博萊霉素誘導(dǎo)小鼠肺纖維化中差異表達的mRNA及其與LncRNA的共表達網(wǎng)絡(luò)關(guān)系

喻雪飛，李 理，鄭林鑫，李偉峰

1廣州中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，廣東 廣州 510405；2解放軍南部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院，廣東 廣州 510010

特發(fā)性肺纖維化是一種病因不明、慢性、進行性、纖維化性間質(zhì)性肺疾病，缺乏有效治療方法，預(yù)后極差［1-2］。其病理特征主要是肺泡上皮損傷，過量的細胞外基質(zhì)沉積等，這些病理改變引起肺組織正常結(jié)構(gòu)破壞，氣體交換受阻，進而引起心臟和其他重要臟器病變［3］。隨著對特發(fā)性肺纖維化的病理生理進程的研究不斷深入，越來越多的發(fā)病理生理機制被提出，包括細胞老化、氧化損傷、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、間質(zhì)轉(zhuǎn)化、細胞可塑性、微小RNA、外泌體等，但其發(fā)病機制仍未被完全闡述［4-6］。近年來，LncRNA由于其廣泛參與各種生命活動的特性在眾多疾病的發(fā)病機制中的作用受到廣泛關(guān)注［7］。有研究表明，LncRNA的異常表達可導(dǎo)致腫瘤等疾?。?-9］。然而，肺纖維化中LncRNA的表達和作用機制仍然未知。因此在本研究中，我們使用博來霉素誘導(dǎo)肺纖維化小鼠模型，采用基因芯片檢測博來霉素組和對照組肺組織中LncRNA與mRNA的表達，為探討其在肺纖維化發(fā)生發(fā)展中的作用提供前期基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實驗分組與模型建立

20只6周齡的無特定病原體級別C57BL/6小鼠從南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心購買，體質(zhì)量18.9～23.8 g。由中國人民解放軍南部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院實驗動物中心進行飼養(yǎng)，經(jīng)動物倫理委員會許可，嚴(yán)格遵守《實驗動物管理條例》進行所有實驗操作。將20只小鼠隨機地平均分成2個組（雌雄各半）：分別為對照組、模型組，10只/組。將各組小鼠麻醉成功后固定于小鼠手術(shù)操作臺，縱行切開頸前皮膚暴露氣管，朝模型組小鼠向心端氣管內(nèi)注入100 μL博來霉素溶液（3 mg/kg），對照組小鼠注入等量的0.9%的氯化鈉注射液。注射后旋即令小鼠頭朝上且直立旋轉(zhuǎn)以使藥液在其肺內(nèi)分布均勻；造模之后的第14天處死小鼠，解剖并收集小鼠肺組織標(biāo)本。

1.2 蘇木精-伊紅（HE）染色與馬松三色染色

采用10%水合氯醛對各組小鼠進行腹腔注射麻醉后，用眼科剪剪斷腹主動脈放血以處死小鼠，暴露胸部，以眼科鑷夾住小鼠肺主支氣管，小心分離出肺組織，用濾紙吸干將肺組織表面殘留液體，盡快置于4%多聚甲醛中浸泡，在固定48 h后，經(jīng)常規(guī)脫水、石蠟包埋、2μm厚度切片后，常規(guī)進行HE與Masson染色。

1.3 基因芯片篩選差異表達

mRNA與LncRNA TRIzol法提取各組肺組織RNA，采用Arraystar小鼠LncRNA芯片V3.0芯片檢測分析。使用Agilent Feature Extraction軟件（v11.0.1.1）獲得芯片圖，并讀值，得到原始數(shù)據(jù)。使用GeneSpring GX v12.1軟件（Agilent Technologies）對原始數(shù)據(jù)進行Quantile標(biāo)準(zhǔn)化和隨后的數(shù)據(jù)處理。原始數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化后經(jīng)過篩選高質(zhì)量探針（某探針在6個樣品中至少有3個被標(biāo)記為Present或Marginal）進行進一步分析。兩個樣品間差異表達LncRNA或差異表達mRNAs通過Fold Change篩選。以倍數(shù)變化（FC）＞2且P＜0.05認(rèn)為存在差異表達。

1.4 對差異mRNA進行生物信息學(xué)分析

利用David 6.7在線平臺對差異表達的基因作基因本體論（GO）分析和全基因組及代謝途徑數(shù)據(jù)庫（KEGG）通路分析。根據(jù)最新KEGG數(shù)據(jù)庫，分析差異表達mRNAs的信號通路。

1.5 qRT-PCR驗證纖維化相關(guān)mRNA與LncRNA表達

針對每一個需要測量的基因和管家基因，選擇確定表達該基因的cDNA模板進行PCR反應(yīng)，配置反應(yīng)體系（2×Master Mix 5 μL，10 μmol/L的PCR特異引物F 0.5μL，10 μmol/L的PCR特異引物R 0.5 μL，cDNA2 μL加水至總體積為10 μL），引物序列見表1，輕彈管底將溶液混合，5000 r/min短暫離心，設(shè)置PCR反應(yīng)：95 ℃，10 min；40個PCR循環(huán)（95 ℃，10 s；60 ℃，60（收集熒光））。PCR產(chǎn)物與100 bp DNALadder在2%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色，檢測PCR產(chǎn)物是否為單一特異性擴增條帶。將PCR產(chǎn)物進行10倍梯度稀釋：設(shè)定PCR產(chǎn)物濃度為1，分別稀釋為1×10-1，1×10-2，1×10-3，1×10-4，1×10-5，1×10-6，1×10-7，1×10-8，1×10-9，這幾個梯度濃度的DNA。將所有cDNA樣品分別配置Realtime PCR反應(yīng)體系。將8 μL混合液加到384-PCR板對應(yīng)的每個孔中。再加入對應(yīng)的2 μL cDNA。小心粘上Sealing Film封口膜，并短暫離心混合。在設(shè)置PCR程序前將準(zhǔn)備好的PCR板放在冰上。將上述384-PCR板置于Realtime PCR儀上進行PCR反應(yīng)。所有的指標(biāo)均按以下程序進行：95℃，10 min；40個PCR循環(huán)（95℃，10 s；60℃，60s（收集熒光））。為了建立PCR產(chǎn)物的熔解曲線，擴增反應(yīng)結(jié)束后，按（95℃，10s；60℃，60s；95℃，15s）；并從60℃緩慢加熱到99℃（儀器自動進行-RampRate為0.05℃/s）。各樣品的目的基因和管家基因分別進行RealtimePCR反應(yīng)。根據(jù)繪制的梯度稀釋DNA標(biāo)準(zhǔn)曲線，各樣品目的基因和管家基因的濃度結(jié)果直接由機器生成。每個樣品的目的基因濃度除以其管家基因的濃度，即為此樣品此基因的校正后的相對含量。

1.6 共表達CNC網(wǎng)絡(luò)信息學(xué)分析

根據(jù)前述基因GO、Pathway分析的纖維化相關(guān)的條目，同時參考肺纖維文獻報道的相關(guān)基因，挑選代表性的mRNAs，并比對在本芯片中他們的差異變化，觀察P值。將挑選出得代表性得mRNAs，和所有差異LncRNA進行CNC共表達分析。通過計算皮爾遜相關(guān)系數(shù)對上述mRNAs和所有差異LncRNA的表達相關(guān)性進行分析，篩選皮爾遜相關(guān)系數(shù)≥0.98，P值≤0.05，fdr≤0.1的結(jié)果作為相互關(guān)系對。根據(jù)上述皮爾遜相關(guān)系數(shù)結(jié)果，利用Cytoscape繪圖繪制mRNA-LncRNA關(guān)系對。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS22.0對所有的實驗結(jié)果進行統(tǒng)計學(xué)的分析處理。所有數(shù)據(jù)均進行正態(tài)性檢驗，符合正態(tài)性檢驗后以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。樣本符合正態(tài)分布、方差齊時，采用兩組獨立樣本的t檢驗法進行分析，當(dāng)P＜0.05時，即認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義；樣本符合正態(tài)分布、但方差不齊時，采用兩組獨立樣本的t'檢驗，當(dāng)P＜0.05時，認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

表1 qRT-PCR使用的引物列表Tab.1 Primers used for qRT-PCR

2 結(jié)果

2.1 模型鑒定

HE染色示對照組小鼠肺組織的完整而清晰，肺泡壁薄且較連續(xù)，肺泡無明顯的炎癥細胞浸潤；模型組：小鼠肺組織出現(xiàn)彌漫性實變，肺泡壁增厚明顯，肺泡間隔破壞，肺泡中可見大量炎癥細胞浸潤，較多成纖維細胞出現(xiàn)在肺間質(zhì)（圖1）。Masson染色示對照組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)清晰，未見明顯炎癥細胞浸潤及上皮下的藍色膠原沉積；模型組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)紊亂，肺間質(zhì)可見炎癥細胞浸潤，上皮下的藍色膠原沉積明顯增加（圖2）。證實肺纖維化模型構(gòu)建成功，可用于進一步實驗。

圖1 小鼠肺組織病理染色Fig.1 Histopathological examination of lung tissues of the mice(HE staining,original magnification:×200).A:Control group.B:Model group.

圖2 小鼠肺組織病理染色Fig.2 Masson staining of lung tissues of the mice(×200).A:Control group.B:Model group.

2.2 芯片篩選差異mRNA結(jié)果

將6個合格樣本同時進行高通量mRNA芯片雜交后的微點陣圖顯示，共檢測出16 403條mRNA，進行聚類分析與比較后，發(fā)現(xiàn)差異表達的共311條mRNAs，用于輔助LncRNA的研究（表2）。

表2 部分差異表達mRNAsTab.2 List of some of the differentially expressed mRNAs in mice with lung fibrosis

2.3 聚類分析肺纖維中差異表達mRNA的信號通路

依據(jù)上述得到的差異表達mRNA，使用GO聚類分析在肺纖維組中差異表的mRNA參與了免疫應(yīng)答及調(diào)節(jié)、信號傳導(dǎo)、細胞增殖及分化、細胞粘附和遷移等生物過程，KEGG通路分析顯示在上調(diào)的mRNA主要涉及細胞黏附分子、ECM受體相互作用、DNA復(fù)制、補體途徑等通路，下調(diào)的mRNA主要涉及氧化磷酸化、氨基酸、甘油酯代謝通路（圖3、4）。

圖3 GO分析差異表達基因的生物學(xué)過程Fig.3 Enrichment of mRNAs associated with biological processes.A:Up-regulated mRNAs.B:Down-regulated mRNAs.

圖4 KEGG通路富集分析Fig.4 KEGG pathway analysis.A:Up-regulated mRNAs.B:down-regulated mRNAs.

2.4 篩選并驗證纖維化相關(guān)mRNA

根據(jù)第一部分基因GO、Pathway分析的相關(guān)通路的條目，同時參考肺纖維文獻報道的相關(guān)基因，挑選代表性的mRNAs，并比對在本芯片中他們的差異變化，觀察P值，qRT-PCR進一步驗證纖維化相關(guān)mRNA表達。最終篩選出與芯片結(jié)果相一致的包括ccl8，ccl6，CD177，Ndnf，Krtap4-1，Bcl2l15共6個與纖維化相關(guān)mRNA（圖5）。

圖5 挑選得6個肺纖維化相關(guān)mRNA的microarray與qRT-PCR結(jié)果比較Fig.5 Comparison of expression levels of 6 fibrosis-related mRNAs between microarray and qRT-PCR validation.The qRT-PCR results were consistent with the microarray data.

2.5 CNC網(wǎng)絡(luò)信息學(xué)分析

通過分析上述6個篩選出的mRNA和所有差異LncRNA的CNC共表達關(guān)系，構(gòu)成如下具有高度相關(guān)性的CNC共表達網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖（圖6），結(jié)果顯示，纖維化相關(guān)mRNA和大量差異表達的LncRNA存在高度相關(guān)性，是一對多的關(guān)系。在此圖中共有208個結(jié)點，其中6個為上述mRNA，其余202個為LncRNA。紅色為芯片所有差異表達的LncRNA，綠色為經(jīng)qPCR驗證的差異纖維化相關(guān)的mRNA。圖中實線表示兩個結(jié)點內(nèi)的基因之間存在相關(guān)性，虛線則表示兩個結(jié)點內(nèi)的基因之間存在負相關(guān)性，mRNA和LncRNA對的共表達程度用實線或虛線的長度進行表示。

圖6 6個纖維化相關(guān)mRNA和其高度相關(guān)的LncRNAs共表達網(wǎng)絡(luò)圖Fig.6 Co-expression networks of 6 fibrosis-related mRNAs and their highly correlated lncRNAs.

2.6 CNC網(wǎng)絡(luò)中挑選3個差異表達的LncRNA進行qRT-PCR驗證

進一步挑選CNC網(wǎng)絡(luò)中3個表達差異的LncRNA（NR_040597、AK085645與AK086961）進行qRT-PCR驗證，結(jié)果顯示：與對照組相比，模型組中NR_040597的表達下調(diào)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義；與對照組相比，模型組中AK085645的表達下調(diào)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義；與對照組相比，模型組中AK086961的表達下調(diào)，但差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義（圖7）。

圖7 qRT-PCR驗證挑選的LncRNAs結(jié)果Fig.7 Expression of selected lncRNAs by qRT-PCR.In qRT-PCR validation,a vs control group,P=0.006，t=12.12,n=3;b vs control group,P=0.043,t=4.67,n=3;c vs control group,cP=0.913,t=0.12,n=3.

3 討論

LncRNA是長度大于200個核苷酸的非編碼RNA，參與廣泛的生物過程，從轉(zhuǎn)錄到mRNA拼接、RNA衰變和翻譯等基因生命周期中幾乎每一步都能受到LncRNA的影響［10］。LncRNA具有“一對多”和“多對一”的“樞紐”調(diào)節(jié)功能，能夠在表觀遺傳調(diào)控、轉(zhuǎn)錄調(diào)控以及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等眾多層面調(diào)控基因表達［11-12］。目前研究表明，LncRNA在多個器官纖維化發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用［13-14］。LncRNA-ATB可通過競爭性結(jié)合miR-425-5p激活活化肝星狀細胞，增加膠原I產(chǎn)生來促進HCV誘導(dǎo)的肝纖維發(fā)生［15］。心肌細胞中LncRNA GAS5與miR-21相互作用調(diào)節(jié)抑癌基因磷脂酶和張力蛋白同源物的表達，影響心臟成纖維細胞的增殖［16］。Lnc-TSI通過抑制Smad3的磷酸化阻斷TGF-β/Smad3通路活化，從而抑制腎臟纖維化的發(fā)生發(fā)展［17］。有對人肺纖維化組織樣本的研究表明LncRNA-CD99P1與n341773可能通過抑制膠原蛋白的表達影響成纖維細胞的增殖與分化［18］。也有在IL-1β誘導(dǎo)的纖維化細胞模型中研究發(fā)現(xiàn)LncRNA-IL7AS與MIR3142HG具有調(diào)節(jié)纖維化中炎癥反應(yīng)的作用［19］。這表明LncRNA在人肺纖維化中也發(fā)揮著一定作用，但目前，LncRNA在肺纖維化疾病中的作用研究較少。因此本研究采用基因芯片檢測肺纖維化組和對照組肺組織中LncRNA及mRNA的表達，通過CNC共表達分析計算出與肺纖維化相關(guān)mRNA具有相同表達模式的LncRNA，通過這些熟知mRNA的功能，來推導(dǎo)lncRNA的功能，為探討其在肺纖維化發(fā)生發(fā)展中的作用提供前期基礎(chǔ)［20］。

本研究通過小鼠動物模型進行肺纖維化中差異mRNA/LncRNA的篩選。博來霉素是一種糖肽類抗生素，可引起細胞內(nèi)單鏈和雙鏈DNA斷裂，進而產(chǎn)生超氧化物和氫氧根自由基，引起炎癥反應(yīng)、肺毒性及肺纖維化［21］。研究表明，氣管內(nèi)注射博來霉素造模更加穩(wěn)定可靠，且與臨床IPF的病理機制更加貼近，因此我們使用氣管內(nèi)注射博來霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化模型［22］。研究結(jié)果表明模型組小鼠肺組織大面積實變，肺泡間隔增厚，間隔內(nèi)成纖維細胞增多，肺泡內(nèi)出血，炎癥細胞浸潤，和大量藍色膠原沉積，肺纖維化動物模型復(fù)制成功。進一步提取各組肺組織RNA，應(yīng)用Arraystar小鼠LncRNA芯片V3.0芯片檢測篩選mRNA與LncRNA。

篩選結(jié)果顯示，與對照組相比，模型組中存在差異性表達（FC＞2.0倍且P＜0.05）的mRNA共311個，其中表達上調(diào)的mRNA127個，表達下調(diào)的有184個，GO分析及pathway分析發(fā)現(xiàn)發(fā)生變化的基因在生物學(xué)功能上主要涉及免疫反應(yīng)、細胞分化、細胞骨架等,參與的信號通路主要有細胞因子與細胞因子受體相互作用、趨化因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路等。上述的GO分析主要富集的功能，與既往肺纖維化方向研究的主要生物進程高度一致，同時也提示了芯片的可靠性［23-24］。根據(jù)第一部分基因GO、Pathway分析的纖維化相關(guān)的條目，同時參考肺纖維文獻報道的相關(guān)基因，挑選代表性的mRNAs，并比對在本芯片中他們的差異變化，觀察P值，最終篩選出CCL8、CCL6、CD177、Ndnf、Krtap4-1、Bcl2l15共6個與纖維化相關(guān)mRNA。為了驗證芯片的可靠性，我們通過qRT-PCR進一步驗證纖維化相關(guān)mRNA的表達。qRTPCR結(jié)果顯示6個篩選的纖維化相關(guān)mRNA基因變化趨勢與與芯片結(jié)果高度一致，可用于進一步與差異LncRNA進行CNC生物信息學(xué)分析。

結(jié)果顯示，大量的差異LncRNA和纖維化相關(guān)的mRNA具有高度的相關(guān)性（相關(guān)系數(shù)≥0.995，F(xiàn)DR≤0.01），為一對多的關(guān)系，構(gòu)成復(fù)雜的共表達網(wǎng)絡(luò)，提示有大量LncRNA可能通過這些基因，參與了肺纖維化的調(diào)控。目前對lncRNA在肺纖維化中的研究較少，有部分研究揭示了lncRNA可能通過調(diào)控蛋白轉(zhuǎn)錄，阻斷微小RNA，調(diào)節(jié)炎癥因子如IL6的表達等多種機制發(fā)揮作用［18,25］。因此，我們進一步挑選3條共表達網(wǎng)絡(luò)中的LncRNA，通過qRT-PCR的驗證。結(jié)果顯示肺纖維化過程中NR_040597與AK085645的表達具有差異性，AK086961的表達不具有差異性。在我們構(gòu)建的CNC共表達網(wǎng)絡(luò)關(guān)系中，AK085645負調(diào)控CCL6、NDNF及CCL8；NR_040597負調(diào)控CCL8。CCL6、CCL8屬于趨化因子家族中的一員，多個研究表明它們可通過促進白細胞和間充質(zhì)組細胞的遷移，調(diào)節(jié)血管生成和血管重構(gòu)等多種機制參與肺纖維化及其他纖維增生紊亂疾病的進程［26-27］。NDNF屬于神經(jīng)元衍生的神經(jīng)營養(yǎng)因子，有研究表明其通過調(diào)節(jié)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)分化抑制腫瘤細胞的增殖、遷移與進展［28-29］。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)分化又是肺纖維化進展過程中的一個重要機制［30-31］。因此我們推測AK085645極有可能通過負調(diào)控CCL6、CCL8與NDNF的轉(zhuǎn)錄在肺纖維化中可能發(fā)揮著潛在作用，下一步我們將在后繼的功能和機制研究中進行驗證。

綜上所述，本研究采用基因芯片方法對小鼠體內(nèi)的博來霉素誘發(fā)肺纖維化模型和對照組中的mRNA及LncRNA表達進行系統(tǒng)、全面的篩選，建立肺纖維化中差異表達的mRNA/LncRNA表達譜，為后續(xù)研究提供重要數(shù)據(jù)。通過CNC共表達分析計算出肺纖維化相關(guān)mRNA與差異表達的LncRNA具有極其密切的共表達網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，構(gòu)建出高度相關(guān)的mRNA-LncRNA關(guān)系對，將為進一步研究lncRNA在肺纖維化發(fā)生發(fā)展中的作用提供實驗基礎(chǔ)。