施林勇,李 宏,辜俊偉,宋 憧,李俊杰,陳 磊,周 強,漆松濤,陸云濤
南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院神經(jīng)外科,廣東 廣州 510515
膠質(zhì)母細胞瘤(GBM)作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的原發(fā)性惡性腫瘤[1-2],患者預(yù)后極差,其總體生存期為14.6月,5年生存率僅為5%[1]。目前GBM的標(biāo)準(zhǔn)治療方案主要采用手術(shù)切除,術(shù)后放療聯(lián)合替莫唑胺(TMZ)輔助化療(Stupp方案)[2]的綜合治療方式。盡管對GBM患者采取了最佳治療,但絕大多數(shù)患者在用藥一年內(nèi)出現(xiàn)耐藥,極大影響治療效果[3-4]。因此,TMZ耐藥已成為改善GBM療效的重要難題。建立膠質(zhì)瘤TMZ耐藥動物模型為研究膠質(zhì)瘤細胞TMZ耐藥機制提供重要工具,對于闡述膠質(zhì)瘤細胞TMZ耐藥的體內(nèi)外分子機制,從而提高膠質(zhì)瘤綜合治療的敏感性,改善患者總體生存時間具有重要意義。
目前國內(nèi)外誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細胞TMZ耐藥株多采用體外適度遞增藥物濃度逐步誘導(dǎo),但卻存在誘導(dǎo)時間長、與體內(nèi)耐藥差異較大,耐藥性難以長期維持等缺點。曲樂等[5]通過皮下成瘤裸鼠體內(nèi)連續(xù)傳代技術(shù)成功建立舒尼替尼耐藥腎癌細胞系,解決了腎癌體外耐藥細胞系的類似問題。國外Kitange等[6]為避免體外耐藥株因長期培養(yǎng)造成與遺傳背景不符,嘗試使用患者膠質(zhì)瘤標(biāo)本對裸鼠行顱內(nèi)原位成瘤,并通過體內(nèi)連續(xù)傳代技術(shù)持續(xù)大劑量TMZ誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細胞耐藥。盡管上述耐藥模型構(gòu)建方法十分成熟,但因荷瘤載體免疫功能缺陷而無法反應(yīng)膠質(zhì)瘤與機體免疫微環(huán)境之間相互關(guān)系,并不能滿足腫瘤免疫與腫瘤微環(huán)境相關(guān)的耐藥機制研究。因此,本研究采用C57BL/6小鼠原位膠質(zhì)瘤模型,通過體內(nèi)逐代適度遞增藥物劑量刺激小鼠原位腫瘤產(chǎn)生TMZ耐藥,從而構(gòu)建出小鼠膠質(zhì)瘤TMZ耐藥模型。利用已產(chǎn)生耐藥的細胞可繼續(xù)用于接種小鼠,使用大劑量TMZ可長期維持其耐藥性。此模型可準(zhǔn)確還原膠質(zhì)瘤細胞在體內(nèi)產(chǎn)生TMZ耐藥的過程,對于闡明膠質(zhì)瘤TMZ耐藥的分子機制具有重要作用,從而為膠質(zhì)瘤化療、預(yù)測提供新的靶點。
小鼠膠質(zhì)瘤GL261細胞系購于美國ATCC細胞庫,常規(guī)使用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基,分選后得到的小鼠膠質(zhì)瘤細胞含10%胎牛血清的DMEM/F12高糖培養(yǎng)基,鋪于培養(yǎng)皿中,置于37℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞生長超過80%時傳代。
取生長良好的GL261細胞,棄去原培養(yǎng)基,PBS漂洗2次。用胰蛋白酶(0.25%,含EDTA)約1 mL消化細胞,DMEM完全培養(yǎng)基終止消化后離心去除上清,加入PBS重懸洗滌細胞,計數(shù)后離心,再加入適量PBS重懸以調(diào)整細胞濃度,放于冰磚中備用。小鼠用1%戊巴比妥鈉按50 mg/kg腹腔注射,待小鼠麻醉后剃去頭頂毛發(fā),通過耳桿和上齒固定板固定于立體定向儀上,消毒鋪巾后切開頭頂皮膚,暴露前囟,取其后方3 mm,左側(cè)距中線2 mm處鉆孔。使用10 μL微量進樣器吸取5 μL細胞懸液(含5×105細胞)固定于立體定向儀且對準(zhǔn)鉆孔處,緩慢垂直進針3 mm,退針0.5 mm,緩慢注入細胞懸液,每注射1 μL暫停1 min。注射完畢后暫停3 min再緩慢拔針,以骨蠟封閉骨窗,逐層縫合關(guān)顱。
購買成年C57BL/6小鼠78只于動物房繼續(xù)飼養(yǎng)1周。隨機將小鼠分為6組(13只/組):誘導(dǎo)組共3組(小劑量、中劑量和大劑量誘導(dǎo)組),對照組共3組(不給藥組、中劑量和大劑量對照組)。每組中5只磁共振評估腫瘤大小,5只觀察小鼠生存,3只取腫瘤行原代培養(yǎng)。培養(yǎng)GL261膠質(zhì)瘤細胞系對誘導(dǎo)組1和對照1、2、3組小鼠進行原位成瘤。成瘤7 d后對誘導(dǎo)組1使用小劑量TMZ(5 mg/kg)誘導(dǎo)5d后停藥10 d(圖1A),再將誘導(dǎo)組1小鼠取瘤制備單細胞懸液,經(jīng)流式分選得到膠質(zhì)瘤細胞后繼續(xù)培養(yǎng),用于接種誘導(dǎo)組2。接種7 d后給予中劑量TMZ(25 mg/kg)處理誘導(dǎo)組2荷瘤鼠,同法取瘤、分選、培養(yǎng)并接種于誘導(dǎo)組3,大劑量TMZ(50 mg/kg)處理誘導(dǎo)組3荷瘤鼠(圖1B)。通過體內(nèi)傳代法逐代適度遞增藥物劑量誘導(dǎo)耐藥,建立小鼠膠質(zhì)瘤TMZ耐藥模型。對照組1使用不含TMZ的溶劑對照處理,對照組2、3分別給予中、大劑量(25、50 mg/kg)TMZ。本研究涉及使用實驗動物,經(jīng)醫(yī)院實驗動物管理與動物福利倫理委員會審批,認(rèn)為符合要求。
圖1 膠質(zhì)瘤小鼠誘導(dǎo)TMZ耐藥示意圖Fig.1 Schematic diagram of induction of TMZ resistance of glioma in the mice.A:Timeline of induction of TMZ resistance in glioma mice.B:Inducted of TMZ resistance in glioma-bearingmice.
通過腹腔注射過量1%戊巴比妥鈉溶液處死動物,75%酒精中浸泡10 min,鈍性分離獲取移植瘤標(biāo)本。使用眼科剪修剪標(biāo)本后足量PBS溶液清洗組織塊數(shù)次,加入少量DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基濕潤組織塊,用細針頭反復(fù)碾磨,直至磨成1 mm3碎塊。加入少許Ⅰ型、Ⅳ型膠原酶混合消化液后,37℃消化20~25 min。加入約2倍體積的DMEM完全培養(yǎng)基終止消化。經(jīng)200目過濾網(wǎng)過濾,離心收集細胞,少量DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基重懸細胞后加入3倍體積的紅細胞裂解液,溫和并充分翻轉(zhuǎn)離心管混勻,靜置5 min。再經(jīng)400目過濾網(wǎng)過濾,離心去除上清,使用DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基離心洗滌3次,緩沖液重懸。細胞計數(shù)后,根據(jù)細胞量,每1×106細胞給予1μL抗小鼠CD16/32阻斷抗體,4℃孵育10 min。封閉成功后每1×106細胞加入1 μL的小鼠GFAP-Alexa Fluor?488抗體4℃孵育10 min。采用流式細胞儀分選出小鼠膠質(zhì)瘤細胞,得到的小鼠膠質(zhì)瘤細胞用DMEM/F12完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。
取生長狀態(tài)良好的GL261細胞與誘導(dǎo)組3的小鼠膠質(zhì)瘤細胞,棄去原培養(yǎng)基,PBS漂洗2次。用胰蛋白酶(0.25%,含EDTA)約1 mL消化細胞,DMEM完全培養(yǎng)基終止消化后離心去除上清,加入PBS重懸洗滌細胞,計數(shù)后離心,DMEM完全培養(yǎng)基稀釋制成適當(dāng)密度的細胞懸液,向96孔細胞培養(yǎng)板每小孔中加入100μL完全培養(yǎng)基約含2000個細胞,預(yù)留空白孔并設(shè)置6~8個復(fù)孔。待細胞貼壁24 h,不同濃度TMZ處理后,向待測小孔與空白孔加入100 μL完全培養(yǎng)基與10 μL CCK8試劑,,置于細胞培養(yǎng)箱中孵育2 h,采用多功能酶標(biāo)儀檢查待測孔450 nm吸光度值(A450nm),并繪制細胞增值曲線,每組重復(fù)檢測3次。
取生長良好的的小鼠膠質(zhì)瘤細胞,棄原培養(yǎng)基,PBS漂洗2次,0.25%胰蛋白酶消化,DMEM完全培養(yǎng)基重懸細胞備用。計數(shù)細胞后,梯度倍數(shù)稀釋后以每孔200個細胞的密度接種于六孔細胞培養(yǎng)板中,并加入2 mL培養(yǎng)液,混勻使細胞分散均勻。置培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)10~14 d,期間2~3 d換液并經(jīng)常觀察,當(dāng)六孔板中出現(xiàn)明顯可見的克隆時,終止培養(yǎng)。棄去原培養(yǎng)基,用PBS輕輕漂洗2次。加入4%多聚甲醛固定細胞10min,棄固定液加適量1%結(jié)晶紫染色。隨后用PBS緩緩洗去多余染料,置于室溫干燥。將六孔細胞培養(yǎng)板置于顯微鏡下計數(shù)細胞克隆數(shù),計算克隆形成率并繪制成圖。
應(yīng)用SPSS22.0進行數(shù)據(jù)分析,定量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,兩組之間比較采用獨立樣本t檢驗,多組間比較采用方差分析,生存資料比較采用Kaplan-Meier生存分析,檢驗水準(zhǔn)α=0.05。
取小鼠膠質(zhì)瘤組織制備單細胞懸液,使用抗小鼠GFAP-Alexa Fluor?488抗體行流式細胞術(shù)分選膠質(zhì)瘤細胞,陽性細胞率約占58.3%(圖2C)。分選前原代細胞(圖2A)培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)其形態(tài)各異,經(jīng)流式分選后細胞形態(tài)均一(圖2B),呈現(xiàn)胞體較小偏圓,偽足較多偏短的細胞形態(tài)。經(jīng)細胞免疫熒光證實,分選后細胞均為GFAP陽性膠質(zhì)瘤細胞(圖2D)。
圖2 小鼠移植瘤中GFAP+細胞流式分選及鑒定Fig.2 Flow cytometric sorting and identification of transplanted tumor GFAP+cells.A:Primary cells before flow cytometry(Original magnification:×200);B:Primary cells after flow cytometry(×200);C:Proportion of GFAP+cells by flow cytometry;D:GFAP immunofluorescence after flow cytometry(×200).
細胞集落法結(jié)果表明,對比中等劑量對照組和誘導(dǎo)組,小鼠膠質(zhì)瘤細胞集落相對率無明顯差異;而大劑量誘導(dǎo)組細胞集落相對率明顯高于大劑量對照組(P<0.05,圖3A),表明耐藥小鼠模型膠質(zhì)瘤細胞具有相對明顯的耐藥性。以TMZ的濃度為橫坐標(biāo),腫瘤細胞存活率為縱坐標(biāo),繪制劑量-存活率曲線(圖3B),算出半數(shù)抑制濃度(IC50),未給藥對照組腫瘤細胞IC值為894 μmol/L,大劑量誘導(dǎo)給藥組腫瘤細胞IC值為3799 μmol/L,經(jīng)過5月建立的耐藥小鼠膠質(zhì)瘤細胞耐藥指數(shù)(RI)約4.25,即對TMZ產(chǎn)生了4.25倍的耐藥性。
磁共振觀察誘導(dǎo)耐藥后小鼠的成瘤情況。使用RadiAnt DICOM軟件計算腫瘤體積[(長徑×短徑×層數(shù)×層厚)/2]。大劑量對照組(35.16±3.22 mm3)(圖4A)與未給藥對照組(44.45±3.17 mm3)(圖4B)相比較提示,大劑量TMZ治療能明顯縮小小鼠膠質(zhì)瘤體積(P<0.05),而大劑量誘導(dǎo)組小鼠膠質(zhì)瘤體積(60.16±2.84 mm3)(圖4C)大于大劑量對照組小鼠原位膠質(zhì)瘤體積(P<0.001,圖4D),膠質(zhì)瘤細胞因產(chǎn)生耐藥導(dǎo)致腫瘤體積無明顯減小。
圖4 耐藥動物與正常動物成瘤大小比較Fig.4 Comparison of tumor volume between drug-resistant and control mice.A:Control group without TMZ treatment.B:Control group with high-dose TMZ treatment.C:Inducted group with high-dose TMZ treatment.D:Comparison of tumor volume among different groups;**P<0.01vscontrol group,***P<0.001.
以小鼠出現(xiàn)偏癱、癲癇、弓背、活動明顯減少為生存終點[7],繪制Kaplan-Meier生存曲線(圖5),結(jié)果顯示不同處理組荷瘤鼠平均生存期具有顯著差異(P<0.001)。對不同處理組荷瘤鼠生存時間進行兩兩比較,結(jié)果顯示,與大劑量對照組相比,大劑量誘導(dǎo)組荷瘤鼠生存期明顯縮短(P=0.0018)。與中等劑量對照組比較提示,中等劑量誘導(dǎo)組荷瘤鼠生存期較短,但無統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.1676)。
圖5 耐藥動物與正常用藥動物生存比較Fig.5 Survival of the mice bearing drug-resistant glioma and control mice,**P<0.01.
膠質(zhì)母細胞瘤是顱內(nèi)最常見最具侵襲性的中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤[8]。目前以替莫唑胺(TMZ)為基礎(chǔ)的輔助和同步放化療方案是臨床治療GBM的標(biāo)準(zhǔn)治療方案,但近年來大量與GBM綜合治療相關(guān)的臨床試驗均提示GBM表現(xiàn)出強烈的TMZ耐藥,嚴(yán)重地制約其療效[4]。因此闡明GBM細胞耐藥機制,將對新藥的開發(fā)、優(yōu)化臨床化療方案及改善患者生存狀態(tài)等具有重大意義,而建立膠質(zhì)瘤TMZ耐藥動物模型并研究其生物學(xué)性質(zhì)為這類研究提供了重要的實驗工具和基礎(chǔ)。
與大多數(shù)腫瘤一樣[9-11],目前構(gòu)建人腦膠質(zhì)瘤TMZ耐藥細胞株(如:U87MG、U251、SKMG-1等)[12-14]大多采用體外適度遞增藥物濃度進行刺激誘導(dǎo)。體外構(gòu)建的膠質(zhì)瘤TMZ耐藥細胞系耗時較長,且難以長期維持其耐藥性。另外其雖能在體外表現(xiàn)出對TMZ耐藥的部分表型,但是膠質(zhì)瘤細胞產(chǎn)生TMZ耐藥的過程中包含腫瘤微環(huán)境[15-17]、免疫應(yīng)答[18-20]及腸道菌群[21-22]等體內(nèi)因素,因此體外誘導(dǎo)耐藥細胞系與體內(nèi)耐藥過程相差較大。通過建立膠質(zhì)瘤TMZ耐藥動物模型,能更好地模擬膠質(zhì)瘤細胞在體內(nèi)產(chǎn)生TMZ耐藥的過程。國內(nèi)外通過TMZ誘導(dǎo)建立的膠質(zhì)瘤耐藥動物模型較少,國外Kitange等[6]使用短期培養(yǎng)的患者膠質(zhì)瘤細胞對裸鼠行顱內(nèi)原位成瘤,并通過體內(nèi)連續(xù)傳代技術(shù)持續(xù)大劑量TMZ誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細胞耐藥。此種模型采用免疫剝奪的裸鼠,并未綜合考慮到GBM產(chǎn)生TMZ耐藥的過程中免疫應(yīng)答的調(diào)控。張健等[23]通過體外誘導(dǎo)C6細胞系TMZ耐藥,再接種至大鼠顱內(nèi)構(gòu)建出大鼠膠質(zhì)瘤耐藥模型。此模型雖采用具有免疫功能的大鼠,但腫瘤細胞在體外產(chǎn)生耐藥過程中并無免疫應(yīng)答、腸道菌群等綜合因素的參與。且另有研究表明,GL261膠質(zhì)瘤細胞C57BL/6小鼠模型在組織病理學(xué)上更接近人腦膠質(zhì)瘤,而且具有穩(wěn)定,成瘤率高,周期短,可重復(fù)性好的優(yōu)點[24-25],所以上述模型仍具有一定局限性。
為解決上述問題,筆者通過原位成瘤小鼠逐代遞增藥物劑量誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細胞耐藥,構(gòu)建出C57BL/6小鼠膠質(zhì)瘤TMZ耐藥模型。結(jié)果顯示模型小鼠較未給藥對照組產(chǎn)生了約4.25倍耐藥性,較給藥對照組腫瘤細胞可形成約1.5倍的細胞集落,經(jīng)治療后因腫瘤耐藥致體積無明顯減小且生存時間更短。由此說明本文構(gòu)建的小鼠膠質(zhì)瘤TMZ耐藥模型具有穩(wěn)定的耐藥性。與體外分步誘導(dǎo)法相比,本模型耗時更短,且耐藥膠質(zhì)瘤細胞可繼續(xù)接種C57BL/6小鼠,大劑量TMZ可長期維持其耐藥性。張健等[23]誘導(dǎo)的大鼠耐藥模型結(jié)果顯示耐藥大鼠腫瘤體積與生存與正常組無顯著差異,本模型小鼠腫瘤體積與生存的明顯差異說明體內(nèi)連續(xù)傳代法構(gòu)建耐藥小鼠更能準(zhǔn)確反應(yīng)體內(nèi)膠質(zhì)瘤細胞產(chǎn)生TMZ耐藥的過程。因此本研究構(gòu)建出的C57BL/6小鼠膠質(zhì)瘤TMZ耐藥模型更符合膠質(zhì)瘤細胞產(chǎn)生TMZ耐藥的病理生理過程,也能夠作為臨床前模型更為穩(wěn)定地模擬臨床GBM患者發(fā)生TMZ耐藥。而且通過基因工程改造模型小鼠,使小鼠誘發(fā)顱內(nèi)腫瘤后,采用體內(nèi)連續(xù)傳代技術(shù)能更好地觀察腫瘤的發(fā)生發(fā)展與耐藥的產(chǎn)生,為闡明膠質(zhì)瘤TMZ耐藥的分子機制提供了重要的實驗工具。
制定有效的治療方案現(xiàn)成為改善膠質(zhì)瘤療效的主要挑戰(zhàn)[26-27],而構(gòu)建出可以模擬臨床膠質(zhì)瘤耐藥的可靠穩(wěn)定的臨床前模型對于研究分子靶向藥物至關(guān)重要[28-29]。在朝著個性化醫(yī)學(xué)發(fā)展的過程中,通過可靠穩(wěn)定的臨床前模型模擬患者在治療之前,期間和之后以及采用不同治療組合的療效反應(yīng),將更好地了解應(yīng)在每個時間點何時和采用何種療法以誘導(dǎo)腫瘤死亡。盡管細胞培養(yǎng)模型對于癌癥治療的研究很有價值,但是在臨床環(huán)境中,這些模型不能完全準(zhǔn)確地預(yù)測腫瘤對細胞毒性藥物或其他生物制劑的反應(yīng)[30]。在此模型的基礎(chǔ)上,后續(xù)我們將詳細探討小鼠耐藥模型的耐藥機制,通過基因工程改造小鼠使該模型成為多種神經(jīng)腫瘤學(xué)研究的寶貴工具。