MS分析(表 4)。所有解析到的化合物均通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)品驗(yàn)證。在亞組分B-8-II中鑒定出3-甲基丁醇和2-苯乙醇。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品味覺(jué)品嘗驗(yàn)證，在水溶液中3-甲基丁醇既呈澀味又呈苦味，2-苯乙醇只呈澀味，2-苯乙醇的味覺(jué)特征是首次報(bào)道；亞組分B-2-II中鑒定出正丙醇、乳酸乙酯和糠醛，其中正丙醇、糠醛在水溶液中呈現(xiàn)苦味和澀味，乳酸乙酯只呈澀味；亞組分B-3-II和B-4-II都含相同的呈味化合物2-甲基丙醇和1-丁醇，它們都呈現(xiàn)苦味和澀味。這些化合物是白酒中常見(jiàn)的香氣化合物[17-18]。部分化合物如正丙醇、1-丁醇、乳酸乙酯、2-甲基丙醇、3-甲基丁醇和糠醛呈苦味和澀味特征與原先推測(cè)吻合[3, 19]。

3 結(jié)論

本研究以芝麻香型原酒為研究對(duì)象，首次建立了白酒中揮發(fā)性苦味和澀味化合物提取、分離、鑒定的方法。通過(guò)梯度減壓蒸餾、半制備分離、溶劑萃取、TDA結(jié)合GC-MS，鑒定白酒中揮發(fā)性的呈苦、澀味化合物。采用此方法發(fā)現(xiàn)2-苯乙醇和乳酸乙酯在白酒中呈現(xiàn)澀味，而糠醛、2-甲基丙醇、3-甲基丁醇、1-丁醇和正丙醇同時(shí)呈澀味和苦味,其中2-苯乙醇是首次報(bào)道了其味覺(jué)特征。下一步將進(jìn)行這些化合物苦澀味閾值測(cè)定，以及pH等對(duì)苦、澀味的影響研究。