無糖型外感風(fēng)痧顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究

羅宇東++陸施衡+譚安薔++吳玉強(qiáng)++陳洪濤

[摘要]目的 建立無糖型外感風(fēng)痧顆粒質(zhì)量控制的標(biāo)準(zhǔn)。方法 使用薄層色譜法（TLC），以石油醚（60～90℃）-乙酸乙酯-冰醋酸（16∶2∶1）為展開劑，10%硫酸乙醇溶液為顯色劑，定性鑒別藤苦參；以甲苯-乙酸乙酯-冰醋酸（10∶3∶1）為展開劑，紫外光燈（365 nm）下觀察，定性鑒別崗梅；采用高效液相色譜法（HPLC），色譜柱：島津C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm），流動相：乙腈-0.4%磷酸溶液（13∶87），流速0.5 ml/min，柱溫25℃，檢測波長327 nm，進(jìn)樣量10 μl，采樣時間60 min，對產(chǎn)品中的綠原酸進(jìn)行含量測定。結(jié)果 按TLC法，供試品色譜中，在與對照藥材藤苦參色譜相應(yīng)的位置上，顯一個或一個以上相同顏色的斑點，在與對照藥材崗梅色譜中相應(yīng)的位置上，顯一個或一個以上相同顏色的亮斑，斑點清晰，專屬性強(qiáng)，重現(xiàn)性好，陰性無干擾；綠原酸進(jìn)樣量在6.2968～201.5 μg范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好（r=0.9991），平均回收率為100.11%，RSD=0.14%（n=6），測定10批無糖型外感風(fēng)痧顆粒樣品中綠原酸的平均含量為1.1069 mg/g（RSD=0.45%）。結(jié)論 所采用的質(zhì)量控制方法具有方法靈敏、專屬性強(qiáng)、重現(xiàn)性好、穩(wěn)定性高的特點，可作為無糖型外感風(fēng)痧顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)控制方法。

[關(guān)鍵詞]無糖型外感風(fēng)痧顆粒；質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；綠原酸；薄層色譜法；高效液相色譜法

[中圖分類號] R286.0 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1674-4721（2017）09（a）-0125-05

Study on quality standard of sugarless Waiganfengsha Granules

LUO Yu-dong1，2，3 LU Shi-heng1 TAN An-qiang1 WU Yu-qiang1，3 CHEN Hong-tao1▲

1.Pharmaceutical Factory，Guangxi Traditional Chinese Medical University，Nan-ning 530023，China；2.Key Laboratory of Zhuang Medicine Prescriptions Basis and Application Research of Guangxi Colleges and Universities，Nanning 530001，China；3.Key Laboratory of Generic Technology Development of Chinese Medicine Preparation of Guangxi Colleges and Universities，Nanning 530001，China

[Abstract]Objective To set up the quality control standard of sugarless Waiganfengsha Granules.Methods Thin layer chromatography （TLC） was used，and petroleum ether （60-90℃）-ethyl acetate-glacial acetic acid （16∶2∶1） was the developing agent，and 10% sulfuric acid ethanol solution selected as the chromogenic agent to qualitatively identify Streptocaulon griffithii.Toluene-ethyl acetate-glacial acetic acid （10∶3∶1） was the developing agent，and it was observed under ultraviolet lamp （365 nm） to qualitatively identify Holly root.HPLC was used，chromatographic column：Shimadzu C18 chromatographic column （4.6 mm×150 mm，5 μm） was adopted，and mobile phase：acetonitrile-0.4% phosphoric acid solution （13∶87），current speed：0.5 ml/min，and column temperature：25℃，detection wavelength was 327 nm，sample size：10 μl，and sampling time was 60 min.The content of chlorogenic acid in the product was determined.Results According to TLC method，in test sample chromatography，in the corresponding position with Streptocaulon griffithii chromatogram of contrast medicinal material，1 or more than 1 spots in same color were displayed while in the corresponding position with Holly root chromatogram of contrast medicinal material 1 or more than 1 bright spots in same color were displayed，and the spots were clear，and the specificity was strong with good reproducibility，and it had no interference of negative.Chlorogenic acid had a good linear relationship with peak area in the range of 6.2968-201.5 μg （r=0.9991） of sample size，and the average recovery rate was 100.11%，and RSD was 0.14% （n=6）.The average content of Chlorogenic acid was 1.1069 mg/g （RSD=0.45 %） among 10 batches of sample tablets.Conclusion The quality control method used has a characteristics of sensitive method，strong specificity，good reproducible and high stability，and it can be used as the quality standard control method of sugarless Waiganfengsha Granules.endprint

[Key words]Sugarless Waiganfengsha Granules；Quality standard；Chlorogenic acid；TLC；HPLC

外感風(fēng)痧顆粒為國家頒布標(biāo)準(zhǔn)品種、廣西傳統(tǒng)特色優(yōu)勢壯藥，其由蒼耳草、藤苦參、崗梅、兩面針等藥材配方而成，具有祛風(fēng)，清熱的功效，用于風(fēng)熱感冒，咽喉腫痛等癥療效顯著。藥理研究表明外感風(fēng)痧顆粒有明顯抗菌、退熱、鎮(zhèn)痛、抗炎、增強(qiáng)、免疫、功能等作用。體內(nèi)藥理試驗證實外感風(fēng)痧片具有明顯的抗菌、抗病毒作用及鎮(zhèn)咳、祛痰作用。長期臨床和藥理試驗證明外感風(fēng)痧片按臨床擬用的劑量、途徑及療程使用安全有效[1-4]。但外感風(fēng)痧顆?，F(xiàn)有劑型含糖量偏高，輔料用量大，限制了一部分不宜攝入蔗糖的患者使用，另外，原品種質(zhì)量控制方法有待進(jìn)一步完善提高，如成品無特征成分藥材的鑒別及有效成分的含測，因此，研制無糖型外感風(fēng)痧顆粒產(chǎn)品，提高產(chǎn)品質(zhì)量控制方法，對外感風(fēng)痧顆粒進(jìn)行二次開發(fā)，將具有良好的社會效益及經(jīng)濟(jì)效益。前期課題組對無糖型外感風(fēng)痧顆粒進(jìn)行了工藝研究[5-7]，本文采用薄層色譜法（TLC）定性鑒別崗梅、藤苦參，并采用HPLC法測定產(chǎn)品中主藥蒼耳草所含綠原酸含量，以期為該產(chǎn)品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)升級提供理論依據(jù)。

1 儀器與試劑

1.1儀器

島津LC-10AT高效液相色譜儀，島津SPD-10Avp紫外檢測器，威瑪龍用色譜數(shù)據(jù)工作站；XS105DM電子分析天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]；KQ-100DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），HH-S4數(shù)顯恒溫水浴鍋（金壇市醫(yī)療儀器廠）。

1.2試劑

乙腈（色譜純，美國Tedia 公司，批號：13025006），甲醇（色譜純，美國Tedia 公司，批號：13025006）；甲醇（分析純，南京化學(xué)試劑有限公司，批號：09020310079），磷酸（分析純，廣東光華化學(xué)廠有限公司，批號：20071 101），水為純水。

對照品：崗梅對照藥材（批號：121152-201103）、綠原酸對照品（批號：11075-201314）均購自中國食品藥品檢定研究院。藤苦參、蒼耳草、山芝麻、狗仔花購自南寧老百姓大藥房，經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)韋松基老教授鑒定。

1.3樣品

外感風(fēng)痧顆粒（無糖型）（批號：20140201、20140401、20140402、20140403、20140405、20140501、20140502、20140503、20140504、20140505）由廣西中醫(yī)藥大學(xué)制藥廠生產(chǎn)。

2方法與結(jié)果

2.1藤苦參薄層鑒別

取外感風(fēng)痧顆粒（無糖型）45 g，研細(xì)，加無水乙醇100 ml，加熱回流1 h，濾過，濾液蒸干，殘渣加乙醇2 ml使溶解，作為供試品溶液；另取藤苦參對照藥材6 g，加水煎煮2 h，濾過，濾液濃縮成干膏，同法制成對照藥材溶液。取處方中除藤苦參以外的其他藥材40 g，加水煎煮2 h，濾過，濾液濃縮成干膏，照上述供試品溶液制法制成外感風(fēng)痧顆粒（無糖型）缺藤苦參陰性樣品溶液。將供試品溶液、對照藥材溶液、陰性樣品液分別點于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上，以石油醚（60～90℃）-乙酸乙酯-冰醋酸（16∶2∶1）為展開劑展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，105℃加熱至斑點顯色清晰。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯一個或一個以上相同顏色的斑點，特征斑點Rf值為0.45，陰性無干擾（圖1）。經(jīng)多批重復(fù)試驗，均能得到清晰明顯的斑點，表明本法專屬性強(qiáng)，重現(xiàn)性好，故質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中收入本法。

2.2崗梅薄層鑒別

取外感風(fēng)痧顆粒（無糖型）30 g，研細(xì)，加無水乙醇100 ml，加熱回流30 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加水10 ml使溶解，濾過，濾液加乙醚20 ml，振搖提取，棄去水層，乙醚液加1 mol/L鹽酸溶液10 ml振搖提取，棄去酸液，乙醚液用5%碳酸鈉溶液振搖提取2次，每次10 ml，取乙醚液用10 ml水洗滌，乙醚液揮干，殘渣加乙醇2 ml使溶解，作為供試品溶液；另取崗梅對照藥材加水煎煮1 h，濾過，濃縮至10 ml，自“加乙醚20 ml”起，同上法制成對照藥材溶液；另取處方中除崗梅以外的其他藥材25 g，加水煎煮2 h，濾過，濾液濃縮成干膏。照上述供試品溶液制法制成外感風(fēng)痧顆粒（無糖型）缺崗梅陰性樣品溶液。吸取供試品溶液、對照藥材溶液、缺崗梅陰性樣品溶液各6 μl，分別點于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯-冰醋酸（10∶3∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，于紫外光燈（365 nm）下觀察，供試品色譜中，在與對照藥材色譜中相應(yīng)的位置上，顯一個或一個以上相同顏色的亮斑。斑點清晰，陰性無干擾（圖2）。多批重復(fù)試驗，結(jié)果相同，表明本法專屬性強(qiáng)，重現(xiàn)性強(qiáng)，故質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中收入本法。

2.3綠原酸的含量測定

2.3.1對照品溶液的制備 精密稱取綠原酸對照品10.41 mg，置25 ml棕色量瓶中，加50%甲醇制成儲備液（0.403 mg/ml），精密量取綠原酸對照品儲備液1 ml，置10 ml量瓶中，加50%甲醇定容，即得40.3 μg/ml的對照品溶液（10℃以下保存）。

2.3.2供試品及陰性對照品溶液的制備 供試品溶液的制備：按照《中國藥典》附錄HPLC試驗，精密稱定外感風(fēng)痧顆粒（無糖型）5 g，置具塞錐形瓶中，精密加50%甲醇100 ml，稱定重量，超聲處理40 min，放冷，再稱定重量，用50%甲醇補(bǔ)足重量，搖勻，0.45 μm濾膜濾過，精密量取續(xù)濾液5 ml，置10 ml棕色量瓶中，加50%甲醇至刻度，搖勻，作為供試品溶液。依法制備10批。

陰性樣品溶液的制備：另取外感風(fēng)痧顆粒（無糖型）一個處方量除蒼耳草以外的其他藥材，加水煎煮，第1次2 h，第2次1 h，合并煎液，濾過，濾液濃縮至稠膏狀，干燥，粉碎成細(xì)粉，加糊精補(bǔ)足重量，制成顆粒，照上述供試品溶液制法制成外感風(fēng)痧顆粒（無糖型）缺蒼耳草陰性樣品溶液。依法制備3批。endprint

2.3.3色譜條件 色譜柱：十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑（4.6 mm×150 mm），流動相乙腈-0.4%磷酸溶液（13∶87），流速0.5 ml/min，柱溫25℃，檢測波長327 nm，進(jìn)樣量10 μl，采樣時間60 min。在上述色譜條件下，綠原酸對照品、供試品、陰性對照的色譜圖見圖3。

2.3.4陰性干擾試驗 照常規(guī)制備缺蒼耳草的陰性對照品樣品溶液，同法檢測，在與綠原酸對照品色譜峰相應(yīng)的位置上，供試品溶液有相同保留時間的色譜峰，而缺蒼耳草的陰性對照品溶液在此位置上無色譜峰（圖3）。

2.3.5線性關(guān)系考察 精密量取“2.3.1”項下對照品貯備液適量，分別加50%甲醇配制成6.2968、12.5936、25.1875、50.375、100.75、201.5 μg/ml 的溶液，作為對照品溶液。分別精密量取上述對照品溶液各10 μl 注入高效液相色譜儀，并記錄色譜圖。以濃度C為橫坐標(biāo)（X），峰面積 A 為縱坐標(biāo)（Y），得綠原酸的線性回歸方程：Y=42.56X+31.81，r2=0.999（n=6），結(jié)果表明，綠原酸在6.2968～201.5 μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.3.6精密度 精密吸取對照品液 10 μl，重復(fù)進(jìn)樣6次，按“2.3.3”項下色譜條件測對照品峰面積，計算其RSD值為1.90%（n=6），結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.3.7穩(wěn)定性試驗 精密吸取同一批外感風(fēng)痧顆粒（無糖型）（批號：20140201）供試品溶液 10 μl，按“2.3.3”項下色譜條件試驗，分別于0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣，測定其峰面積，計算RSD為2.38%（n=6），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.8定量限和檢出限 精密吸取綠原酸對照品貯備液，加50%甲醇稀釋成一系列的濃度，過濾，精密量取10 μl 注入液相色譜儀中， 以 S/N=10為定量限，S/N=3為檢出限，得出定量限和檢出限分別為3.1484、1.0495 ng。

2.3.9重復(fù)性試驗 取同一批外感風(fēng)痧顆粒（無糖型）（批號：20140201）6份，按“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.3.3”項下色譜條件測定其綠原酸含量，結(jié)果平均含量為1.0540 μg/mg，RSD=1.61%（n=6），結(jié)果表明本法重現(xiàn)性良好。

2.3.10回收率 精密稱取同一批已知含量的外感風(fēng)痧顆粒（無糖型）（批號：20140401，綠原酸含量為0.9920）6份各5 g，按樣品中綠原酸含量的120%、100%、80%精密添入綠原酸對照品，按選定的色譜條件測定峰面積，計算回收率，結(jié)果見表1，綠原酸的平均回收率為100.11%，RSD=0.14%（n=6），表明該方法回收率較好。

2.3.11樣品中綠原酸含量的測定 分別取10批外感風(fēng)痧顆粒（無糖型），按色譜條件測定10批數(shù)據(jù)，每個批號重復(fù)測定3次，計算綠原酸含量，結(jié)果見表2，綠原酸平均值為1.1069 μg/mg（RSD=0.45%），最小值為0.9671 μg/mg，考慮到蒼耳草來源的差異大，以最小包裝為15 g/袋計算，擬將其含量定為“本品每袋含綠原酸（C16H18O9）計，不得少于12 mg”。

3討論

本研究對無糖型外感風(fēng)痧顆粒中藤苦參和崗梅進(jìn)行了 TLC 定性鑒別，所確定的薄層鑒別方法專屬性強(qiáng)，陰性對照無干擾，可以作為該制劑的鑒別方法。在藤苦參的TLC鑒別過程中，參照文獻(xiàn)資料[8-11]，曾分別試以三氯甲烷-甲醇-水（7∶2∶0.5）為展開劑展開，I2蒸汽顯色；氯仿-甲醇（7∶2）為展開劑展開，在紫外下顯色，得到的薄層色譜斑點均不明顯，且分離效果均不理想。在崗梅的TLC鑒別試驗中，參照文獻(xiàn)方法[12-14]，也曾以苯-乙酸乙酯-水（5∶2∶0.1）、苯-丙酮（9∶1）為展開劑，結(jié)果分離效果均不理想。筆者也對無糖型外感風(fēng)痧顆粒中其他藥材成份進(jìn)行了TLC鑒別研究，試用了多種展開系統(tǒng)，但均未達(dá)到理想結(jié)果。

無糖型外感風(fēng)痧顆粒由蒼耳草、藤苦參、崗梅、兩面針等藥材組方而成，君藥為蒼耳草，綠原酸為蒼耳草所含的專屬性成分，因此選擇功能性成分綠原酸作為含量測定的指標(biāo)[15-19]。本文采用HPLC對無糖型外感風(fēng)痧顆粒的綠原酸進(jìn)行含量測定，綠原酸進(jìn)樣量在6.2968～201.5 μg范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好（r=0.9991），平均回收率為100.11%，RSD=0.14%（n=6），本方法重現(xiàn)性好，結(jié)果準(zhǔn)確，可作為無糖型外感風(fēng)痧顆粒的質(zhì)量評價方法。研究過程中，取綠原酸對照品溶液，在200～400 nm 波長范圍掃描，測得綠原酸的最大吸收波長為327 nm，故將檢測波長定為327 nm，另外，按既定條件測定供試品，理論板數(shù)按綠原酸峰計算≥1000，分離度>1.5，符合HPLC含量測定要求。

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（收稿日期：2017-06-23 本文編輯：許俊琴）endprint