口腔黏膜拭子法可用于無創(chuàng)檢測線粒體tRNAThr15927G＞A突變

唐志寧，唐霄雯，薛 凌，管敏鑫

溫州醫(yī)科大學(xué)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院（生命科學(xué)學(xué)院）//Attardi線粒體生物醫(yī)學(xué)研究院，浙江 溫州 325035

線粒體是哺乳動物除細(xì)胞核外唯一能產(chǎn)生DNA（mtDNA）的細(xì)胞器［1］。mtDNA共包含37個(gè)基因，其中13個(gè)基因編碼蛋白，22個(gè)基因編碼線粒體中的轉(zhuǎn)運(yùn)RNA（tRNA），2個(gè)基因編碼核糖體RNA（rRNA，12S rRNA和16S rRNA）［2］。線粒體基因組的遺傳缺陷可能會對患者造成特別嚴(yán)重的破壞，此外，近年來人們對人類線粒體疾病的關(guān)注顯著增加。線粒體DNA在大多數(shù)真核生物中是母系遺傳的［3］，突變的mtDNA是通過母親卵子細(xì)胞質(zhì)的線粒體傳遞給子女，卵母細(xì)胞中的mtDNA突變可傳給后代，并導(dǎo)致嚴(yán)重疾病，而父親通過精子細(xì)胞質(zhì)的線粒體把突變的mtDNA傳給子女的情況十分罕見［4］。

線粒體tRNA在線粒體行使正常功能中起著重要作用。線粒體tRNA突變會造成線粒體功能紊亂、產(chǎn)能下降、活性氧類物質(zhì)增加以及誘導(dǎo)激活線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑［5-11］，從而引發(fā)母系遺傳性線粒體疾病。全球數(shù)據(jù)表明，線粒體疾病患者的最低出生率為0.2‰，這給許多國家、社會、家庭和個(gè)人帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。而其中80%患者的發(fā)病原因是由于mtDNA突變［12］。在中國人群家系中線粒體tRNAThr15927G＞A突變（以下簡稱為m.15927G＞A）與母系遺傳性原發(fā)性高血壓、耳聾和Leber遺傳性視神經(jīng)病等緊密相關(guān)［13-15］，說明m.15927G＞A突變有重要的臨床意義。因此檢測mtDNA突變在診斷、治療線粒體疾病中扮演著至關(guān)重要的角色。目前，國內(nèi)外有幾種母系遺傳性線粒體疾病基因診斷方法，包括：直接測序法、熒光定量PCR檢測法和基因芯片檢測法等。但由于費(fèi)時(shí)費(fèi)力、操作繁瑣及檢測費(fèi)用高而不易在臨床進(jìn)行推廣。因此臨床上急需尋找一種快速、靈敏、準(zhǔn)確、低價(jià)的診斷母系遺傳性線粒體疾病的檢測方法。外周血含有大量的DNA可用來檢測線粒體突變，然而血樣采集存在以下幾個(gè)問題：（1）創(chuàng)傷較大；（2）有感染風(fēng)險(xiǎn)；（3）操作要求較高；（4）患者疼痛感較強(qiáng)。相較而言，口腔黏膜拭子法具有無創(chuàng)、安全、易操作等臨床優(yōu)點(diǎn)。因此，本研究將探討口腔黏膜拭子法是否能夠檢測母系遺傳性m.15927G＞A突變以及它的臨床應(yīng)用可行性。

1 材料和方法

1.1 材料

對溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院2070例母系遺傳性線粒體疾病病例的血樣進(jìn)行線粒體全序突變篩查后，將篩選出的3個(gè)攜帶m.15927G＞A突變的病例（NT635，NT676，NT772）納入突變組，并根據(jù)相同單體型原則篩選出3個(gè)正常志愿者（CO41，CO42，CO52）納入對照組。根據(jù)溫州醫(yī)科大學(xué)倫理委員會規(guī)定管理的辦法，獲得兩組實(shí)驗(yàn)對象的血液樣本和口腔黏膜樣本及知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 致病評分系統(tǒng) 根據(jù)Yarham JW團(tuán)隊(duì)2011年更新的致病性線粒體tRNA突變評分系統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)對m.15927G＞A突變的致病性做出判斷［16］。

1.2.2 口腔拭子的獲取 取樣前1 h，禁煙、禁飲及禁食，從而減少食物或外源性因素對采樣過程的影響［17］。采樣前10 s，所有參與者清水漱口，用第1根口腔黏膜拭子對參與者右側(cè)臉頰部/右側(cè)上下牙床處刮拭取樣；第2根黏膜口腔拭子對參與者左側(cè)對應(yīng)位置處刮拭取樣；第3根口腔黏膜拭子再次對參與者右側(cè)對應(yīng)位置處刮拭取樣。取樣完成將拭子在潔凈通風(fēng)處烘干后裝入密封干燥塑料袋中，樣本迅速送回實(shí)驗(yàn)室儲存于4℃。

1.2.3 DNA的提取 （1）手工法：在2 mL無菌EP管內(nèi)加入3 μL蛋白酶K和600 μL細(xì)胞裂解緩沖液，用消毒過的鑷子將口腔拭子上風(fēng)干的棉花撕脫后置入上述EP管，并將EP管放入55℃恒溫水浴箱內(nèi)孵育90 min。孵育結(jié)束后，向EP管內(nèi)加入600 μL4℃預(yù)冷的醋酸鉀，充分顛倒混勻后靜置冰上10 min。靜置完成后，將混合物進(jìn)行離心（12 000 r/min，10 min），將離心后的上清液轉(zhuǎn)入裝有600 μL預(yù)冷異丙醇的1.5 mLEP管中，充分混勻后轉(zhuǎn)入-20℃冰箱沉淀30 min，隨后在常溫下離心（12000r/min，10min），棄上清液。加入600μL75%無水乙醇溶液，充分輕柔混勻后常溫離心（12 000 r/min，5 min），棄上清液后重復(fù)1次上述步驟。EP管放入65℃金屬浴40 min（管內(nèi)酒精揮發(fā)至無味），加入20 μL無菌去離子水充分混勻；（2）試劑盒法：用HiPure Tissue DNA Mini Kits（Magen）試劑盒提取血樣中的DNA；并使用QIA amp DNA Mini Kits（50）（QIAGEN）試劑盒提取口腔黏膜細(xì)胞DNA。

將以上DNA使用分光光度法測量260 nm和280 nm處的吸光度值來檢測其濃度及純度。

1.2.4 m.15927G＞A突變檢測 PCR使用內(nèi)、外引物進(jìn)行兩輪擴(kuò)增，克服了單次擴(kuò)增引起的平臺期效應(yīng)限制，PCR的敏感性和特異性也相應(yīng)增加［18］。以DNA為模版，使用兩對引物進(jìn)行巢式PCR。對產(chǎn)物進(jìn)行純化后送至測序公司，并將得到的結(jié)果與修訂的劍橋標(biāo)準(zhǔn)序列比對［19］，利用Codoncode Aligner進(jìn)行突變檢測（表1～2，圖1）。

表1 引物信息Tab.1 Primer information

表2 巢式PCR反應(yīng)體系Tab.2 Nested PCR reaction system

圖1 巢式PCRFig.1 Nested PCR.

1.2.5 斑點(diǎn)印跡雜交 斑點(diǎn)印跡雜交是將變性的DNA點(diǎn)在固體基質(zhì)膜上，用標(biāo)記的特異性探針雜交，采用放射或非放射的方法檢測雜交強(qiáng)度。突變引起產(chǎn)物能否與探針進(jìn)行結(jié)合，從產(chǎn)生的陽性或陰性反應(yīng)結(jié)果即可判斷是否發(fā)生突變，此法具有穩(wěn)健及結(jié)果可見性的優(yōu)點(diǎn)［20］。在尼龍膜（Roche）上加入DNA，用特異非放射性地高辛（DIG）標(biāo)記的寡脫氧核苷酸5'-CCTTGGAAAAAGGT TTTCATCTCC-3'探針（生工生物工程（上海）股份有限公司）檢測tRNAThr15927G＞A突變。膜在55℃下與加入探針的DIG Easy Hyb雜交液（Roche）雜交16 h后，室溫下將膜在2×SSC，0.1% SDS（Ambion）中洗滌2次，5 min/次；然后在37℃下將膜放入0.5×SSC，0.1% SDS（Ambion）中洗滌2次，15 min/次。用DIG Wash和Block緩沖（Roche）液、抗DIG堿性磷酸酶（Roche）和CDP-Star（Roche）檢測DIG標(biāo)記的探針［21-22］。

1.2.6 Southern blot取50 ng上述PCR產(chǎn)物在10%聚丙烯酰胺膠內(nèi)進(jìn)行電泳，結(jié)束后將膠上的PCR產(chǎn)物通過電轉(zhuǎn)至尼龍膜（Roche）上。膜與地高辛標(biāo)記的探針進(jìn)行雜交后即可檢測，方法同上。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用Graph Pad Prism 5軟件和SPSS22.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。P＜0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 m.15927G＞A突變的致病性評分

根據(jù)致病評分系統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)，m.15927G＞A突變的最終評分為13（表3）。

表3 m.15927G＞A致病評分系統(tǒng)Tab.3 m.15927G＞A pathogenic scoring system

2.2 DNA濃度及純度分析

從口腔黏膜樣本和血液樣本中提取的DNA濃度和純度均服從正態(tài)分布。我們發(fā)現(xiàn)口腔黏膜樣本DNA和血液樣本DNA之間的DNA濃度沒有顯著性差異（P＞0.05，表4），而手工法提取的口腔黏膜DNA的純度要顯著低于試劑盒提取的口腔黏膜DNA和全血DNA（P＜0.05，表4）。口腔黏膜DNA產(chǎn)量與血液DNA產(chǎn)量相似。

表4 DNA濃度和純度分析Tab.4 DNA concentration and purity analysis(n=6)

2.3 m.15927G＞A突變的DNA測序分析

對口腔黏膜樣本進(jìn)行擴(kuò)增、測序，結(jié)果顯示對照組（CO41、CO42、CO52）線粒體15927位點(diǎn)上為鳥嘌呤（G，圖2），突變組（NT653、NT676、NT772）為腺嘌呤（A，圖2）。

圖2 口腔黏膜樣本DNA測序峰圖Fig.2 Sanger sequencing of PCR products amplified from genomic DNA extracted from buccal swabs.

2.4 m.15927G＞A突變的斑點(diǎn)印跡雜交與Southern blot印跡雜交分析

斑點(diǎn)印跡雜交與Southern blot印跡雜交分析結(jié)果顯示，對照組（CO41、CO42、CO52）口腔黏膜DNA和血液DNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物能與特異非放射性DIG標(biāo)記的探針結(jié)合，檢測到探針信號而呈陽性反應(yīng)；突變組（NT635、NT676、NT772）口腔黏膜DNA和血液DNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物因?yàn)閱螇A基突變不能與探針結(jié)合而呈陰性反應(yīng)（圖3）。此外，手工法提取的口腔黏膜DNA1、試劑盒法提取的口腔黏膜DNA2和試劑盒法提取的血液DNA3擴(kuò)增得到的3種PCR產(chǎn)物之間不存在顯著差異（P＞0.05）。

圖3 口腔黏膜樣本和血液樣本的斑點(diǎn)印跡雜交和Southern blot印跡雜交分析Fig.3 Dot blot hybridization and Southern blot hybridization analysis of buccal swab samples and blood samples.A:Dot blot hybridization analysis;B:Southern Blot hybridization analysis.DNA1:DNA extracted manually from buccal swab samples;DNA2:DNA extracted from buccal swab samples using QIA amp DNA Mini Kits;DNA3:DNA extracted from blood samples using HiPure Tissue DNA Mini Kits.

3 討論

線粒體蘇氨酸t(yī)RNA（tRNAThr）由線粒體基因組編碼，負(fù)責(zé)翻譯線粒體中所有蘇氨酸密碼子，對于線粒體結(jié)構(gòu)、功能與穩(wěn)態(tài)具有重要意義。線粒體15927位點(diǎn)位于tRNAThr反密碼子莖環(huán)上第42位，該突變破壞了tRNAThr反密碼子莖環(huán)上高保守堿基對（28 C～42 G），從而改變tRNA的結(jié)構(gòu)和功能［11,23-24］。在中國人群家系中線粒體m.15927G＞A突變與母系遺傳性原發(fā)性高血壓、耳聾和Leber遺傳性視神經(jīng)病等緊密相關(guān)［13-15］。本研究發(fā)現(xiàn)m.15927G＞A突變致病評分為13，說明此突變具有致病性。因此，準(zhǔn)確、高效地檢測m.15927G＞A突變具有重要的臨床意義。

目前，國內(nèi)除了采用外周血DNA來檢測母系遺傳性線粒體疾病中的mtDNA突變外，尚未有其他檢測方法得到報(bào)道。外周血采集帶有創(chuàng)傷性并伴有疼痛感，樣本運(yùn)輸耗費(fèi)大量人力與物力，且現(xiàn)有相關(guān)診斷方法不易在臨床上進(jìn)行推廣。因此，臨床上急需一種快速、靈敏、準(zhǔn)確、低價(jià)的基因檢測方法來滿足檢測、篩查mtDNA突變的需求。含有細(xì)胞核的樣本均可能得到DNA，包括血液、唾液、毛囊及口腔黏膜細(xì)胞等［16,25-28］。有研究發(fā)現(xiàn)，從口腔黏膜細(xì)胞中提取DNA的方法具有簡單快速、廉價(jià)無創(chuàng)的特點(diǎn)［29］，能極大減少患者負(fù)擔(dān)［30］。目前的醫(yī)學(xué)研究可從口腔黏膜拭子、口腔細(xì)胞刷、唾液以及漱口法來獲取口腔黏膜細(xì)胞。其中漱口法的DNA產(chǎn)量相對較高，但樣本處理過程相對復(fù)雜，而口腔黏膜拭子法憑借采樣和處理簡易的優(yōu)點(diǎn)被運(yùn)用于許多遺傳研究領(lǐng)域［31-32］。口腔黏膜拭子法是一種簡便無創(chuàng)、無需消毒且所需成本低的采樣技術(shù)，不需要針頭采樣或皮膚活檢，采集過程也無需訓(xùn)練有素的技術(shù)人員，這對于不易抽血的嬰幼兒、老弱病殘或精神病人等尤為重要?？谇火つな米臃ㄊ欠窨梢源嫜獦觼頇z測突變，關(guān)鍵在于DNA的產(chǎn)量和純度以及樣本在運(yùn)送過程中的穩(wěn)定性。有研究發(fā)現(xiàn)，無論是保存在室溫還是-20℃的口腔黏膜拭子，其提取的DNA產(chǎn)量在拭子保存7 d或90 d時(shí)并無明顯差異；口腔黏膜拭子在保存90 d后提取DNA的量會有所減少，但并不影響突變的檢出；收集的樣本在常規(guī)郵寄裝運(yùn)后仍產(chǎn)生可用的DNA［33-34］。本研究發(fā)現(xiàn)，在DNA濃度上，口腔黏膜DNA與血液DNA無顯著差異；在純度上，試劑盒法提取的口腔黏膜DNA與試劑盒法提取的血液DNA無顯著差異，而手工法提取的口腔黏膜DNA顯著低于前二者。通過斑點(diǎn)印跡雜交、Southern blot印跡雜交和DNA測序分析發(fā)現(xiàn)，口腔黏膜DNA同樣可以準(zhǔn)確檢測到m.15927G＞A突變，具有臨床應(yīng)用的可行性。運(yùn)用口腔黏膜拭子法，從采樣到m.15927G＞A突變的檢出僅需1～2 d，具有出報(bào)告快、周期短的優(yōu)勢，其臨床應(yīng)用前景廣泛。當(dāng)然，不同參與者或不同采集手法會導(dǎo)致口腔拭子中提取的DNA在產(chǎn)量、質(zhì)量及完整性上具有差異，但可以通過方法的標(biāo)準(zhǔn)化來避免此缺陷［35］。

綜上所述，口腔黏膜拭子可以代替血液成為m.15927G＞A突變檢測的另一來源。口腔黏膜拭子法是一種操作簡易的診斷母系遺傳性線粒體疾病的無創(chuàng)檢測方法，具有較高的臨床應(yīng)用價(jià)值。