柚皮油對心肺復(fù)蘇后大鼠心肌壞死性凋亡的影響

趙高陽，謝露，王文艷，鄒鑫森，田鑫悅，陳蒙華△

心搏驟停（cardiac arrest，CA）是指心臟泵血功能機械活動的突然停止，可造成全身血液循環(huán)中斷、呼吸停止和意識喪失。心肺復(fù)蘇后恢復(fù)自主循環(huán)（return of spontaneous circulation，ROSC）同時可引起嚴(yán)重的心肌缺血/再灌注損傷（myocardial ischemia/reperfusion injury，MI/RI）［1］，其發(fā)生機制主要有氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡等［2］。壞死性凋亡（necroptosis）是2005年由Degterev等［3］報道的一種新的細(xì)胞死亡方式。壞死性凋亡時細(xì)胞發(fā)生水腫，細(xì)胞膜破裂以及細(xì)胞器腫脹、崩解，是一種可調(diào)控的程序性細(xì)胞死亡。最近研究發(fā)現(xiàn)壞死性凋亡廣泛參與心血管等多個系統(tǒng)疾病的發(fā)生，在組織器官缺血再灌注損傷中發(fā)揮重要作用［4］。柚皮油（pomelo peel oil，PPO）是從柚子皮中提取的揮發(fā)性油，研究證實其富含D-苧烯、黃酮類等多種化合物［5］，具有抗氧化［6-7］、抗自由基［8］等生物活性。本研究通過建立大鼠心臟驟停/心肺復(fù)蘇（CA/CPR）模型，初步探討PPO能否通過抑制壞死性凋亡減輕心肺復(fù)蘇后大鼠的MI/RI。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 柚皮油的提取沙田柚購于廣西容縣，將50 g外果皮洗凈并剪成約5 mm×5 mm大小碎片，與250 mL蒸餾水混合后放入蒸餾瓶中，加熱約2 h，待冷卻后分離PPO，置于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩嶒炃皩⑺梵w積的PPO溶解于10%甘油中緩慢進(jìn)行靜脈注射。

1.1.2 實驗動物成年健康雄性SPF級SD大鼠50只，體質(zhì)量250～300 g，購于廣西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心（許可證編號：SCXK桂2014-0002）。實驗設(shè)計及操作通過廣西醫(yī)科大學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，動物處置方法均符合動物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

1.1.3 主要儀器與試劑小型動物呼吸機RWD407購于深圳市瑞沃德生命科技有限公司。Odyssey成像系統(tǒng)購于美國LI-COR公司。乳酸（LA）含量檢測試劑盒購于北京索萊寶科技公司。BCA蛋白質(zhì)測定試劑盒購于博士德生物（AR0146）。一抗：兔抗大鼠腫瘤壞死因子（TNF）-α抗體（WL01896，萬類生物，中國）、兔抗大鼠磷酸化混合譜系激酶結(jié)構(gòu)域蛋白（p-MLKL）抗體（AF7420，Affinity，中國）、兔抗大鼠GAPDH抗體（5174T，CST，美國）。山羊抗兔IgG熒光標(biāo)記二抗（5366P，CST，美國）。通用SP試劑盒（鼠/兔鏈霉素卵白素-生物素法監(jiān)測系統(tǒng)，SP-9000，中杉金橋，中國），其中包括：內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑、封閉用正常山羊血清工作液、生物素標(biāo)記山羊抗鼠/兔IgG聚合物、辣根酶標(biāo)記鏈霉素卵白素工作液。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及模型制備按隨機數(shù)字表法將大鼠分為假手術(shù)組（Sham組）、模型組（CA組）、甘油組（GLY組）、低劑量柚皮油組（低劑量組）和高劑量柚皮油組（高劑量組），每組10只。根據(jù)Chen等［9］的方法制備大鼠CA/CPR模型。所有實驗大鼠在術(shù)前禁食12 h，自由飲水。經(jīng)大鼠右側(cè)腹腔內(nèi)注射10%水合氯醛（3 mg/kg）進(jìn)行麻醉，予以術(shù)區(qū)備皮，消毒，氣管插管，分離并暴露左側(cè)股動靜脈，心電監(jiān)測心律。將2根充滿5 IU/mL肝素鈉鹽水的20號導(dǎo)管分別置入大鼠左側(cè)股動脈和股靜脈中用于監(jiān)測血壓和給藥。采用經(jīng)食管交流電刺激誘導(dǎo)大鼠心臟發(fā)生心室顫動（VF），建立CA/CPR模型。CA成功判定標(biāo)準(zhǔn)及ROSC的恢復(fù)標(biāo)準(zhǔn)參照Chen等［9］的研究。Sham組僅進(jìn)行機械通氣，不誘導(dǎo)CA/CPR，并經(jīng)股靜脈注射與藥物組等體積的生理鹽水；其余4組均進(jìn)行機械通氣并誘導(dǎo)CA/CPR?；謴?fù)ROSC后30 min內(nèi)，經(jīng)股靜脈緩慢注射PPO，低劑量組20 mg/kg，高劑量組40 mg/kg，CA組注射等體積生理鹽水，GLY組注射等體積10%甘油。監(jiān)測1 h后放回籠中繼續(xù)飼養(yǎng)。觀察24 h后，對所有大鼠進(jìn)行取材、采集血樣并分離血清200μL于-80℃低溫冰箱備用，分離心肌組織進(jìn)行HE染色、免疫組化染色及蛋白免疫印跡檢測。

1.2.2 HE染色病理觀察取ROSC后24 h心肌組織，經(jīng)10%福爾馬林液固定后，梯度乙醇脫水，石蠟包埋后制作3μm厚度的切片，對切片進(jìn)行脫蠟水化，常規(guī)HE染色，封片，光學(xué)顯微鏡下觀察病理變化。

1.2.3 血清乳酸檢測取ROSC后24 h各組大鼠血清，使用血清乳酸檢測試劑盒檢測乳酸含量，操作方法按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.4 免疫組化染色檢測TNF-α及p-MLKL的表達(dá)取石蠟切片，常規(guī)脫蠟脫水，高壓修復(fù)抗原，滴加血清封閉液；加TNF-α（1∶2 000）、p-MLKL（1∶2 000）一抗稀釋液抗體，4℃孵育過夜；PBS沖洗后，加適量生物素標(biāo)記的山羊抗鼠/兔IgG聚合物，37℃孵育15 min，PBS沖洗3次（2.5 min/次）；加辣根過氧化物酶標(biāo)記鏈霉素卵白素工作液室溫孵育10 min，PBS沖洗3次（2.5 min/次）；DAB顯色，蘇木素染色，鹽酸乙醇分化，水洗返藍(lán)，晾干，中性樹膠封片，鏡檢。光學(xué)顯微鏡下拍照，每片隨機讀取3個視野，陽性反應(yīng)為棕黃色或黃色顆粒，陽性表達(dá)率為每視野內(nèi)呈現(xiàn)陽性反應(yīng)面積占每視野面積的比率，采用Image J軟件定量分析，結(jié)果以3個視野陽性表達(dá)率的平均值表示。

1.2.5 蛋白免疫印跡檢測TNF-α及p-MLKL的表達(dá)取-80℃超低溫冰箱保存的心肌組織，勻漿，離心取上清液，通過BCA蛋白質(zhì)測定試劑盒進(jìn)行總蛋白質(zhì)濃度測定，然后與適量上樣緩沖液混合，100℃煮沸10 min，冷卻后進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，并轉(zhuǎn)移到PVDF膜（0.22μm孔徑），然后用5%脫脂牛奶封閉60 min。用含有0.1%Tween 20的Tris緩沖液（TBST）洗滌5min×3次后，與TNF-α（1∶500）、p-MLKL（1∶1 000）和GAPDH（1∶1 000）抗體孵育過夜，TBST洗滌后，再與山羊抗兔IgG熒光二抗（1∶20 000）進(jìn)一步室溫孵育1 h。通過3次TBST洗滌后，使用Odyssey成像系統(tǒng)分析蛋白條帶的灰度值。各條帶的灰度值用Image J軟件進(jìn)行定量分析，以GAPDH為內(nèi)參校正，量化值以目的蛋白/GAPDH表示。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（ANOVA），組間多重比較行LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HE染色結(jié)果Sham組心肌組織細(xì)胞排列整齊，胞質(zhì)及胞核清晰，細(xì)胞膜完整，細(xì)胞間隙適中；CA組及GLY組心肌纖維排列明顯紊亂，部分區(qū)域細(xì)胞壞死明顯，細(xì)胞明顯腫脹，部分核固縮，間質(zhì)水腫；低劑量組心肌組織排列較紊亂，細(xì)胞水腫及細(xì)胞破壞程度稍減輕。高劑量組上述損傷明顯減輕，見圖1。

2.2 血清乳酸水平Sham組、CA組、GLY組、低劑量組、高劑量組血清乳酸水平（mmol/L）分別為0.91±0.10、1.50±0.11、1.45±0.11、1.21±0.08、1.07±0.09，5組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=37.692，P＜0.05）。與Sham組相比，CA組、GLY組顯著升高（P＜0.05）；CA組與GLY組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；低劑量組、高劑量組較CA組、GLY組降低，高劑量組較低劑量組降低（均P＜0.05）。

2.3 心肌組織中TNF-α及p-MLKL免疫組化染色結(jié)果與Sham組比較，CA和GLY組心肌組織中TNF-α及p-MLKL的陽性表達(dá)率升高（P＜0.05）；低劑量組及高劑量組心肌組織中TNF-α及p-MLKL陽性表達(dá)率較CA組下降（P＜0.05），且高劑量組心肌組織中TNF-α及p-MLKL陽性表達(dá)率較低劑量組更低（P＜0.05），CA組與GLY組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見圖2、3，表1。

Tab.1 The positive expression rates and relative protein expressions of TNF-αand p-MLKL in myocardium of rats in five groups表1 5組大鼠心肌TNF-α和p-MLKL免疫組化陽性表達(dá)率及蛋白相對表達(dá)量

2.4 心肌組織中TNF-α及p-MLKL蛋白表達(dá)蛋白免疫印跡結(jié)果與Sham組比較，CA和GLY組心肌組織中TNF-α及p-MLKL蛋白的表達(dá)明顯升高（P＜0.05）；低劑量及高劑量組心肌組織中TNF-α及p-MLKL蛋白表達(dá)較CA組明顯下降（P＜0.05），且高劑量組心肌組織中TNF-α及p-MLKL蛋白表達(dá)較低劑量組更低（P＜0.05）。見圖4、表1。

Fig.4 The expressions of TNF-α與p-MLKL at 24 h of ROSC in five groups圖4 ROSC后24 h 5組大鼠心肌TNF-α與p-MLKL蛋白的表達(dá)

3 討論

臨床上，心臟驟停患者在經(jīng)歷心肺復(fù)蘇后，組織器官存在缺血再灌注損傷，其中MI/RI一定程度上會影響患者的心臟功能及其預(yù)后。本研究采用食管電刺激法誘導(dǎo)大鼠心室顫動，建立CA/CPR模型，模擬臨床CA/CPR所致的MI/RI，結(jié)果表明，CA組和GLY組HE染色可見明顯心肌組織損傷，血清乳酸水平顯著升高；接受PPO治療后的大鼠，心肌病理損傷程度明顯減輕，血乳酸水平明顯下降，提示PPO能夠改善心肺復(fù)蘇后心肌灌注和減輕MI/RI。壞死性凋亡是一種不同于自噬和凋亡的細(xì)胞死亡過程，其特征是同時具備壞死的形態(tài)學(xué)特征和凋亡的規(guī)律性調(diào)控機制［3］。多個信號分子以及信號通路參與體內(nèi)壞死性凋亡的調(diào)控，其中TNF-α誘導(dǎo)發(fā)生的分子途徑是壞死性凋亡最重要的一條途徑，而MI/RI的TNF-α水平明顯升高［10］?；旌献V系激酶結(jié)構(gòu)域蛋白（MLKL）是壞死性凋亡終末效應(yīng)器，p-MLKL破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)使細(xì)胞膜破裂，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡［11］。目前已有研究證實壞死性凋亡參與動脈粥樣硬化、MI/RI、心肌梗死等心血管疾病的病理生理過程［12-13］，抑制壞死性凋亡對心肌具有保護(hù)作用［14］。本研究結(jié)果顯示ROSC后大鼠心肌壞死性凋亡關(guān)鍵蛋白TNF-α和p-MLKL表達(dá)均上調(diào)，表明壞死性凋亡參與了心肺復(fù)蘇后MI/RI。Chtourou等［15］研究發(fā)現(xiàn)對高膽固醇飲食大鼠給予柚皮素可抑制壞死性凋亡，從而保護(hù)大鼠心臟。本研究發(fā)現(xiàn)心肺復(fù)蘇后大鼠給予PPO后也可顯著抑制壞死性凋亡關(guān)鍵蛋白TNF-α和p-MLKL的表達(dá)，減輕心肌病理損傷，改善心肌灌注損傷，提示PPO可能通過抑制壞死性凋亡緩解心肺復(fù)蘇后MI/RI。

PPO含有黃酮類物質(zhì)等成分，具有抗氧化、抗自由基等生物活性［8］。心肺復(fù)蘇后缺血再灌注損傷引起氧自由基（過氧化氫等）的生成增多，過氧化氫可以激活p38促有絲分裂蛋白激酶（p38MAPK），從而啟動TNF-α基因的瀑布反應(yīng)，導(dǎo)致缺血再灌注心肌TNF-α的產(chǎn)生增多［10］。依據(jù)本研究結(jié)果，推測PPO可能通過抗氧化，抑制TNF-α表達(dá)及其介導(dǎo)的壞死性凋亡來減輕心肺復(fù)蘇后心肌損傷。

綜上所述，PPO可抑制壞死性凋亡，減輕心肺復(fù)蘇后MI/RI。本研究尚有不足之處，首先PPO為混合物，需進(jìn)一步分離純化PPO并鑒定其具體有效成分。其次，需要研究PPO減輕MI/RI的量效關(guān)系以確定其最佳劑量，為進(jìn)一步的機制探討提供參考依據(jù)。

Fig.1 The comparison of hematoxylin-eosin staining results in five groups(×400)圖1 5組大鼠心肌HE染色結(jié)果（×400）

Fig.2 Immunohistochemical staining of TNF-αin myocardium of rats in five groups(×400)圖2 5組大鼠心肌TNF-α免疫組化染色圖（×400）

Fig.3 Immunohistochemical staining of p-MLKL in myocardium of rats in five groups(×400)圖3 5組大鼠心肌p-MLKL免疫組化染色圖（×400）