LncRNA MEG 3通過抑制HIF1α的表達(dá)降低膠質(zhì)瘤 U251細(xì)胞的增殖與侵襲能力

羅奇志，張 帆，李 威，王 芳，鄔力祥，黃柏勝

中南大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院1免疫學(xué)系，2生理學(xué)系，湖南 長沙 410008

膠質(zhì)瘤是最常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)原發(fā)性惡性腫瘤，發(fā)病機(jī)制仍然不清楚，其惡性表型的發(fā)生發(fā)展與腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲、血管生成相關(guān)基因表達(dá)等復(fù)雜過程有關(guān)。膠質(zhì)瘤具有獨(dú)特的侵襲性從而影響其有效治療［1］，中位生存期僅14.6月［2］。近年來長鏈非編碼RNA（lncRNA）作為一個(gè)重要的分子在生物調(diào)控中得到廣泛的關(guān)注［3-4］，lncRNA為長度大于200nt的非編碼RNA，幾乎不具有蛋白編碼能力［5］，腫瘤抑制因子母系表達(dá)基因3（MEG3）是lncRNA的一種，定位于染色體14q32。MEG3通過靶向Rac1抑制甲狀腺癌的遷移和侵襲，通過調(diào)控BMP4而促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化，下調(diào)MEG3的表達(dá)促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞的增殖［6］。lncRNA在膠質(zhì)瘤中發(fā)揮廣泛的作用，lncRNAXIST通過miR-133a/SOX4促進(jìn)膠質(zhì)瘤的增殖和轉(zhuǎn)移［7］；MEG3可通過各種信號(hào)通路抑制膠質(zhì)瘤等腫瘤的發(fā)生發(fā)展［8-10］，MEG3可作為一個(gè)強(qiáng)有力的生物標(biāo)志物和預(yù)后指標(biāo)［11］。缺氧誘導(dǎo)因子1α（HIF1α）是腫瘤細(xì)胞的主要生存因子，在許多腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，介導(dǎo)腫瘤血管和淋巴適應(yīng)缺氧環(huán)境。HIF1α可增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲和遷移而促進(jìn)腫瘤的血管形成［12］，在腫瘤的放療、化療失敏感性及預(yù)后不良等方面均發(fā)揮關(guān)鍵作用［13］。然而，膠質(zhì)瘤中MEG3作用的靶點(diǎn)及機(jī)制尚未闡明，膠質(zhì)瘤中MEG3能否通過調(diào)控HIF1α的表達(dá)，從而影響膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長和侵襲，目前尚無相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。因此，本研究探討U251細(xì)胞中MEG3與HIF1α的表達(dá)水平，研究MEG3對(duì)HIF1α表達(dá)的影響，揭示U251細(xì)胞的增殖和侵襲與MEG3調(diào)控HIF1α的表達(dá)相關(guān)，研究結(jié)果可能將MEG3作為膠質(zhì)瘤的臨床治療提供潛在的分子靶點(diǎn)。

1 材料和方法

1.1 材料

胎牛血清（Invitrogen），DMEM培養(yǎng)液（Hyclone），Trizol（Invitrogen），SYBR-Green RT-PCR 試 劑 盒(Takara)，脂質(zhì)體lipofectamine 2000(Invitrogen)，HIF1α一抗（百奧萊博），辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG二抗（SantaCruz）、MTT 試劑（Promega）、Transwell小室（Corning）、人胚腦膠質(zhì)細(xì)胞（Human fetal glial cells,HFGC）和U251細(xì)胞（上海細(xì)胞所），pcDNA3.1-MEG3重組載體為本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞、HFGC細(xì)胞于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，置于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，根據(jù)各細(xì)胞的生長情況進(jìn)行換液或傳代。

1.2.2 重組載體轉(zhuǎn)染 實(shí)驗(yàn)分為未轉(zhuǎn)染組（Con）、pcDNA3.1空載體轉(zhuǎn)染組（NC）及重組載體pcDNA3.1-MEG3轉(zhuǎn)染組（MEG3）。在培養(yǎng)的U251細(xì)胞融合度為70%～80%時(shí)，更換不含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，按照脂質(zhì)體lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染說明書將pcDNA3.1-MEG3重組載體及相應(yīng)空載體（NC）轉(zhuǎn)染至培養(yǎng)的U251細(xì)胞。

1.2.3 細(xì)胞缺氧處理 將Con、NC、pcDNA3.1-MEG3組U251細(xì)胞的培養(yǎng)液換成不含血清且無糖DMEM培養(yǎng)液，立即將各組細(xì)胞置入缺氧密閉盒內(nèi)，將5% CO2+95% N2的缺氧混合氣體通入密閉盒內(nèi)0.5 h排除盒內(nèi)空氣，然后用封口膜封閉密閉盒，置于37℃飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h，即為缺氧處理。

1.2.4 MEG3和HIF1α表達(dá)的檢測

1.2.4.1 qRT-PCR檢測MEG3和HIF1α mRNA的表達(dá)采用Trizol試劑分別從培養(yǎng)的HFGC細(xì)胞、U251細(xì)胞中抽提總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，再以cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。采用標(biāo)準(zhǔn)SYBR-Green RT-PCR試劑盒，按照說明書的操作步驟分別檢測MEG3和HIF1α的表達(dá)水平。引物序列分別為：MEG3上游5'-atagcgcccc ctattcatgc-3'，下游 5'-gggagcagctatggatcacc-3'；HIF1α上游 5-ccacagaaactaccttcaactcc-3'，下游 5'-gtgatctccttctgc atcctgt-3'，內(nèi)參β-actin上游5'-aggggccggactcgtcatact-3'，下游5'-ggcggcaccaccatgtaccct-3'；反應(yīng)條件如下：95℃預(yù)變性2 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 15 s，35個(gè)循環(huán)，72℃5 min終止反應(yīng)。MEG3及HIF1α的相對(duì)表達(dá)水平通過 2-ΔΔCt方法分析獲得。

1.2.4.2 Western blot檢測HIF1α蛋白的表達(dá) 收集上述各組細(xì)胞用0.25%胰酶消化，1500 r/min離心后棄上清；再分別用1 mLPBS重懸細(xì)胞，1500 r/min離心棄上清，細(xì)胞沉淀用于提取蛋白。取一定量總蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用TBST室溫封閉1 h，分別用稀釋的抗HIF1α或內(nèi)參β-actin一抗4℃孵育過夜。TBST漂洗3次，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG二抗，室溫孵育1 h。TBST漂洗3次，用ECL試劑盒檢測。

1.2.5 MTT方法 將處于對(duì)數(shù)生長期的U251細(xì)胞以終濃度2×103/孔種殖在96孔板，待細(xì)胞生長融合度為70%～80%時(shí)，將U251細(xì)胞進(jìn)行pcDNA3.1-MEG3重組載體轉(zhuǎn)染。在U251細(xì)胞轉(zhuǎn)染后0、24、48、72 h每孔分別加入5 mg/mL的MTT20 μL（終濃度為0.5 mg/mL），孵育4 h，棄上清，每孔加入200 μL DMSO，震蕩20 min，置酶標(biāo)儀570nm處測定吸光度（A570nm）。

1.2.6 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn) 分別將轉(zhuǎn)染了pcDNA3.1-MEG3重組載體及相應(yīng)空載體的U251細(xì)胞置于侵襲小室上層，含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液置于侵襲小室的下層；在37℃培養(yǎng)箱孵育48 h后，用棉簽將小室上層細(xì)胞刮下去除，然后用4%多聚甲醛將小室下層細(xì)胞固定15 min、結(jié)晶紫染色15 min后在顯微鏡下觀察。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 用SPSS17.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩組比較采用t檢驗(yàn)。Real-time PCR數(shù)值分析采用2-ΔΔCt分析法計(jì)算基因表達(dá)的相對(duì)比值，結(jié)果以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MEG3在HFGC細(xì)胞及U251細(xì)胞中的表達(dá)

qRT-PCR結(jié)果顯示，與HFGC細(xì)胞比較，U251細(xì)胞中MEG3的表達(dá)明顯降低（P＜0.05，表1）。

表1 HFGC組與U251細(xì)胞組MEG3表達(dá)比較Tab.1 Comparison of MEG3 expression between HFGCs and U251 cells(Mean±SD)

2.2 HIF1α在HFGC細(xì)胞及U251細(xì)胞中的表達(dá)

qRT-PCR結(jié)果顯示，與HFGC細(xì)胞比較，U251細(xì)胞中HIF1α的表達(dá)明顯增高（P＜0.05，表2）。Western blot結(jié)果顯示，與HFGC細(xì)胞比較，U251細(xì)胞中HIF1α蛋白的表達(dá)亦明顯增高（圖1）。

圖1 HFGC與U251細(xì)胞中HIF1α的表達(dá)Fig.1 Expression of HIF1α in HFGC and U251 cells.

2.3 過表達(dá)MEG3對(duì)HIF1α表達(dá)的影響

常氧培養(yǎng)條件下，qRT-PCR結(jié)果顯示，過表達(dá)MEG3使 HIF1α mRNA的表達(dá)降低（P＜0.05，表3）；Western blot結(jié)果顯示，過表達(dá)MEG3使HIF1α蛋白的表達(dá)亦降低（圖2A），在缺氧處理的上述細(xì)胞中，MEG3過表達(dá)亦使HIF1α蛋白的表達(dá)降低（圖2B）。

圖2 過表達(dá)MEG3對(duì)HIF1α蛋白表達(dá)的影響Fig.2 Effect of overexpression of MEG3 on expression of HIF1α protein.A:Normoxic treatment.B:Hypoxic treatment.

表2 HFGC組與U251細(xì)胞組HIF1α表達(dá)比較Tab.2 Comparison of HIF1α expression betweenHFGC group and U251 cell group(Mean±SD)

表3 過表達(dá)MEG3對(duì)HIF1αmRNA表達(dá)的影響Tab.3 Effect of overexpression MEG3 on HIF1α mRNA expression(n=6,Mean±SD)

2.4 MEG3對(duì)U251細(xì)胞增殖的影響

將pcDNA3.1-MEG3重組載體轉(zhuǎn)染U251細(xì)胞，在不同的時(shí)間點(diǎn)檢測細(xì)胞增殖情況，MTT結(jié)果顯示，與未轉(zhuǎn)染組（Con）細(xì)胞及轉(zhuǎn)染pcDNA3.1空載體組（NC）細(xì)胞比較，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-MEG3組48h后細(xì)胞的吸光度A值明顯降低（P＜0.05，表4）。

表4 過表達(dá)MEG3對(duì)U251細(xì)胞增殖的影響Tab.4 Effect of overexpression of MEG3 on proliferation of U251 cells(n=6,Mean±SD)

2.5 MEG3對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲的影響

Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與Con組相比較，NC組細(xì)胞侵襲數(shù)無差異（P＞0.05），而過表達(dá)MEG3組細(xì)胞侵襲數(shù)明顯降低（P＜0.05，圖3）。

圖3 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測U251細(xì)胞侵襲能力的變化Fig.3 Change of invasion ability of U251 cells detected by Transwell assay(Original magnification:×400).A:Con group;B:NCgroup;C:pcDNA3.1-MEG3group.

3 討論

影響腫瘤細(xì)胞血管生成、侵襲和增殖相關(guān)基因表達(dá)的復(fù)雜過程導(dǎo)致膠質(zhì)瘤惡性表型的發(fā)生發(fā)展，對(duì)基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的進(jìn)一步研究將闡明膠質(zhì)瘤發(fā)生的分子機(jī)制以及找出新的生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。膠質(zhì)瘤是人類最常見的腦腫瘤，具有獨(dú)特的侵襲性而影響其有效治療，死亡率高，整體預(yù)后非常差［14］。近年來膠質(zhì)瘤的靶向治療成為新的方向，因此，尋找新的分子靶點(diǎn)和治療方法對(duì)膠質(zhì)瘤的臨床治療至關(guān)重要。本研究檢測了U251細(xì)胞中MEG3及HIF1α的表達(dá)，qRT-PCR結(jié)果顯示，與HFGC細(xì)胞比較，U251細(xì)胞中MEG3的表達(dá)水平低，而HIF1α的表達(dá)水平高；Western blot結(jié)果亦顯示U251細(xì)胞中HIF1α蛋白表達(dá)高于HFGC細(xì)胞HIF1α蛋白表達(dá)，結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道膠質(zhì)瘤中MEG3低表達(dá)［8,15］，而HIF1α高表達(dá)一致［16］；另外研究報(bào)道，MEG3在肺癌［17］、肝癌［18］、膀胱癌［19］、前列腺癌［20］、胃癌［21］及乳腺癌［22］組織中的表達(dá)明顯低于鄰近正常組織，表明MEG3在多種腫瘤中低表達(dá)，說明MEG3是一種潛在的腫瘤抑制基因，然而膠質(zhì)瘤中MEG3的功能尚未闡明，需要進(jìn)一步研究。

研究表明lncRNA在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮致癌或抑癌基因的功能，lncRNA表達(dá)水平與腫瘤的發(fā)展有關(guān)［23］。經(jīng)生物信息學(xué)GTRD數(shù)據(jù)庫（http://gtrd.biouml.org/）分析，預(yù)測HIF1α可作為MEG3的候選靶基因。文獻(xiàn)報(bào)道，在慢性間隙性缺氧小鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞中，沉默MEG3可下調(diào)HIF1α的表達(dá)［24］。在氯化鎳處理的肺支氣管上皮細(xì)胞癌中，MEG3可通過Akt/p70S6K/S6軸抑制HIF1α的表達(dá)［25］。本研究發(fā)現(xiàn)：無論在常氧培養(yǎng)下還是缺氧狀態(tài)下，當(dāng)過表達(dá)膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞中MEG3時(shí)，候選靶基因HIF1α蛋白表達(dá)水平均出現(xiàn)下調(diào)，表明在膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞中MEG3可以抑制HIF1α的表達(dá)。至于膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞中的MEG3是直接抑制HIF1α，還是間接抑制HIF1α的表達(dá)，尚有待進(jìn)一步研究證實(shí)。為研究其生物學(xué)功能，我們亦分析了MEG3對(duì)U251細(xì)胞增殖和侵襲的影響。結(jié)果可見，過表達(dá)MEG3，U251細(xì)胞吸光度值及侵襲數(shù)明顯降低，表明過表達(dá)MEG3可抑制U251細(xì)胞的增殖及侵襲。研究報(bào)道，腫瘤抑制因子MEG3存在多種抗腫瘤機(jī)制，膠質(zhì)瘤組織中MEG3的表達(dá)低于癌旁組織，它通過靶向miR-93及抑制PI3K/AKT信號(hào)通路從而抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長［8］。過表達(dá)MEG3抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、誘導(dǎo)凋亡［26］，抑制黑色素瘤細(xì)胞的DNA合成、克隆形成等［27］。宮頸癌中MEG3低表達(dá)，它通過miR-21影響宮頸癌細(xì)胞的生長［28］。另外，骨肉瘤組織中MEG3的表達(dá)顯著低于癌旁組織，MEG3過表達(dá)抑制骨肉瘤MG63細(xì)胞的增殖與侵襲、促進(jìn)凋亡［29］。HIF1α能誘導(dǎo)血管新生，增強(qiáng)糖酵解，上調(diào)細(xì)胞增殖因子及侵襲相關(guān)基因的表達(dá)水平，從而適應(yīng)缺氧微環(huán)境。在缺氧環(huán)境下，HIF1α作為腫瘤惡性進(jìn)展的一個(gè)重要分子，在腫瘤的增殖、轉(zhuǎn)移以及發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用。本研究結(jié)果顯示膠質(zhì)瘤中MEG3作為腫瘤抑制因子的潛在機(jī)制可能包括MEG3通過調(diào)控HIF1α的表達(dá)，從而影響膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞的增殖與侵襲。

總之，在膠質(zhì)瘤中MEG3低表達(dá)與HIF1α高表達(dá)同時(shí)存在，MEG3通過抑制HIF1α的表達(dá)從而影響膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞的增殖和侵襲。但MEG3也可以調(diào)控miR-96-5p［30］等其他下游基因或HIF1α亦受到miR-377-5p［31］，miR-24-3p［32］，NAT12/NAA30［33］，F(xiàn)AT1［34］等其他上游基因的調(diào)控。本研究結(jié)果揭示了MEG3通過調(diào)控HIF1α影響膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞增殖與侵襲作用機(jī)制，為臨床治療膠質(zhì)瘤提供新思路。