非肽類(lèi)孤啡肽受體拮抗劑C-24對(duì)大鼠急性心肌缺血后心律失常的影響

陳司坤，解夢(mèng)莉，韓毅，△，郭政

急性心肌缺血后常出現(xiàn)的嚴(yán)重心律失常是導(dǎo)致心源性猝死的重要原因［1］。其中，急性心肌缺血后交感神經(jīng)過(guò)度激活，感覺(jué)神經(jīng)肽和炎性因子產(chǎn)生增多是誘發(fā)心房顫動(dòng)的主要原因之一［2］。孤啡肽（N/OFQ）是一種內(nèi)源性阿片肽，本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)急性心肌缺血后N/OFQ分泌增多，其拮抗劑UFP-101可以降低缺血性心律失常的發(fā)生率［3］。也有研究發(fā)現(xiàn)N/OFQ參與膿毒癥反應(yīng)的早期階段，UFP-101預(yù)處理可使膿毒癥模型大鼠血漿腫瘤壞死因子（TNF）-α和白細(xì)胞介素（IL）-1β濃度降低，提示孤啡肽受體拮抗劑可能通過(guò)調(diào)節(jié)心肌組織中炎性因子來(lái)影響缺血后心律失常的發(fā)生［4］。2006年，Goto等［5］發(fā)現(xiàn)了一種新化合物compound-24（C-24）。該化合物對(duì)N/OFQ受體（ORL1）有高親和力和選擇性，且很容易穿透血腦屏障，可改善由帕金森病導(dǎo)致的運(yùn)動(dòng)障礙［6］，但目前鮮見(jiàn)其在心臟組織中的研究。本研究旨在探討N/OFQ拮抗劑C-24對(duì)急性心肌缺血后心律失常的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物清潔級(jí)健康雄性SD大鼠50只，6～8周齡，體質(zhì)量250～280 g，購(gòu)自山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。動(dòng)物適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，本研究得到山西醫(yī)科大學(xué)機(jī)構(gòu)動(dòng)物護(hù)理和使用委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.1.2 儀器與試劑實(shí)驗(yàn)儀器：AlC-V8小動(dòng)物呼吸機(jī)（上海澳爾科特公司）；BL-420F生物信號(hào)采集與分析系統(tǒng)（成都泰盟軟件有限公司）；酶標(biāo)儀（美國(guó)賽默飛公司）。試劑：C-24（英國(guó)Tocris Cookson公司）；TNF-α、IL-1β酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）試劑盒（江蘇酶免生物科技公司）。

1.2 方法

1.2.1 C-24濃度梯度設(shè)計(jì)基于拮抗參數(shù)pA2計(jì)算C-24的理論最佳有效濃度，pA2指激動(dòng)劑劑量提高至原濃度2倍時(shí)，產(chǎn)生與原濃度相同效應(yīng)時(shí)所需拮抗劑的摩爾濃度的負(fù)對(duì)數(shù)，其 計(jì) 算公式 為pA2=-log［I］。研 究 發(fā)現(xiàn)C-24的pA2值 為9.12［7］，UFP-101的pA2值為7.30［8］，本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)UFP-101減少急性心肌缺血后心律失常發(fā)生的最佳有效濃度為1×10-9mol/L［3］。再結(jié)合公式pA2=-log［I］，計(jì)算出C-24理論最佳有效濃度為1.51×10-11mol/L，根據(jù)該濃度設(shè)計(jì)濃度梯度1×10-13、1×10-11、1×10-9mol/L。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組及大鼠急性心肌缺血模型的建立按照隨機(jī)數(shù)字表法將50只大鼠分為假手術(shù)組（Sham組）、冠脈結(jié)扎組（CAO組）和C-24組（C組）；根據(jù)拮抗劑的濃度梯度，將C組分為3個(gè)亞組：即C-Ⅰ組（1×10-13mol/L）、C-Ⅱ組（1×10-11mol/L）、C-Ⅲ組（1×10-9mol/L），每組10只。大鼠稱(chēng)質(zhì)量后用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25%的烏拉坦進(jìn)行腹腔麻醉（1.2 g/kg），麻醉滿(mǎn)意后將大鼠仰臥位固定于操作臺(tái)上，連接生物信號(hào)采集處理系統(tǒng)，以Ⅱ?qū)?lián)連接心電圖，持續(xù)監(jiān)測(cè)大鼠心電數(shù)據(jù)；然后氣管切開(kāi)并插入氣管導(dǎo)管，連接小動(dòng)物呼吸機(jī)進(jìn)行機(jī)械通氣，呼吸機(jī)設(shè)置潮氣量8 mL/kg，呼吸頻率70次/min。穩(wěn)定后自大鼠頸動(dòng)脈插管至左心室，持續(xù)監(jiān)測(cè)大鼠心功能。C組各亞組于結(jié)扎前10 min按照1 mL/kg體質(zhì)量經(jīng)尾靜脈注射相應(yīng)濃度C-24，Sham組和CAO組注射等體積生理鹽水。10 min后在左側(cè)第4肋間開(kāi)胸暴露心臟，Sham組只開(kāi)胸穿線不結(jié)扎；CAO組和C組以5-0無(wú)損傷縫線于左心耳右緣冠狀動(dòng)脈左前降支起點(diǎn)下2 mm處進(jìn)針結(jié)扎，可見(jiàn)Ⅱ?qū)?lián)ST段抬高并逐漸與QRS波融合，心臟前壁逐漸變白，出現(xiàn)心律失常，提示造模成功。冠脈結(jié)扎15 min后處死大鼠，取大鼠心肌組織于-80℃冰箱中保存。

1.2.3 各組大鼠心率變異性（HRV）檢測(cè)造模過(guò)程中動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)大鼠15 min內(nèi)的心電信號(hào)，使用RM6240生物信號(hào)采集處理系統(tǒng)分析HRV指標(biāo)。HRV時(shí)域分析指標(biāo)包括RR間期標(biāo)準(zhǔn)差（SDNN）、相臨RR間期差的均方根（RMSSD）；頻域分析指標(biāo)包括標(biāo)準(zhǔn)化低頻功率（LFnorm）、標(biāo)準(zhǔn)化高頻功率（HFnorm）及低高頻比值（LF/HF）。

1.2.4 各組大鼠心功能檢測(cè)大鼠麻醉且插入氣管導(dǎo)管后，行左心室置管術(shù)監(jiān)測(cè)大鼠左心室收縮壓（LVSP）、左心室舒張末壓（LVEDP）、心率（HR）、左心室壓力上升和下降最大變化率（±dp/dtmax）。

1.2.5 大鼠心律失常評(píng)分記錄各組大鼠冠脈結(jié)扎后15 min內(nèi)心律失常發(fā)生次數(shù)并進(jìn)行評(píng)分。心律失常包括以下幾種類(lèi)型：室性早搏（VEB）、室性心動(dòng)過(guò)速（VT）和心室顫動(dòng)（VF）。具體評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下［9］：0分，＜50個(gè)VEB；1分，≥50個(gè)VEB；2分，1～5次VT；3分，≥6次VT；4分，1次VF；5分，2～5次VF。

1.2.6 ELISA檢測(cè)心肌組織TNF-α和IL-1β水平取-80℃保存的心肌組織，以9 mL/g加入PBS后進(jìn)行手工研磨，于4℃、2 000 r/min離心20 min，收取上清后按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行操作，在酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)下測(cè)定光密度（OD）值并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算TNF-α和IL-1β水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。正態(tài)分布的計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。非正態(tài)分布計(jì)量資料采用中位數(shù)和四分位數(shù)［M（P25，P75）］表示，采用Kruskal-WallisH檢驗(yàn)，組內(nèi)多重比較采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)，并對(duì)檢驗(yàn)水準(zhǔn)α'按Bonferroni法進(jìn)行校正。相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)。

2 結(jié)果

2.1 急性心肌缺血模型建立情況實(shí)驗(yàn)過(guò)程中因?qū)嶒?yàn)操作不當(dāng)死亡2只（Sham組1只，CAO組1只），因麻醉藥物過(guò)量死亡1只（C-Ⅱ組），因心律失常死亡3只（CAO組1只，C-Ⅱ組1只，C-Ⅲ組1只），以上均被剔除并重新補(bǔ)充標(biāo)本。

2.2 各組大鼠冠脈結(jié)扎后心律失常變化情況與Sham組比較，CAO組、C-Ⅰ組、C-Ⅱ組和C-Ⅲ組VEB次數(shù)明顯增加，CAO組VT+VF的發(fā)生次數(shù)增加，持續(xù)時(shí)間延長(zhǎng)，心律失常評(píng)分升高（P＜0.05）；C-Ⅰ組VT+VF的發(fā)生次數(shù)增加，心律失常評(píng)分升高（P＜0.05）。與CAO組比較，C-Ⅰ組、C-Ⅱ組和C-Ⅲ組VEB發(fā)生次數(shù)明顯減少（P＜0.05），C-Ⅲ組VT+VF發(fā)生次數(shù)減少，持續(xù)時(shí)間縮短，心律失常評(píng)分明顯下降（P＜0.05）。與C-Ⅰ組比較，C-Ⅱ組、C-Ⅲ組VEB發(fā)生次數(shù)明顯減少（P＜0.05），C-Ⅲ組心律失常評(píng)分明顯降低（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

Tab.1 Comparison of cumulative arrhythmia within 15 minutes after coronary occlusion between five groups of rats表1 5組大鼠冠脈閉塞后15 min內(nèi)累計(jì)心律失常發(fā)生情況比較

2.3 各組大鼠冠脈結(jié)扎后HRV變化情況 與Sham組比較，CAO組、C-Ⅰ組、C-Ⅱ組、C-Ⅲ組SDNN、RMSSD均明顯降低（P＜0.05），CAO組LF/HF升高（P＜0.05）。與CAO組比較，C-Ⅰ組和C-Ⅱ組RMSSD明顯增高（P＜0.05），C-Ⅰ組、C-Ⅱ組、C-Ⅲ組的LF/HF明顯降低（P＜0.05）。各組間LFnorm和HFnorm比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表2。

Tab.2 Comparison of HRV within 15 minutes after coronary occlusion between five groups of rats表2 5組大鼠CAO后15 min內(nèi)HRV比較

2.4 各組大鼠冠脈結(jié)扎后心功能指標(biāo)變化情況5組大鼠LVSP、LVEDP、HR、+dp/dtmax和-dp/dtmax比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），見(jiàn)表3。

2.5 各組大鼠冠脈結(jié)扎后TNF-α和IL-1β變化情況與Sham組比較，CAO組、C-Ⅰ組、C-Ⅱ組和C-Ⅲ組TNF-α和IL-1β水平明顯增加（P＜0.05）；與CAO組比較，C-Ⅰ組TNF-α和IL-1β水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），C-Ⅱ組和C-Ⅲ組則明顯下降（P＜0.05）。C-Ⅱ組和C-Ⅲ組TNF-α和IL-1β水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表4。

Tab.3 Comparison of various indexes of heart function after coronary artery occlusion in five groups of rats表3 5組大鼠冠脈結(jié)扎后心功能各指標(biāo)的比較

Tab.4 Comparison of inflammatory factors in 15 minutes after coronary occlusion between five groups of rats表4 5組大鼠冠脈閉塞后15 min內(nèi)炎性因子水平比較

2.6 VEB發(fā)生次數(shù)和TNF-α、IL-1β水平的相關(guān)性TNF-α與IL-1β水平呈正相關(guān)（r=0.564，P＜0.01）、VEB發(fā)生次數(shù)與TNF-α、IL-1β呈正相關(guān)（r分別為0.620、0.609，均P＜0.01），見(jiàn)圖1。

Fig.1 Scatter plot analysis of correlation between the occurrence of VEB and the levels of TNF-αand IL-1β圖1 VEB發(fā)生次數(shù)和炎性因子TNF-α、IL-1β水平的相關(guān)性分析散點(diǎn)圖

3 討論

急性心肌梗死后心律失常是多種因素共同作用的結(jié)果，包括兒茶酚胺［10］和感覺(jué)神經(jīng)肽［11］的大量釋放。N/OFQ是感覺(jué)神經(jīng)肽的一種，其在全身多個(gè)器官中均有表達(dá)，主要分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)和脊髓等痛覺(jué)調(diào)節(jié)系統(tǒng)［12］。有研究發(fā)現(xiàn)在急性心肌梗死后，心臟背根神經(jīng)節(jié)及脊髓N/OFQ表達(dá)明顯增多，同時(shí)其受體ORL1在急性心肌梗死后心臟表面表達(dá)增多［13］。

HRV能客觀地反映交感神經(jīng)和迷走神經(jīng)的活性變化及兩者的平衡狀態(tài)，本研究結(jié)果顯示CAO組冠脈結(jié)扎后SDNN、RMSSD均顯著降低，LF/HF比值明顯增高，表明急性心肌梗死后交感神經(jīng)過(guò)度激活；而C-24預(yù)處理后LF/HF比值明顯降低，SDNN、RMSSD較CAO組升高，提示C-24可以有效地降低交感神經(jīng)的活性，進(jìn)而減少急性心肌缺血后心律失常的發(fā)生。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)N/OFQ可通過(guò)上調(diào)β1受體外化影響交感神經(jīng)的激活［14］，提示C-24降低交感神經(jīng)活性與調(diào)節(jié)β1受體表達(dá)有關(guān)，后續(xù)實(shí)驗(yàn)將對(duì)該機(jī)制進(jìn)一步探究。

炎性因子增多是導(dǎo)致缺血后心律失常發(fā)生的原因之一，其中TNF-α可以通過(guò)多種途徑影響心肌電生理，延長(zhǎng)動(dòng)作電位時(shí)程，減慢心肌細(xì)胞復(fù)極化，從而產(chǎn)生傳導(dǎo)障礙和異常自律性的增加，導(dǎo)致各種心律失常的發(fā)生；同時(shí)TNF-α還可誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生IL-1、IL-6［2］。IL-1β可以促進(jìn)炎性因子釋放和炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)的發(fā)生，導(dǎo)致心肌電生理異常，產(chǎn)生促缺血性心律失常的作用［15］。TNF-α和IL-1β還能通過(guò)協(xié)同作用增強(qiáng)梗死后心肌的炎癥反應(yīng)［16］。本研究中使用C-24預(yù)處理后心肌組織中TNF-α和IL-1β水平均明顯降低，相關(guān)性分析結(jié)果顯示兩者呈正相關(guān)，表明C-24可明顯減少急性心肌缺血后心肌組織中炎性因子的產(chǎn)生，對(duì)降低缺血后心律失常的發(fā)生有積極作用。

本研究通過(guò)比較3個(gè)濃度C-24對(duì)大鼠急性心肌梗死后心律失常發(fā)生的影響發(fā)現(xiàn)，C-24預(yù)處理后VEB次數(shù)明顯減少，其中最高濃度組VT和VF發(fā)生次數(shù)及持續(xù)時(shí)間顯著減少，心律失常評(píng)分顯著降低。相關(guān)性分析結(jié)果顯示，TNF-α、IL-1β水平與VEB發(fā)生次數(shù)均呈正相關(guān)，提示非肽類(lèi)孤啡肽受體拮抗劑可以通過(guò)降低炎性因子水平進(jìn)而減少缺血性心律失常的發(fā)生。此外，由心功能指標(biāo)結(jié)果可知，C-24對(duì)心功能無(wú)明顯影響。有研究發(fā)現(xiàn)在大鼠星狀神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元中，C-24會(huì)阻斷N/OFQ介導(dǎo)的Ca2+電流抑制［17］。此外，在電生理學(xué)研究中，C-24還可以阻斷N/OFQ誘導(dǎo)的G蛋白偶聯(lián)的內(nèi)向整流鉀電流［18］。筆者分析C-24導(dǎo)致心律失常發(fā)生的原因還可能與其調(diào)節(jié)鈣離子通道或鉀離子通道有關(guān)。后續(xù)實(shí)驗(yàn)將對(duì)C-24作用于ORL1的具體機(jī)制進(jìn)行研究。