藏藥秦艽花黃酮體外誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的研究

劉相海，李 琦，劉 群

(西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川 610041)

篩選和評價(jià)藥物的抗腫瘤作用具有體外和體內(nèi)兩種研究方法。體內(nèi)研究方法主要考察藥物對機(jī)體腫瘤免疫相關(guān)活性細(xì)胞和腫瘤免疫相關(guān)因子的影響等，體外研究方法主要考察腫瘤細(xì)胞對藥物的敏感性，如藥物抑制腫瘤細(xì)胞的生長和藥物誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡等[1-3]。體外研究抗腫瘤藥物的關(guān)鍵是要選擇增殖快、生長穩(wěn)定、對藥物敏感的瘤細(xì)胞株系。體外研究主要選用腹水瘤、白血病、各種實(shí)體瘤細(xì)胞株系，如S180小鼠腹水瘤細(xì)胞株、Hepa1-6小鼠肝癌細(xì)胞株、L1210小鼠白血病細(xì)胞株、B16-F10小鼠黑色素瘤細(xì)胞株、SP2/0小鼠骨髓瘤細(xì)胞株等[4-7]。目前在天然藥物抗腫瘤研究領(lǐng)域，植物多糖和黃酮類化合物對腫瘤細(xì)胞的促凋亡作用研究受到國內(nèi)外廣泛關(guān)注，并已成為腫瘤治療的重要手段之一[8-9]。本研究以藏藥秦艽花黃酮為研究材料，以S180、Hepa1-6、L1210、B16-F10、SP2/0瘤細(xì)胞株為研究對象，CCK-8、AO/EB、Annexin V/PI結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)為研究手段，瘤細(xì)胞形態(tài)、瘤細(xì)胞生長抑制率、瘤細(xì)胞凋亡率為檢測指標(biāo)，探討藏藥秦艽花黃酮促腫瘤細(xì)胞凋亡的作用，為藏藥開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 受試藥物 藏藥白花秦艽(GentianamacrophyllaPall.)花為龍膽科麻花秦艽的干燥花，采集于四川甘孜色達(dá)地區(qū)(由西南大學(xué)園藝園林學(xué)院李先源鑒定)，室溫通風(fēng)干燥，避光保存；秦艽花黃酮(藏藥秦艽花總黃酮提取工藝條件：乙醇體積分?jǐn)?shù)45%、提取溫度60 ℃、提取時(shí)間30 min、料液比1∶25，黃酮實(shí)際得率22.13 mg/g)，4 ℃冰箱避光保存。

1.1.2 瘤細(xì)胞株 S180小鼠腹水瘤細(xì)胞株、Hepa1-6小鼠肝癌細(xì)胞株、L1210小鼠白血病細(xì)胞株、B16-F10小鼠黑色素瘤細(xì)胞株、SP2/0小鼠骨髓瘤細(xì)胞株。由國家細(xì)胞共享資源庫提供，凍存(75%的基礎(chǔ)培養(yǎng)基+5%的DMSO+20%的FBS)。

1.1.3 主要試劑 細(xì)胞增殖-毒性檢測試劑盒 (Cell Counting Kit-8)，北京四正柏生物科技有限公司產(chǎn)品；Annexin V-FITC/PI Kit 凋亡檢測試劑盒，北京四正柏生物科技有限公司產(chǎn)品；活細(xì)胞/凋亡細(xì)胞/壞死細(xì)胞鑒別試劑盒，江蘇凱基生技術(shù)股份有限公司產(chǎn)品。

1.1.4 主要儀器設(shè)備 熒光倒置顯微鏡(1X73)，日本奧林巴斯公司產(chǎn)品；流式細(xì)胞儀(CytoFLEX)，美國貝克曼庫爾特有限公司產(chǎn)品；離心機(jī)(TGL-16)，四川蜀科儀器有限公司產(chǎn)品；水浴鍋(HWS-26)，上海一恒科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；超凈工作臺(BBS-DDC)，濟(jì)南鑫貝西生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；生物安全柜(BSC-1100)，濟(jì)南鑫貝西生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 瘤細(xì)胞復(fù)蘇和傳代 凍存細(xì)胞，37 ℃水浴解凍，細(xì)胞培養(yǎng)液37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜，待細(xì)胞長融合度為80%左右時(shí)，傳代并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。根據(jù)瘤細(xì)胞生長特性，S180、L1210細(xì)胞懸浮培養(yǎng)傳代；Hepa1-6、B16-F10、SP2/0細(xì)胞貼壁培養(yǎng)傳代。

1.2.2 瘤細(xì)胞生長抑制作用檢測 采用CCK-8法檢測秦艽花黃酮對瘤細(xì)胞生長的抑制作用[10-13]。采用等比設(shè)計(jì)，確定敏感瘤細(xì)胞株。收集處于對數(shù)生長期的瘤細(xì)胞并制成1×105/mL的細(xì)胞懸液于96孔板內(nèi)進(jìn)行試驗(yàn)。具體試驗(yàn)分組和處理如下：

空白對照組：100 μL培養(yǎng)液、10 μL CCK-8溶液、無細(xì)胞、無受試藥物，用作調(diào)零；陰性對照組：100 μL培養(yǎng)液、10 μL CCK-8溶液、細(xì)胞、無受試藥物；陽性對照組：100 μL培養(yǎng)液、10 μL CCK-8溶液、細(xì)胞、10 μL凋亡誘導(dǎo)劑(5-FU)；受試藥物組：100 μL培養(yǎng)液、10 μL CCK-8溶液、細(xì)胞、10 μL受試藥物(受試藥物組的受試藥物為不同濃度的秦艽花黃酮溶液1 000.0、100.0、10.0、1.0、0.1 μg/mL)。

1.2.2.1 操作步驟 按照“細(xì)胞增殖-毒性檢測試劑盒”操作進(jìn)行，酶標(biāo)儀測定450 nm處的吸光度值(650 nm波長作為參考波長進(jìn)行雙波長測定，即檢測波長450 nm～490 nm，參比波長600 nm～650 nm)。

1.2.2.2 檢測指標(biāo) 瘤細(xì)胞生長抑制率=(Ac-As)/(Ac-Ab)×100%。As為受試藥物孔OD值(含有細(xì)胞的培養(yǎng)基、CCK-8、受試藥物)；Ac為陰性對照孔OD值(含有細(xì)胞的培養(yǎng)基、CCK-8、無受試藥物)；Ab為空白對照孔OD值(不含細(xì)胞和受試藥物的培養(yǎng)基、CCK-8)。

5種瘤細(xì)胞株系中，選取細(xì)胞生長抑制率最高的細(xì)胞株，作為受試藥物相對敏感瘤細(xì)胞株系并進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)研究。

1.2.3 瘤細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)檢測 采用AO/EB染色法，結(jié)合熒光顯微鏡，對敏感瘤細(xì)胞進(jìn)行凋亡形態(tài)學(xué)檢測[14-16]。試驗(yàn)分組如下：陰性對照組為瘤細(xì)胞、培養(yǎng)液、10 μL AO/EB染色混合液、無藥物；陽性對照組為瘤細(xì)胞、培養(yǎng)液、10 μL AO/EB染色混合液、凋亡誘導(dǎo)劑(5-FU)；受試藥物組為瘤細(xì)胞、培養(yǎng)液、10 μL AO/EB染色混合液、受試藥物(受試藥物組的受試藥物為不同濃度的秦艽花黃酮溶液1 000.0、100.0、10.0、1.0、0.1 μg/mL)。

1.2.3.1 操作步驟 在6孔板中配制成2.5 mL細(xì)胞懸液(細(xì)胞數(shù)2.5×106個/每孔)，根據(jù)上述試驗(yàn)分組，按照細(xì)胞懸液總體積5%～10%比例加入相應(yīng)藥物(125 μL～250 μL)，細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育24 h～48 h，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；PBS洗滌細(xì)胞兩次并配制成 5×105個/mL～6×106個/mL的細(xì)胞懸液；將染料試劑1和染料試劑2等體積混合配制成形成混合染料試劑；吸取25 μL的細(xì)胞懸液和1 μL的混合染料試劑，輕輕混勻；吸取上述10 μL的混合液，置于潔凈載玻片上，蓋玻片蓋上細(xì)胞；最后在熒光顯微鏡(激發(fā)波長510 nm)下觀察敏感瘤細(xì)胞形態(tài)。

1.2.3.2 觀察指標(biāo) 正常細(xì)胞，細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，核質(zhì)體綠染，單一大小形狀；凋亡早期細(xì)胞，不規(guī)則形細(xì)胞，核質(zhì)體綠染；凋亡晚期細(xì)胞，核質(zhì)體橙染，染色質(zhì)濃縮，核碎裂成點(diǎn)狀，大小不一，有突起芽狀胞質(zhì)；壞死細(xì)胞，橢圓形細(xì)胞，核質(zhì)體橙染，單一大小形狀。

1.2.4 瘤細(xì)胞凋亡檢測(流式細(xì)胞術(shù)) 采用Annexin-V/PI雙染法，結(jié)合流式細(xì)胞儀，檢測瘤細(xì)胞凋亡[1,17-18]。試驗(yàn)分組結(jié)果分陰性對照組：50 μL培養(yǎng)液、瘤細(xì)胞、Annexin-V/PI工作液；陽性對照組：50 μL培養(yǎng)液、瘤細(xì)胞、Annexin-V/PI工作液、凋亡誘導(dǎo)劑(5-FU)；受試藥物組：50 μL培養(yǎng)液、瘤細(xì)胞、Annexin-V/PI工作液、受試藥物(受試藥物組的受試藥物為不同濃度的秦艽花黃酮溶液1 000.0、100.0、10.0、1.0、0.1 μg/mL)，其中瘤細(xì)胞濃度為1×106個/mL～5×106個/mL。

1.2.4.1 操作步驟 按照Annexin-V/PI雙染法操作步驟進(jìn)行，流式細(xì)胞儀檢測瘤細(xì)胞凋亡。具體如下：調(diào)節(jié)電壓，空白管：陰性對照細(xì)胞，不加Annexin V/FITC、碘化丙錠PI溶液；調(diào)節(jié)補(bǔ)償，單染管：陽性對照細(xì)胞，只加Annexin V/FITC；用空白管和單染管調(diào)節(jié)好電壓補(bǔ)償后，檢測管：處理的細(xì)胞，加Annexin V/FITC、碘化丙錠PI溶液，獲得所需要的流式數(shù)據(jù))。

1.2.4.2 觀察指標(biāo) 根據(jù)Annexin V/PI雙染法檢測瘤細(xì)胞凋亡原理，經(jīng)流式細(xì)胞儀分析獲得4個象限組成的直方圖，其中，左下象限R3代表正常活細(xì)胞，Annexin V-FITC-/PI-；右下象限R4代表早期凋亡細(xì)胞，Annexin V-FITC+/PI-；右上象限代表壞死細(xì)胞或晚期凋亡細(xì)胞，Annexin-V-FITC+/PI+；左上象限代表細(xì)胞收集過程中出現(xiàn)的損傷細(xì)胞，Annexin-V-FITC-/PI+。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析 采用SPSS18.0軟件對進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)均以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，對數(shù)據(jù)進(jìn)行t 檢驗(yàn)，采用方差分析和多重比較進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 瘤細(xì)胞生長抑制作用

CCK-8法，檢測不同濃度秦艽花黃酮(1 000.0、100.0、10.0、1.0、0.1 μg/mL)分別對5種瘤細(xì)胞(S180、Hepa1-6、L1210、B16-F10、SP2/0)的生長抑制作用，細(xì)胞抑制率(平均值)結(jié)果見表1。

表1 腫瘤細(xì)胞株生長抑制率

由表1表明，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，秦艽花黃酮在1 000.0 μg/mL濃度時(shí)，對S180細(xì)胞生長的抑制效果相對較好，達(dá)到19.00%；秦艽花黃酮在0.1 μg/mL～100 μg/mL低濃度內(nèi)對L1210細(xì)胞的抑制作用隨濃度升高而抑制作用下降，但1 000.0 μg/mL濃度時(shí)抑制作用又明顯增加，達(dá)到18.20%；秦艽花黃酮在1 000.0 μg/mL濃度時(shí)對HEPA1-6、B16-F10抑制率分別是-13.24%、-11.43%，說明秦艽花黃酮對HEPA1-6、B16-F10細(xì)胞生長表現(xiàn)為小劑量抑制效果；秦艽花黃酮在1 000.0 μg/mL濃度時(shí)抑制作用最大，達(dá)到達(dá)到36.45%。

綜上所述，秦艽花黃酮在低濃度范圍內(nèi)(0.1 μg/mL～100 μg/mL)隨著黃酮濃增加抑制作用下降，但在1 000.0 μg/mL高濃度時(shí)對S180、L1210、SP2/0瘤細(xì)胞抑制作用明顯增強(qiáng)，其抑制率分別為19%、18.2%和36.45%，結(jié)合陽性藥物5-Fu對SP2/0瘤細(xì)胞的生長抑制率(86.91%)顯著高于其他4種瘤細(xì)胞的生長抑制率，考慮到秦艽花黃酮1 000.0 μg/mL濃度對SP2/0瘤細(xì)胞的生長抑制效果相對較好，故選擇SP2/0瘤細(xì)胞作為敏感瘤細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)研究。

2.2 SP2/0瘤細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)

SP2/0瘤細(xì)胞繼續(xù)貼壁培養(yǎng)，經(jīng)AO/EB染色，510 nm熒光顯微鏡下觀察，細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)結(jié)果見圖1A、圖1B和圖1C。

圖1A表示陰性對照組無明顯凋亡細(xì)胞，細(xì)胞仍保持原有的生長形態(tài)，表現(xiàn)為圓形細(xì)胞、細(xì)胞核完整、結(jié)構(gòu)正常、被染成均一綠色、綠色熒光彌散均勾、色澤均一(個別細(xì)胞凋亡可能是由于收集細(xì)胞過程中損傷所致)；圖1B表示陽性對照組出現(xiàn)明顯的凋亡細(xì)胞，大多數(shù)被染成紅色并出現(xiàn)染色體凝集、細(xì)胞核固縮、凋亡小體等凋亡形態(tài)學(xué)特征；圖1C表示1 000.0 μg/mL黃酮組出現(xiàn)明顯大量凋亡細(xì)胞，細(xì)胞體積變小、皺縮狀、橙色，細(xì)胞核裂解等。

A.陰性對照組；B.陽性對照組；C.1 000.0 μg/ mL黃酮A.Negative control group; B.Positive control group; C.1 000.0 μg/mL flavonoids

2.3 SP2/0瘤細(xì)胞凋亡率

SP2/0瘤細(xì)胞為秦艽花黃酮相對敏感細(xì)胞，濃度為1 000 μg/mL時(shí)生長抑制率最大、凋亡形態(tài)明顯。為進(jìn)一步探討秦艽花黃酮誘導(dǎo)SP2/0瘤細(xì)胞凋亡作用的發(fā)生，采用等差法梯度調(diào)整黃酮濃度為250、500、750、1 000 μg/mL，通過Annexin-V/PI雙染法結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)，將活細(xì)胞、早期凋亡細(xì)胞、晚期凋亡細(xì)胞及壞死細(xì)胞區(qū)分開，根據(jù)凋亡散點(diǎn)圖(細(xì)胞凋亡散點(diǎn)圖中，其左上象限(Q1)表示死亡細(xì)胞，右上象限(Q2)表示晚期凋亡或死亡細(xì)胞，左下象限(Q3)表示活細(xì)胞，右下象限(Q4)表示早期凋亡細(xì)胞)，統(tǒng)計(jì)出各自百分比。統(tǒng)計(jì)右上象限(Q2)的晚期凋亡細(xì)胞和右下象限(Q4)的早期凋亡細(xì)胞百分比之和，計(jì)算出3次重復(fù)試驗(yàn)的平均值，獲得秦艽花黃酮對SP2/0瘤細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡率。結(jié)果見表2和圖2。

表2 SP2/0細(xì)胞的凋亡率

A～E.黃酮250 μg/mL、黃酮500 μg/mL、黃酮750 μg/mL、黃酮1 000 μg/mL、陽性藥物A-E.Flavonoids 250 μg/mL,flavonoids 500 μg/mL,flavonoids 750 μg/mL,flavonoids 1 000 μg/mL,positive drug

表2表示，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，陽性藥物組誘導(dǎo)SP2/0細(xì)胞凋亡率達(dá)到64.45%；當(dāng)秦艽花黃酮濃度在250 μg/mL～750 μg/mL范圍內(nèi)遞增時(shí)，細(xì)胞凋亡率呈劑量依賴遞增，分別為42.46%、44.97%和58.27%，750 μg/mL濃度時(shí)細(xì)胞凋亡率達(dá)到最大(58.27%)；陽性藥物組早期凋亡率極顯著(P<0.01)高于秦艽花黃酮各濃度組，隨著秦艽花黃酮濃度的增加，250、500 L、750 μg/mL的3個濃度組早期凋亡細(xì)胞率無顯著性差異(P>0.05)，且均顯著高于1 000 μg/mL濃度組的早期凋亡率(P<0.05)；4個黃酮濃度組晚期凋亡細(xì)胞率均顯著高于陽性藥物組的晚期凋亡率(P<0.05)，且隨著黃酮濃度的增加，250 μg/mL、750 μg/mL濃度組的晚期凋亡率均極顯著高于1 000 μg/mL濃度組(P<0.01)，其中750 μg/mL濃度組的晚期凋亡率達(dá)到42.54%；隨著黃酮濃度的增加，總的細(xì)胞凋亡或死細(xì)胞率在250 μg/mL～750 μg/mL濃度區(qū)間逐漸增加，750 μg/mL濃度最高達(dá)到58.27%。結(jié)合圖2，陽性藥物誘導(dǎo)小鼠骨髓瘤細(xì)胞凋亡率(包括死細(xì)胞)為64.45%，以早期細(xì)胞凋亡明顯(51.00%)；750 μg/mL濃度的秦艽花黃酮誘導(dǎo)小鼠骨髓瘤細(xì)胞凋亡率(包括死細(xì)胞)為58.27%，以晚期細(xì)胞凋亡明顯(42.54%)。

3 討論

3.1 細(xì)胞凋亡及檢測

細(xì)胞凋亡是受基因調(diào)控的一種程序性死亡，以形成細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)皺縮和細(xì)胞核固縮的凋亡小體為顯著形態(tài)特征。目前通常以細(xì)胞生長、形態(tài)學(xué)、凋亡率篩選和評價(jià)藥物體外誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用。CCK-8試劑中含有水溶性四唑，水溶性四唑(2-(2-甲氧基-4-硝基苯)-3-(4-硝基苯)-5-(2，4-二磺基苯)-2 H-四唑單鈉鹽)類似于MTT，在電子耦合劑存在時(shí)很容易被線粒體脫氫酶還原成甲臜染料(formazan)并溶解，培養(yǎng)基呈橙黃色，由于顏色深淺與培養(yǎng)基中活細(xì)胞數(shù)量呈線性關(guān)系，當(dāng)細(xì)胞越多、增殖速度越快，則培養(yǎng)基的顏色越深(反之則顏色越淺)，因而CCK-8法可用于藥物對細(xì)胞進(jìn)行增殖和藥物毒性分析。細(xì)胞凋亡早期，染色質(zhì)、細(xì)胞質(zhì)固縮、細(xì)胞膜完整具有選擇透通性；凋亡后期，核染色質(zhì)裂開并與某些細(xì)胞器聚集，被細(xì)胞膜包圍和分離形成凋亡小體；由于吖啶橙(dye reagent 1，AO)能透過完整的細(xì)胞膜，即透過活細(xì)胞膜并嵌入細(xì)胞核與雙鏈DNA結(jié)合發(fā)出綠色熒光，正?；罴?xì)胞核及處于凋亡早期的細(xì)胞核呈現(xiàn)綠色；溴化乙錠(dye reagent 2，EB)僅能透過受損細(xì)胞膜，嵌入核DNA發(fā)出橘紅色熒光，死亡細(xì)胞及凋亡晚期的細(xì)胞核呈橙色；經(jīng)AO/EB染料染色后，熒光顯微鏡下可觀察到四種細(xì)胞，即活細(xì)胞、早期凋亡細(xì)胞、晚期凋亡細(xì)胞和非凋亡的死亡細(xì)胞，因此AO/EB法可用于對正常細(xì)胞、凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞的形態(tài)區(qū)別。細(xì)胞凋亡早期，細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)的磷脂酰絲氨酸(PS)翻至外側(cè)，早于核染色質(zhì)皺縮，PS與Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白的Annexin V有高度親和力，于凋亡早期細(xì)胞外側(cè)結(jié)合，雖然PS翻轉(zhuǎn)在細(xì)胞壞死中也發(fā)生，但凋亡早期細(xì)胞膜完好而壞死細(xì)胞已被破壞；碘化丙啶(PI)不能通過完整的細(xì)胞膜，但對中晚期凋亡細(xì)胞和死亡細(xì)胞，PI透過透性增加或通過被破壞的細(xì)胞膜進(jìn)入并與細(xì)胞核結(jié)合呈紅色熒光；AnnexinV-FITC與PI聯(lián)合應(yīng)用，由于PI不能染色早期凋亡細(xì)胞和活細(xì)胞，F(xiàn)ITC和PI結(jié)合可同時(shí)染色壞死細(xì)胞和晚期凋亡細(xì)胞，呈雙陽性，在待測細(xì)胞被兩種染色劑處理后，可在凋亡不同時(shí)期呈現(xiàn)不同熒光顏色，借助流式細(xì)胞儀可以將細(xì)胞分為若干亞群，因此AnnexinV-FITC/PI雙染法結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)可用于細(xì)胞凋亡率的檢測。

3.2 秦艽花黃酮誘導(dǎo)瘤細(xì)胞凋亡作用

研究表明，大多數(shù)抗癌藥物都能引起其敏感瘤細(xì)胞凋亡的發(fā)生實(shí)現(xiàn)抗腫瘤效果，如植物多糖、姜黃素、白黎蘆醇等通過死亡受體途徑、線粒體途徑、κB途徑、PI3K/Akt信號途徑等誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生[19-20]。本研究以S180、Hepa1-6、L1210、B16-F10、SP2/0瘤細(xì)胞株為研究對象，CCK-8、AO/EB、Annexin V/PI結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)為研究手段，瘤細(xì)胞形態(tài)、瘤細(xì)胞生長抑制率、瘤細(xì)胞凋亡率為檢測指標(biāo)，研究秦艽花黃酮促腫瘤細(xì)胞凋亡的作用。CCK-8結(jié)合AO/EB研究表明，秦艽花黃酮在低濃度范圍內(nèi)(0.1 μg/mL～100 μg/mL)隨著濃增加，雖然抑制瘤細(xì)胞生長作用下降，但1 000.0 μg/mL高濃度時(shí)對S180、L1210、SP2/0瘤細(xì)胞抑制作用明顯增強(qiáng)，尤其是對SP2/0瘤細(xì)胞的生長抑制率達(dá)36.45%，結(jié)合陽性藥物5-Fu對SP2/0瘤細(xì)胞的生長抑制率(86.91%)顯著高于其他4種瘤細(xì)胞的生長抑制率以及1 000 μg/mL黃酮藥物組SP2/0(AO/EB染色)出現(xiàn)明顯大量凋亡細(xì)胞，細(xì)胞體積變小、皺縮狀、橙色，細(xì)胞核裂解等，選擇SP2/0瘤細(xì)胞作為秦艽花黃酮敏感瘤細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)研究；Annexin V/PI雙染法結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)研究表明，隨著秦艽花黃酮濃度的增加，250、500、750 μg/mL這3個濃度的早期凋亡細(xì)胞率無明顯差異，但晚期細(xì)胞凋亡率均顯著高于5-FU，且隨著黃酮濃度的增加，3個濃度的晚期凋亡率均極顯著高于1 000 μg/mL濃度，其中750 μg/mL濃度的晚期凋亡率達(dá)到42.54%，750 μg/mL濃度的總的細(xì)胞凋亡或死細(xì)胞率達(dá)到58.27%。研究結(jié)果表明，秦艽花黃酮(750 μg/mL)通過誘導(dǎo)SP2/0瘤細(xì)胞晚期凋亡達(dá)到接近陽性藥物5-FU的誘導(dǎo)凋亡作用。

秦艽花黃酮具有誘導(dǎo)SP2/0瘤細(xì)胞凋亡的作用并呈劑量依賴性特點(diǎn)，濃度在750 μg/mL通過誘導(dǎo)晚期瘤細(xì)胞凋亡達(dá)到接近陽性藥物5-FU(主要誘導(dǎo)瘤細(xì)胞早期凋亡)的誘導(dǎo)凋亡效果，為中西藥聯(lián)合用藥治療腫瘤疾病提供了科學(xué)依據(jù)。