新城疫病毒通過(guò)影響細(xì)胞微絲骨架對(duì)宮頸癌HeLa細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的抑制作用

金燕，王靜，龐淼，張曉雪，劉開(kāi)揚(yáng)

宮頸癌是許多發(fā)展中國(guó)家的女性患癌死亡的常見(jiàn)原因，也是全球女性中最常見(jiàn)的惡性腫瘤［1］。溶瘤病毒（oncology virus，OVs）療法是一種相對(duì)安全有效的治療方法，可以在惡性腫瘤細(xì)胞中選擇性復(fù)制而不損害正常細(xì)胞［2］。新城疫病毒（newcastle disease virus，NDV）則是天然溶瘤病毒的成員之一，屬于Avulavirus屬，副黏病毒科，可以用于癌癥的治療［3］。細(xì)胞骨架是維持真核細(xì)胞基本形態(tài)的重要結(jié)構(gòu)，可承受細(xì)胞外界壓力以及保持細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)的有序性［4］。NDV在腫瘤細(xì)胞中識(shí)別、感染、釋放等過(guò)程均會(huì)對(duì)細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)造成損傷［5］。研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞骨架重塑可導(dǎo)致微絲及中間絲迅速解聚，使微管結(jié)構(gòu)重組，形成凋亡微管網(wǎng)，凋亡微管網(wǎng)與微絲共同包裹細(xì)胞器進(jìn)而形成凋亡小體［6-7］。NDV是否以細(xì)胞微絲骨架為靶點(diǎn)，通過(guò)各種途徑影響細(xì)胞的增殖、遷移與侵襲尚不明確。為此，本實(shí)驗(yàn)用NDV F3株感染宮頸癌HeLa細(xì)胞，探究NDV抗腫瘤與細(xì)胞微絲骨架的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料宮頸癌HeLa細(xì)胞及NDV F3株由生命科學(xué)中心P2實(shí)驗(yàn)室保存。DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基、胰酶及細(xì)胞松弛素D（Cytochalasin D）購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；胎牛血清購(gòu)自上海ExCellBio公司；CCK-8試劑盒購(gòu)自日本同仁公司；Matrigel膠購(gòu)自美國(guó)BD公司；GAPDH抗體購(gòu)自武漢ABclonal公司；RhoA、Rho激酶（ROCK）2、F-肌動(dòng)蛋白（F-actin）抗體及辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗購(gòu)自北京博奧森公司；Transwell3422購(gòu)自美國(guó)康寧公司；TUNEL凋亡檢測(cè)試劑盒和Hoechst33258購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；考馬斯亮藍(lán)-R250購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 HeLa細(xì)胞培養(yǎng)用含10%胎牛血清和1%雙抗（青霉素和鏈霉素）的MEM培養(yǎng)基在37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2、飽和溫度條件下常規(guī)培養(yǎng)。NDV F3原液感染復(fù)數(shù)（multiplicity of infection，MOI）為100，用DMEM無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋NDV F3，MOI分別為10、1、0.1、0.01、0.001。用NDV F3（終濃度MOI=0.1）分別作用細(xì)胞12、24和36 h，然后普通倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)改變。

1.2.2 HeLa細(xì)胞微絲骨架染色考馬斯亮藍(lán)染色用于骨架形態(tài)及完整性研究，TritonX-100可以溶解脂膜大部分非骨架蛋白，細(xì)胞骨架系統(tǒng)的蛋白不被溶解，考馬斯亮藍(lán)染液進(jìn)行染色，即可顯示骨架結(jié)構(gòu)。選取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的HeLa細(xì)胞，消化為細(xì)胞懸液，接種于6孔板中爬片，CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞融合至30%。每孔加1%Tritonx-100并沒(méi)過(guò)玻片，37℃靜置18 min，用M緩沖液洗3次，每次3 min；用戊二醛固定20 min，PBS洗3次；考馬斯亮藍(lán)R-250染液染色30 min，PBS洗3次。設(shè)置對(duì)照組；病毒組為NDV F3（終濃度MOI=0.1）作用24 h；Cytochalasin D組為5 mmol/L Cytochalasin D作用24 h。以上實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，倒置顯微鏡下觀察NDV F3感染細(xì)胞后的形態(tài)變化及微絲骨架結(jié)構(gòu)變化并攝片。

1.2.3 CCK-8法檢測(cè)HeLa細(xì)胞的增殖情況選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HeLa細(xì)胞，胰蛋白酶消化為細(xì)胞懸液，接種于96孔板中，CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞融合至70%～80%。細(xì)胞培養(yǎng)至12、24、36、48、60和72 h后每孔各加入10μL CCK-8，CO2培養(yǎng)箱中孵育4 h。酶標(biāo)儀于450 nm波長(zhǎng)下測(cè)定各孔光密度（OD）值。設(shè)置對(duì)照組；病毒組MOI分別為1、0.1、0.01、0.01、0.001的NDV F3。增殖率（%）=OD實(shí)驗(yàn)組/OD對(duì)照組×100%。以上實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.2.4 Hoechst33258染色檢測(cè)HeLa細(xì)胞凋亡情況選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HeLa細(xì)胞，胰酶消化為細(xì)胞懸液，接種于6孔板中爬片，CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細(xì)胞融合至70%～80%。培養(yǎng)24 h后用4%多聚甲醛固定15 min，PBS洗3次，每次3 min。加入Hoechst33258染液染色8 min，PBS洗3洗，每次3 min?？篃晒獯銣绶馄瑒┓馄瑹晒怙@微鏡攝片。設(shè)置對(duì)照組；病毒組為NDV F3（終濃度MOI為0.1、0.01）作用24 h。以上實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.2.5 TUNEL檢測(cè)細(xì)胞凋亡將細(xì)胞接種于24孔板中，CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細(xì)胞融合至70%～80%。用4%多聚甲醛固定30 min，0.3%Triton X-100室溫孵育30 min，然后0.3%H2O2室溫孵育20 min。根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)配置生物素標(biāo)記液，每孔50μL生物素標(biāo)記液37℃避光孵育60 min，然后每孔加200μL標(biāo)記反應(yīng)終止液室溫孵育10 min。配置Streptavidin-HRP工作液及DAB顯色液，每孔加50μL Streptavidin-HRP工作液室溫孵育30 min，然后每孔加200μL DAB顯色液室溫孵育15 min，PBS洗3次。顯微鏡下觀察攝片。設(shè)置對(duì)照組；病毒組為NDV F3（終濃度MOI為0.1、0.01）作用24 h。以上實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.2.6 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HeLa細(xì)胞遷移能力選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HeLa細(xì)胞，胰蛋白酶消化為細(xì)胞懸液，接種于6孔板中，CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞融合至90%。用10μL移液器在每孔中各劃3條水平的直線，PBS洗去劃掉的漂浮細(xì)胞，在劃痕0、24、48 h后倒置顯微鏡下觀察攝片并測(cè)量劃痕寬度。設(shè)置對(duì)照組；病毒組為NDV F3（終濃度MOI=0.1）；Cytochalasin D組為5 mmol/L Cytochalasin D。細(xì)胞遷移率（%）=24 h或48 h劃痕寬度/0 h劃痕寬度×100%。以上實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.2.7 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HeLa細(xì)胞侵襲能力將Matrigel膠置于4℃冰箱中使其變?yōu)橐簯B(tài)，用無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基稀釋?zhuān)?∶3），每孔60μL Matrigel膠均勻地加入預(yù)冷的Transwell板，37℃放置1 h使其凝固；HeLa細(xì)胞先用無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基饑餓12 h，胰酶消化并離心，PBS洗3次，細(xì)胞計(jì)數(shù)為（1～5）×107個(gè)/L，每孔200μL細(xì)胞懸液接種于上室孔中，下室加入500μL DMEM完全培養(yǎng)基。置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；吸棄小室內(nèi)培養(yǎng)基，用棉簽將Matrigel膠輕輕擦拭，4%多聚甲醛固定20 min，PBS洗3次，0.1%結(jié)晶紫染色20 min，PBS洗3次；風(fēng)干，置于倒置顯微鏡下觀察攝片。設(shè)置對(duì)照組；病毒組為NDV F3（終濃度MOI=0.1）作用24 h；Cytochalasin D組為5 mmol/L Cytochalasin D作用24 h。以上實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.2.8 Western blot分析細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白F-actin、RhoA和ROCK2的表達(dá)收集NDV F3（終濃度MOI=0.1）作用時(shí)間分別為24、36和48 h的細(xì)胞及對(duì)照組的正常細(xì)胞，并提取蛋白。十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）后轉(zhuǎn)膜；5%脫脂奶粉室溫封閉1 h；一抗4℃室孵育過(guò)夜；二抗在室溫孵育2 h。GAPDH作為內(nèi)參。DAB顯色液顯色，AI600上機(jī)檢測(cè)條帶，用Image J分析并計(jì)算灰度值。以上實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均使用SPSS 26.0軟件進(jìn)行處理，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析和重復(fù)測(cè)量方差分析，組間多重比較用LSD-t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NDV F3對(duì)HeLa細(xì)胞形態(tài)的影響倒置顯微鏡下觀察，對(duì)照組HeLa細(xì)胞貼壁良好，形態(tài)正常，呈鋪路石狀，折光性佳；NDV F3感染12 h后，細(xì)胞失去正常形態(tài)，邊緣逐漸模糊，胞漿內(nèi)出現(xiàn)顆粒，部分細(xì)胞有融合現(xiàn)象；感染24 h后，細(xì)胞變圓并脫落，細(xì)胞破裂，并可見(jiàn)一些圓形空泡；感染36 h后，貼壁細(xì)胞剩余較少，大量細(xì)胞碎裂、懸浮，失去折光性。見(jiàn)圖1。

Fig.1 Observation of the morphology of HeLa cells infected by NDV under an ordinary inverted microscope(×100)圖1 普通倒置顯微鏡下觀察NDV感染HeLa細(xì)胞后形態(tài)（×100）

2.2 HeLa細(xì)胞微絲骨架染色NDV F3對(duì)細(xì)胞微絲骨架有極大的破壞作用。對(duì)照組的正常細(xì)胞微絲骨架無(wú)聚集且均勻排列，細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)正常。病毒感染后可引起細(xì)胞骨架重組，微絲骨架有聚合的現(xiàn)象，呈小團(tuán)塊聚集，形成網(wǎng)絡(luò)空洞狀態(tài)，并且細(xì)胞的邊界更加明顯。Cytochalasin D作用后，可見(jiàn)微絲骨架排列紊亂，聚集成團(tuán)，見(jiàn)圖2。

Fig.2 Observation of the microfilament skeleton of HeLa cells under an ordinary inverted microscope(Coomassie Brilliant Blue Staining,×200)圖2 普通倒置顯微鏡下觀察HeLa細(xì)胞微絲骨架（考馬斯亮藍(lán)染色，×200）

2.3 HeLa細(xì)胞的增殖情況CCK-8結(jié)果顯示，不同濃度的NDV F3對(duì)HeLa細(xì)胞增殖均有抑制作用，病毒濃度越大對(duì)細(xì)胞增殖作用抑制的越明顯（P＜0.05），在NDV F3終濃度為MOI=1和MOI=0.1時(shí)抑制效果較明顯；NDV F3作用不同時(shí)間之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

2.4 HeLa細(xì)胞凋亡情況Hoechst33258染色結(jié)果顯示，對(duì)照組細(xì)胞核形態(tài)及大小較均一，邊界完整清晰，熒光染色呈勻質(zhì)狀。與對(duì)照組相比，NDV F3感染后的HeLa細(xì)胞可見(jiàn)細(xì)胞核聚集固縮，部分細(xì)胞核呈碎塊狀，形成凋亡小體，為細(xì)胞凋亡的特征性改變。熒光染色呈高亮。見(jiàn)圖3。TUNEL檢測(cè)結(jié)果顯示，對(duì)照組的正常細(xì)胞未被DAB染成棕色，為陰性，NDV F3組細(xì)胞凝集成團(tuán)的部分與DAB結(jié)合顯示為棕色，細(xì)胞發(fā)生凋亡，并且MOI=0.1時(shí)凋亡發(fā)生結(jié)果更為顯著。見(jiàn)圖4。

2.5 HeLa細(xì)胞遷移能力細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示NFV F3對(duì)細(xì)胞的遷移能力有抑制作用。與對(duì)照組相比，NDV F3終濃度MOI=0.1作用24 h和48 h時(shí)對(duì)細(xì)胞遷移能力均有抑制作用，并且病毒作用48 h的抑制效果較24 h更加顯著。Cytochalasin D組與對(duì)照組相比也有明顯的抑制作用，隨著作用時(shí)間的增加，抑制效果更加顯著。見(jiàn)圖5、表2。

Tab.1 Effects of different groups and different duration time on the proliferation of HeLa cells表1 不同分組及不同作用時(shí)間對(duì)HeLa細(xì)胞增殖的影響

表2各組在劃痕24 h和48 h的遷移率比較Tab.2 The mobility of different groups at 24 h and 48 h after scratch

Fig.3 The effect of NDV F3 on HeLa cell apoptosis(Hoechst33258 Staining,×100)圖3 NDV F3對(duì)HeLa細(xì)胞凋亡的影響（Hoechst33258染色，×100）

Fig.4 NDV F3 induced apoptosis of HeLa cells(DAB Staining,×100)圖4 NDV F3誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞發(fā)生凋亡（DAB染色，×100）

2.6 HeLa細(xì)胞侵襲能力Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示NFV F3對(duì)細(xì)胞的侵襲能力有抑制作用。與對(duì)照組［（548.333±26.951）個(gè)/視 野］相 比，NDV F3組［（61.333±23.159）個(gè)/視 野］和Cytochalasin D組［（238.667±32.808）個(gè)/視野］穿過(guò)小室的數(shù)目均明顯減少（n=3，F(xiàn)=233.760，P＜0.01）。見(jiàn)圖6。

2.7 NDV F3對(duì)HeLa細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白F-actin、RhoA和ROCK2表達(dá)的影響Western blot結(jié)果顯示，在NDV F3作用HeLa細(xì)胞24 h時(shí)，F(xiàn)-actin、RhoA和ROCK2表達(dá)量較對(duì)照組均無(wú)明顯差異，而36 h和48 h時(shí)3種蛋白的表達(dá)量均較對(duì)照組降低（P＜0.01）。見(jiàn)圖7、表3。

Tab.3 Comparison of expression levels of cytoskeletonrelated proteins F-actin,RhoA and ROCK2 between four groups表3 各組間F-actin、RhoA、ROCK2蛋白表達(dá)量比較

3 討論

3.1 NDV治療腫瘤的潛力溶瘤病毒的應(yīng)用是具有潛力的癌癥治療策略。溶瘤病毒可分為基因工程或天然存在的毒株，其通過(guò)選擇性感染癌細(xì)胞而不損害未轉(zhuǎn)化的細(xì)胞和正常組織，從而誘導(dǎo)有效的適應(yīng)性抗腫瘤免疫［8-9］。截至目前，溶瘤病毒Onyx-015（中國(guó)）和T-VEC（美國(guó)）分別被批準(zhǔn)用于頭頸部鱗狀細(xì)胞癌［10］和轉(zhuǎn)移性黑素瘤［11］受試者。除此之外，許多其他溶瘤病毒已用于臨床前研究和早期臨床試驗(yàn)。臨床試驗(yàn)表明在各種類(lèi)型實(shí)體瘤的癌癥患者中使用野生型NDV毒株進(jìn)行抗腫瘤治療未見(jiàn)嚴(yán)重的不良反應(yīng)［12］。因此，溶瘤性NDV用于癌癥治療可能是一種安全有效的策略。

3.2 NDV F3可通過(guò)微絲骨架影響腫瘤細(xì)胞的增殖倒置光學(xué)顯微鏡下觀察NDV感染后的HeLa細(xì)胞有明顯的融合現(xiàn)象，隨著感染時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞不再貼壁生長(zhǎng)并且大量漂浮死亡。CCK-8實(shí)驗(yàn)和Hoechst33258染色確定NDV感染細(xì)胞后的細(xì)胞活性受抑，NDV感染后可以使細(xì)胞膜受損，釋放乳酸脫氫酶，抑制了細(xì)胞增殖，并且細(xì)胞核發(fā)生了固縮、碎裂以及形成凋亡小體，細(xì)胞發(fā)生凋亡。進(jìn)一步用TUNEL檢測(cè)法特異性地觀察到凝集的細(xì)胞團(tuán)可以被DAB特異性結(jié)合，顯示為棕色，證明細(xì)胞發(fā)生凋亡。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果均證明NDV F3感染能抑制HeLa細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡。Cytochalasin D是一種源于真菌代謝產(chǎn)物的肌動(dòng)蛋白聚合抑制劑，通過(guò)與肌動(dòng)蛋白纖維正端的結(jié)合來(lái)抑制亞基的聚合和解離，從而干擾細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)、生長(zhǎng)及吞噬等多種細(xì)胞生理過(guò)程。細(xì)胞骨架由微管、微絲、中間絲構(gòu)成。微絲由Actin和與其結(jié)合的蛋白組成。細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)、分裂、質(zhì)膜的流動(dòng)等多種功能都需要Actin的協(xié)調(diào)流動(dòng)和重建［13］。本研究以Cytochalasin D作為細(xì)胞骨架異常的陽(yáng)性對(duì)照，通過(guò)對(duì)細(xì)胞微絲骨架的染色發(fā)現(xiàn)NDV F3作用HeLa細(xì)胞后細(xì)胞微絲骨架發(fā)生聚集現(xiàn)象且排列紊亂。Rho家族蛋白是Actin的上游調(diào)控因子。研究顯示，Rho家族蛋白具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖并抑制凋亡的作用，對(duì)腫瘤的發(fā)生發(fā)展起著促進(jìn)作用［14］。細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，細(xì)胞骨架內(nèi)的結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)生變化，細(xì)胞骨架重組，形成凋亡微管網(wǎng)及凋亡小體［15］。

3.3 NDV F3可通過(guò)微絲骨架影響腫瘤細(xì)胞的遷移與侵襲惡性腫瘤致死率高主要是因?yàn)槟[瘤細(xì)胞具備了遷移和侵襲的能力，能夠穿透基底膜并到達(dá)間質(zhì)，完成上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）這一癌變過(guò)程，然后隨著血液和淋巴轉(zhuǎn)移［16］。細(xì)胞骨架與腫瘤的遷移與侵襲密切相關(guān)［5］。RhoA/ROCK信號(hào)通路是參與微絲骨架改變的一條重要通路。RhoA不僅與腫瘤細(xì)胞的增殖有關(guān)，還可以通過(guò)與GTP酶結(jié)合活化下游效應(yīng)蛋白調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架，從而影響細(xì)胞遷移［17］。ROCK是RhoA蛋白重要的下游效應(yīng)器，通過(guò)磷酸化肌球蛋白輕鏈（MLC）和肌球蛋白磷酸酶亞基1（MYPT1），影響肌動(dòng)蛋白與肌球蛋白的交聯(lián)以及肌動(dòng)蛋白微絲骨架的聚合，進(jìn)一步調(diào)控細(xì)胞骨架微絲和偽足等Factin樣結(jié)構(gòu)形態(tài)改變，導(dǎo)致微絲骨架重組等多種生物學(xué)行為［18-19］。本研究中，劃痕和Transwell實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)NDV F3對(duì)HeLa細(xì)胞的遷移率和侵襲數(shù)目均有抑制作用，Western blot檢測(cè)F-acin、RhoA和ROCK的蛋白表達(dá)量均有降低的趨勢(shì)，提示NDV的作用可能破壞了細(xì)胞骨架內(nèi)的結(jié)構(gòu)，影響微絲骨架的聚合，從而破壞了細(xì)胞的遷移及侵襲能力。其機(jī)制可能與RhoA/ROCK信號(hào)通路有關(guān)。

綜上所述，NDV F3可抑制宮頸癌HeLa細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)凋亡，其機(jī)制可能與破壞細(xì)胞微絲骨架等結(jié)構(gòu)的完整性與功能有關(guān)。此外，NDV F3作用HeLa細(xì)胞后對(duì)細(xì)胞的遷移與侵襲能力均有抑制作用，其機(jī)制可能與細(xì)胞微絲骨架蛋白相關(guān)的RhoA/ROCK信號(hào)通路有關(guān)。

Fig.5 Changes in migration distance of each group of cells after scratching(×100)圖5 各組細(xì)胞劃痕后遷移距離的變化（×100）