微生物發(fā)酵中藥研究進(jìn)展

宋予震，史洪濤，范明夏，夏艷勛，邊傳周，喬宏興

(河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院動(dòng)物醫(yī)藥學(xué)院，河南鄭州 450046)

微生物在自然界廣泛存在，益生菌作為有益微生物在動(dòng)物生產(chǎn)中發(fā)揮著獨(dú)特作用，如提高動(dòng)物生產(chǎn)性能、產(chǎn)生有益代謝產(chǎn)物、提高機(jī)體抗病能力、降低死亡率、調(diào)節(jié)腸道菌群平衡等。中藥是我國(guó)的國(guó)粹，中醫(yī)藥文化博大精深，在畜牧生產(chǎn)上具有治未病、降低耐藥性、減少藥物殘留、綠色環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)。微生物發(fā)酵中藥歷史悠久，因其具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)被廣泛應(yīng)用。隨著現(xiàn)代畜牧業(yè)的發(fā)展，微生物發(fā)酵中藥將會(huì)成為新興的抗生素替代品。

1 微生物發(fā)酵中藥概念及起源

關(guān)于微生物發(fā)酵中藥的歷史源遠(yuǎn)流長(zhǎng)，就是借助微生物作用，在適當(dāng)?shù)慕臃N量、溫度、時(shí)間、濕度等條件下對(duì)中藥進(jìn)行發(fā)酵，一方面中藥在發(fā)酵過程中會(huì)發(fā)生一系列的生化反應(yīng)，從而引起中藥的活性成分發(fā)生改變；另一方面中藥的某些成分通過誘導(dǎo)微生物代謝途徑改變產(chǎn)生新的活性物質(zhì)[1-2]。漢晉時(shí)期，漢醫(yī)經(jīng)典著作《金匱要略》中就出現(xiàn)了關(guān)于發(fā)酵中藥“神曲”的詳細(xì)記載；北魏期間，賈思勰的《齊民要術(shù)》、《肘后方》 等古代醫(yī)學(xué)典籍中就有對(duì)天然發(fā)酵炮制方法及應(yīng)用的描述[3-4]；在倪朱謨的《本草匯言》中也記錄了多種天然發(fā)酵而成的有效中藥，如采云曲、沉香曲、半夏曲、紅曲、建神曲等[5]。中國(guó)古代醫(yī)學(xué)書籍對(duì)發(fā)酵炮制藥物記錄眾多，而被《中國(guó)藥典》收錄的僅有半夏曲、百藥煎、淡豆豉和炒六神曲4種。隨著微生物學(xué)、發(fā)酵中藥學(xué)、基因工程學(xué)等交叉學(xué)科發(fā)展，為傳統(tǒng)微生物發(fā)酵中藥方式引入了新的技術(shù)手段，研究范圍不斷擴(kuò)大。同時(shí)，發(fā)酵所需要的條件、成分檢測(cè)、產(chǎn)品質(zhì)量更加穩(wěn)定可控[5]。鑒于微生物發(fā)酵中藥機(jī)理尚未闡明，而且生物界還有許多有待系統(tǒng)研究的微生物，該領(lǐng)域具有很大的研究空間。因此，將傳統(tǒng)中藥與現(xiàn)代生物發(fā)酵技術(shù)有機(jī)結(jié)合而發(fā)展起來的新型制藥技術(shù)已成為行業(yè)研究的熱點(diǎn)。

2 中藥發(fā)酵后作用的變化

2.1 提高中藥有效成分的利用率

中藥發(fā)揮藥理藥效作用的有效成分主要存在于細(xì)胞間質(zhì)包裹的胞漿和植物細(xì)胞壁中，而細(xì)胞壁是由不同纖維和膠質(zhì)類物質(zhì)組成的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)。因此，在中藥提取過程中需要克服多重阻力，才能將胞漿中的有效活性成分釋放出來[6-7]。微生物酶系種類繁多且酶活力強(qiáng)，主要包括纖維素酶、半纖維素酶、淀粉酶、果膠酶等，這些酶能將植物細(xì)胞壁中的纖維素、半纖維素及果膠等致密結(jié)構(gòu)成分分解利用或轉(zhuǎn)化為其他成分，使植物細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)變疏松，細(xì)胞間隙增大，有效成分釋放阻力減小，易于從細(xì)胞內(nèi)析出，從而極大地簡(jiǎn)化提取步驟，提高中藥提取率[8]。賈艷姝[9]將黃芪經(jīng)保加利亞乳桿菌發(fā)酵，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與黃芪粉煎煮液相比，黃芪發(fā)酵后總黃酮增加了近14%，總皂苷增加了20%以上。結(jié)果表明，黃芪經(jīng)發(fā)酵后能顯著提高有效活性成分的析出率。

2.2 產(chǎn)生新的活性成分

微生物結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，但產(chǎn)酶豐富，具備超強(qiáng)的合成轉(zhuǎn)化功能且能生成大量的次級(jí)代謝產(chǎn)物。在其生長(zhǎng)繁殖和新陳代謝過程中能催化中藥生成多種新物質(zhì)，進(jìn)而產(chǎn)生新的藥理活性。中藥人參在發(fā)酵過程中可將人參皂苷中的大分子糖苷進(jìn)行目的性水解，從而生成具有高效生物活性的小分子苷元和皂苷。例如，紅參浸膏經(jīng)細(xì)腳擬青霉(Paecilomycestenuipes) 發(fā)酵后其中的人參二醇型皂苷能轉(zhuǎn)變?yōu)槿藚⒃碥誇2、Rk1、Rh2、Rg3、Rg5和C-K[10]。張玲等[11]用微生物發(fā)酵鬼針草莖、葉后總黃酮中HPLC指紋圖譜有較明顯的改變，各吸收峰相對(duì)率有較顯著的改變。說明鬼針草莖、葉經(jīng)微生物發(fā)酵后其總黃酮中某些化學(xué)成分發(fā)生了生物轉(zhuǎn)化，其化學(xué)成分的組成有較顯著的變化。

2.3 降低毒副作用

有些中藥在擁有較強(qiáng)生物活性的同時(shí)也具有一定的毒副作用，這在很大程度上限制了中藥的推廣和普及。而采用微生物發(fā)酵的方法可降低中藥的毒性，對(duì)其有毒成分進(jìn)行修飾，或其毒性成分如生物堿類、苷類、毒蛋白類、金屬元素等被微生物分解轉(zhuǎn)化，使毒性降低或消失。朱舟等[12]利用雙向發(fā)酵技術(shù)對(duì)天南星與白僵菌進(jìn)行處理得到抗驚厥力較高、毒性較小的產(chǎn)物，達(dá)到減毒增效的目的。

2.4 增強(qiáng)中藥藥效

中藥成分結(jié)構(gòu)復(fù)雜，很多大分子活性物質(zhì)不能直接被機(jī)體吸收利用。在發(fā)酵過程中，通過微生物強(qiáng)大的分解功能將大分子活性物質(zhì)降解為有效的小分子活性物質(zhì)，有利于透過機(jī)體的屏障系統(tǒng)與相關(guān)細(xì)胞蛋白結(jié)合，從而被機(jī)體吸收利用，提高中藥的作用效果[13]。陳永強(qiáng)等[14]研究證明，β-葡萄糖醛酸酶能將甘草中的甘草酸轉(zhuǎn)化成甘草次酸，從而被消化系統(tǒng)直接吸收利用，使機(jī)體在短時(shí)間內(nèi)達(dá)到較高的血藥濃度，并迅速作用于靶器官，從而發(fā)揮甘草的消炎、止痛作用。

2.5 節(jié)約藥材資源，保護(hù)生態(tài)環(huán)境

經(jīng)提取利用后的中藥藥渣常常被廢棄，不僅浪費(fèi)資源，并且污染環(huán)境。通過益生菌發(fā)酵中藥技術(shù)，以中藥殘?jiān)鳛榕囵B(yǎng)基質(zhì)進(jìn)行發(fā)酵，在滿足微生物營(yíng)養(yǎng)需求的同時(shí)，又能充分釋放中藥的有效成分，產(chǎn)生新的藥理作用，同時(shí)減少中藥殘?jiān)鼘?duì)環(huán)境的污染，在提高中藥資源利用率的同時(shí)降低生產(chǎn)成本。李秀穎等[15]將黃姜藥渣與其他成分混合制成固體發(fā)酵培養(yǎng)基，并添加膠質(zhì)芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌等益生菌進(jìn)行生物發(fā)酵，得到了成本低廉、環(huán)保安全的生物有機(jī)肥料。因此，利用發(fā)酵技術(shù)不僅使藥渣重新被合理利用，避免資源浪費(fèi)，而且還保護(hù)了生態(tài)環(huán)境。

3 中藥微生物發(fā)酵的方式

中藥微生物發(fā)酵方式有固體發(fā)酵、液體發(fā)酵和雙向固體發(fā)酵技術(shù)[16]。固體發(fā)酵是一種相對(duì)完善的發(fā)酵工藝，具有悠久的歷史，其設(shè)備簡(jiǎn)單且操作方便。在自然開放的條件下以單一或多種真菌對(duì)農(nóng)產(chǎn)品或某些中藥材進(jìn)行發(fā)酵。雖然固體發(fā)酵有很多獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，但因其工藝存在一定局限性，比如培養(yǎng)體系開放，發(fā)酵速度慢且缺乏科學(xué)的評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)，很難實(shí)現(xiàn)大規(guī)模批量生產(chǎn)[16]。劉洋等[17]用糞腸球菌等多種復(fù)合菌種對(duì)益母草和王不留行進(jìn)行固體發(fā)酵，并測(cè)定有效活性成分的含量，探索發(fā)酵后中藥活性成分變化情況。結(jié)果顯示，與未發(fā)酵組相比，發(fā)酵后中藥可溶性總黃酮提高了約55%，總生物堿提高了約127%，粗多糖提高了約55%，總皂苷提高了近50%。

液體發(fā)酵時(shí)間短，生產(chǎn)條件易控、生產(chǎn)成本小、易實(shí)現(xiàn)機(jī)械自動(dòng)化、具有工藝擴(kuò)大等優(yōu)點(diǎn)，因而具有廣泛的應(yīng)用前景。但液體發(fā)酵對(duì)發(fā)酵條件及生產(chǎn)工藝要求高，在發(fā)酵過程中污染幾率較大[16]。梅建鳳等[18]將分離到的一株黑曲霉JH-2菌株接種液體培養(yǎng)基并與積雪草粉進(jìn)行液體發(fā)酵，使積雪草苷轉(zhuǎn)化為積雪草酸，與未轉(zhuǎn)化的對(duì)照組相比，質(zhì)量分?jǐn)?shù)提高3.03倍。

20世紀(jì)80年代后期，在固體發(fā)酵基礎(chǔ)之上發(fā)展起來的一種真菌與中藥有機(jī)結(jié)合的發(fā)酵工藝，稱為雙向固體發(fā)酵技術(shù)。是將含有部分活性物質(zhì)的中藥或殘?jiān)c有益菌種進(jìn)行發(fā)酵。在此過程中，一方面中藥材能為真菌提供所需營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，使菌體大量繁殖；另一方面因真菌生長(zhǎng)產(chǎn)生的各種酶的影響，使真菌代謝產(chǎn)物或細(xì)胞因子與中藥材自身結(jié)構(gòu)進(jìn)行互作而改變其原有成分，產(chǎn)生不同的性味功效，從而決定了其具有雙向發(fā)酵性[16]。朱舟等[19]將天南星用白僵菌進(jìn)行固體雙向發(fā)酵，結(jié)果顯示，天南星的形態(tài)和性狀都發(fā)生改變，其毒性大大降低，生品天南星的半數(shù)致死量(LD50)顯著降低。因不同藥用菌的酶體系不同，以及不同藥材品種繁多，成分差異大，實(shí)現(xiàn)真菌與藥材的有機(jī)結(jié)合發(fā)酵還缺乏完整的科學(xué)理論依據(jù)做支撐，仍然需要進(jìn)一步論證，但雙向性發(fā)酵技術(shù)將會(huì)成為中藥發(fā)酵領(lǐng)域的一顆冉冉新星。

4 發(fā)酵中藥存在的問題

目前，利用現(xiàn)代生物科學(xué)技術(shù)對(duì)中藥進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化在畜牧、醫(yī)療保健等行業(yè)已成為研究熱點(diǎn)。通過微生物發(fā)酵中藥能促進(jìn)有效成分的分解轉(zhuǎn)化，在保護(hù)中藥成分免受物理工藝造成破壞的同時(shí)，增強(qiáng)中藥藥效、提高中藥有效成分析出效果[13]。然而，發(fā)酵中藥作為一種新型制劑，在理論研究和生產(chǎn)工藝方面尚不完善。缺乏規(guī)范性的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，如中藥品種繁多、成分復(fù)雜多樣、發(fā)酵機(jī)理不明確、微生物代謝多樣性等都制約著中藥發(fā)酵技術(shù)的發(fā)展，影響發(fā)酵中藥工藝控制和臨床應(yīng)用效果。

4.1 中藥發(fā)酵作用機(jī)理不明確

雖然檢測(cè)技術(shù)越來越先進(jìn)，但中藥成分復(fù)雜，從中藥成分的角度研究發(fā)酵中藥其機(jī)理仍然不清楚。中藥發(fā)酵前后活性物質(zhì)變化較大，但在發(fā)酵過程中究竟轉(zhuǎn)化利用了哪種物質(zhì)，以及產(chǎn)生了哪種新成分還有待進(jìn)一步研究[20]。發(fā)酵中藥的藥理藥效學(xué)研究能更直接說明發(fā)酵工藝對(duì)中藥的影響，未來需要進(jìn)一步的深入研究。

4.2 優(yōu)良發(fā)酵菌種的選擇

菌種是發(fā)酵中藥的重要前提和核心，目前常用于畜牧業(yè)發(fā)酵的菌株主要有芽孢桿菌、乳酸菌、酵母菌和部分霉菌。微生物種類繁多，且產(chǎn)生的酶體系各不相同，微生物代謝利用的物質(zhì)也不盡相同。但并非所有的菌種都適合發(fā)酵，因此根據(jù)不同中藥選擇合適的發(fā)酵菌種，使發(fā)酵后中藥藥效增強(qiáng)、有效成分析出率提高、毒副作用降低、產(chǎn)生新的活性成分，使藥物利用率達(dá)到最大，還需要充分的試驗(yàn)研究論證[20]。例如，在傳統(tǒng)發(fā)酵淡豆豉過程中一般選擇自然菌，而內(nèi)生真菌通過發(fā)酵可能會(huì)產(chǎn)生某些抗癌成分[21-22]。

4.3 發(fā)酵中藥材的選擇

在微生物發(fā)酵過程中并不是所有的中藥都適合發(fā)酵，有研究用芽孢桿菌(Bacilllussubtilis)對(duì)幾十種藥材進(jìn)行生物發(fā)酵，檢測(cè)其抗菌活性的特征。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，并非所有中藥都適合發(fā)酵。連翹、半夏曲、六神曲等藥物通過發(fā)酵活性加強(qiáng)，而大部分藥材的藥效在發(fā)酵后沒有明顯改變，而少數(shù)中藥經(jīng)發(fā)酵后其藥效卻顯著下降，因此需要通過大量的基礎(chǔ)研究篩選中藥作為發(fā)酵原料[20]。

4.4 中藥發(fā)酵工藝參數(shù)的選擇和控制

在微生物發(fā)酵中藥工藝中影響發(fā)酵過程變化的因素有很多，包括物理參數(shù)，如溫度、空氣流量、濁度等；化學(xué)參數(shù)，如pH、產(chǎn)物含量、溶氧量等；生物參數(shù)，如菌體比生長(zhǎng)速率、基質(zhì)消耗速率、關(guān)鍵酶活力、接種量等三大類。怎樣根據(jù)藥材、菌種等特點(diǎn)確定最適發(fā)酵條件與終點(diǎn)，尋找發(fā)酵過程中科學(xué)的觀測(cè)指標(biāo)，在不斷進(jìn)行工藝優(yōu)化中提高生產(chǎn)效率，也是微生物發(fā)酵工藝難點(diǎn)之一[23]。

4.5 中藥發(fā)酵模型的篩選和建立

目前，利用微生物發(fā)酵中藥是提高中藥藥效的有效途徑，但藥材自身特點(diǎn)合適不同發(fā)酵菌種與不同中藥材如何組合是發(fā)酵的關(guān)鍵。通過對(duì)不同發(fā)酵菌、發(fā)酵產(chǎn)物以及中藥有效成分進(jìn)行研究來篩選不同中藥材和不同發(fā)酵菌種組合進(jìn)行發(fā)酵，在大幅度減少成本的同時(shí)還增加中藥藥效，是未來中藥發(fā)酵的新途徑，可實(shí)現(xiàn)中藥與微生物最優(yōu)組合的應(yīng)用[20]。

5 發(fā)酵中藥在動(dòng)物生產(chǎn)上的應(yīng)用

發(fā)酵中藥是益生菌、中藥和代謝產(chǎn)物的組合，根據(jù)目前養(yǎng)殖業(yè)規(guī)?；?、集約化的發(fā)展趨勢(shì)，發(fā)酵中藥以“治未病”為原則，通過增強(qiáng)動(dòng)物的生理機(jī)能和免疫力，達(dá)到提高動(dòng)物生產(chǎn)性能、不發(fā)病或少發(fā)病的目的。

喬宏興等[24]在肉雞飼料中添加適量的發(fā)酵黃芪進(jìn)行飼喂。結(jié)果顯示，與黃芪組相比，肉雞平均日增重顯著升高，料肉比下降。且血清中谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)、過氧化氫酶(catalase,CAT)和超氧化物歧化酶總活力(tatol superoxide dismutase,T-SOD)活性升高，進(jìn)而增強(qiáng)肉雞的抗氧化水平，因此發(fā)酵黃芪能改善肉雞生產(chǎn)性能和抗氧化機(jī)能。史同瑞等[25]在蛋雞日糧中添加2 g/kg的解淀粉芽孢桿菌SSY1株發(fā)酵黃芪，結(jié)果發(fā)現(xiàn)能提高蛋雞的綜合產(chǎn)蛋率，提高蛋重，降低料蛋比，改善雞蛋品質(zhì)，增強(qiáng)蛋雞的抗氧化性能，提高蛋雞健康水平。

趙圣振等[26]用植物乳桿菌和屎腸球菌混合固體發(fā)酵黃芪樣品，以不同量添加于35日齡斷奶仔豬基礎(chǔ)日糧進(jìn)行飼喂，結(jié)果表明，與抗生素組相比，料肉比下降約6%(P<0.05)，日增重提高近20%(P<0.05)，采食量增加約12%(P<0.05)，IgA和IgG分別提高約22%(P<0.05)和30%(P<0.05)。韓宇等[27]給斷奶仔豬飼喂添加發(fā)酵黃芪的基礎(chǔ)日糧，發(fā)現(xiàn)與空白對(duì)照組相比，發(fā)酵制劑能有效提高豬只日增重、增強(qiáng)機(jī)體抗病力；與抗生素對(duì)照組相比，發(fā)酵制劑能顯著改善仔豬健康狀況，降低仔豬腹瀉率，提高成活率。

6 展望

隨著畜牧業(yè)的發(fā)展，限抗、禁抗工作正有力推進(jìn)，尋找一種綠色、安全、高效的抗生素替代品是畜牧業(yè)的重要研究方向。益生菌發(fā)酵中藥是借助于微生物在一定條件下對(duì)中藥進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，提高中藥藥效。同時(shí)，微生物在代謝過程中能產(chǎn)生豐富的代謝產(chǎn)物，維持腸道菌群平衡，提高動(dòng)物機(jī)體的健康度。此外，益生菌發(fā)酵中藥安全高效、綠色環(huán)保的優(yōu)點(diǎn)奠定了其在畜牧生產(chǎn)中廣泛應(yīng)用的基礎(chǔ)。益生菌發(fā)酵中藥將會(huì)成為抗生素的首選替代品。