通腎顆粒的亞慢性毒性試驗(yàn)

王 軍，王雅倩，侯會霞，邊小利，王虹雅，陳胡羚，張芬芳，4，孫 蓉，李引乾*

(1.陜西漢中市動物疾病預(yù)防控制中心，陜西漢中 723000；2.西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院,陜西楊凌 712100；3.陜西省府谷縣麻鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)工作站，陜西府谷 7194003；4.陜西省眉縣畜牧獸醫(yī)工作站，陜西眉縣 722300)

腎炎(nephritis)是臨床上以水腫、腎區(qū)疼痛、尿量改變、尿液含有多量上皮細(xì)胞和管型為特征的腎小球、腎小管或腎臟間質(zhì)組織發(fā)生炎癥的病理過程[1]。發(fā)病多與感染、毒物刺激和變態(tài)反應(yīng)有關(guān)[2]。臨床治療以消炎利尿、抑制免疫反應(yīng)和清熱利濕、止血涼血為主[3-4]。通腎顆粒由黃芪、苦參、白茅根、金銀花等中藥組成，具有可清熱燥濕，清熱利尿和清熱解毒之功效，臨床上用于治療以水腫、尿少、尿血、腰部疼痛等為主癥的腎炎。為考察通腎顆粒的安全性，根據(jù)《獸藥試驗(yàn)技術(shù)規(guī)范匯編》[5]中有關(guān)獸藥亞慢性毒性試驗(yàn)的要求進(jìn)行本試驗(yàn)，以評價(jià)通腎顆粒的安全性，為進(jìn)一步制定臨床試驗(yàn)給藥方案提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 SD大鼠共100只，雌雄各半，初始體重200 g～240 g，購自成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動物中心。動物于試驗(yàn)前均觀察7 d，臨床檢查健康者即用于試驗(yàn)。

1.1.2 藥品與試劑 通腎顆粒(主要成分為黃芪、苦參、白茅根和金銀花等)(批號：20181011)，河南惠通天下生物工程有限公司提供；二甲苯(批號：20171210)，廣東省化學(xué)試劑工程技術(shù)研究工發(fā)有限公司產(chǎn)品；無水乙醇(批號：20171028)，廣東光華化學(xué)廠有限公司產(chǎn)品；甲醛(批號：20171125)，天津博迪化工股份有限公司產(chǎn)品；石蠟(批號：20171022)，撫順東科蠟業(yè)有限公司產(chǎn)品；蘇木精(批號20170825)、伊紅(批號：20171115)，上?；瘜W(xué)試劑站分裝廠；丙酮(批號：20171125)，天津博迪化工股份有限公司產(chǎn)品；真空血樣采集容器(EDTA-K2)(批號：20180101)，江蘇康捷醫(yī)療器械有限公司產(chǎn)品；真空血樣采集容器(肝素鈉)(批號：20180201)，江蘇康捷醫(yī)療器械有限公司；生理鹽水(批號：D161201121)，山東科倫藥業(yè)有限公司產(chǎn)品；尿素氮測定試劑盒(批號：339101)、肌酐測定試劑盒(批號：262609)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶測定試劑盒(批號：797231)、γ谷氨酰轉(zhuǎn)移酶測定試劑盒(批號：654263)、葡萄糖測定試劑盒(批號：245460)、總蛋白測定試劑盒(批號：230433)、白蛋白測定試劑盒(批號：245621)，日本富士膠片株式會社。

1.1.3 儀器設(shè)備 FUJIFILM DRI-CHEM4000ie干式生化分析儀，日本富士膠片株式會社產(chǎn)品；Sysmex XT-1800i全自動血細(xì)胞分析儀，日本東亞公司產(chǎn)品；TDZ5臺式低速離心機(jī)，湖南赫西儀器裝備有限公司產(chǎn)品；FA1204B電子天平，上海精科實(shí)業(yè)有限公司產(chǎn)品；精密旋轉(zhuǎn)切片機(jī)，美國AO公司產(chǎn)品；XSZ-4U生物顯微鏡，重慶麥克光電儀器有限公司產(chǎn)品；MOTIC顯微鏡，麥克奧迪公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)分組 將100只SD大鼠隨機(jī)分為4組，3個(gè)試驗(yàn)組和1個(gè)對照組，3個(gè)試驗(yàn)組分別為通腎顆粒高、中、低劑量組，對照組為生理鹽水組[6]。

1.2.2 給藥劑量及給藥途徑 現(xiàn)用現(xiàn)配，用溫開水沖入通腎顆粒藥中使其溶解，按試驗(yàn)組梯度及大鼠體重灌胃給藥。試驗(yàn)組高、中、低劑量組的劑量分別為12、6、3 g/kg，根據(jù)大鼠體重以1 mL/100 g適量給藥。對照組同樣按體重使用等體積的生理鹽水每日灌胃給予。試驗(yàn)期為6周，期間連續(xù)給藥，每周定時(shí)早上7：00時(shí)稱量體重1次，隨大鼠體重變化適時(shí)當(dāng)周調(diào)整給藥劑量，停藥后正常飼喂繼續(xù)觀察2周[7]。

1.2.3 觀察指標(biāo)

1.2.3.1 一般健康狀況 試驗(yàn)期間，每日定時(shí)，間隔3 h～6 h觀察大鼠的行為、精神狀態(tài)、飲水量、采食量、糞便、發(fā)病及死亡等情況。若有大鼠死亡，及時(shí)記錄并進(jìn)行病理學(xué)檢查[8-9]。

1.2.3.2 體重 分別于試驗(yàn)的第0、1、2、3、4、5、6周早晨空腹逐只稱量體重，計(jì)算組間差異。

1.2.3.3 血液學(xué)指標(biāo)和血清生化指標(biāo)測定 參照文獻(xiàn)[10]，于末次給藥后24 h和停藥2周后分別每組各取10只大鼠(雌雄各5只)，麻醉后，立即切開小鼠下腹部從下腔靜脈采血于加有EDTA的抗凝管中，應(yīng)用Sysmex XT-1800i全自動血細(xì)胞分析儀分析血液中的紅細(xì)胞(RBC)、白細(xì)胞(WBC)和血紅蛋白(Hb)。同時(shí)采集血液于離心管中，自然凝固，離心，分離血清，用血液生化分析儀測定以下血清生化指標(biāo)：總蛋白(TP)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、尿素氮(BUN)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、肌酐(Cr)、總膽固醇(TC)、血糖(GLU)、白蛋白(ALB)。

1.2.3.4 臟器系數(shù) 參照文獻(xiàn)[11]，試驗(yàn)結(jié)束后，當(dāng)日處死動物，稱量大鼠體重，取心、肝、脾、肺、腎，并稱取重量，計(jì)算臟器系數(shù)。臟器系數(shù)=臟器重量/體重×100。

1.2.3.5 病理學(xué)檢查 大鼠采血后實(shí)施安樂死后進(jìn)行剖檢，觀察主要臟器有無眼觀可見的病理學(xué)變化，按常規(guī)方法制備記錄結(jié)果。取心、肝、脾、肺、腎，各取保留特征區(qū)域的約拇指大小規(guī)則塊，加以100 mL/mL中性福爾馬林固定，進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋和切片，HE染色，光鏡下觀察[12-13]。

2 結(jié)果

2.1 體重變化結(jié)果

在6周試驗(yàn)期間，持續(xù)觀察顯示，試驗(yàn)組高、中、低劑量組與對照生理鹽水組的大鼠無論雌雄均狀態(tài)良好，精神正常，被毛整齊，活動自如，食欲旺盛，代謝正常，未出現(xiàn)中毒和死亡。各組大鼠體重變化見表1、表2。

由表1和表2可見，試驗(yàn)期間，每日持續(xù)灌服通腎顆粒，每周對大鼠體重進(jìn)行稱量，試驗(yàn)組大鼠與對照組大鼠體重表現(xiàn)出了不同的變化。雄性大鼠結(jié)果顯示，通腎顆粒高劑量組在第4周開始直到第6周試驗(yàn)結(jié)束，體重與對照組存在差異，表現(xiàn)為差異顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)，而中劑量組從第4周開始，與生理鹽水組相比差異極顯著(P<0.01)，而低劑量組在整個(gè)試驗(yàn)期間(6周)與生理鹽水組差異均不顯著(P>0.05)。雌性大鼠結(jié)果顯示，高劑量和中劑量組在試驗(yàn)期間基本與對照生理鹽水組差異不顯著(P>0.05)，低劑量組雌性大鼠從第2周開始與生理鹽水組差異顯著(P<0.05)。高、中劑量組通腎顆粒對雄性大鼠的生長有一定的抑制作用，高劑量組對雌性大鼠的生長有一定的抑制作用。

表1 試驗(yàn)期間各組雄性大鼠體重變化

表2 試驗(yàn)期間各組雌性大鼠體重變化

2.2 血液學(xué)和生化指標(biāo)測定結(jié)果

持續(xù)灌胃6周后得到血液學(xué)和生化指標(biāo)測定結(jié)果見表3和表4。

由表3可見，通腎顆粒給藥6周后對高、中、低和對照組雄性大鼠和雌性大鼠的紅細(xì)胞數(shù)、血紅蛋白含量和白細(xì)胞總數(shù)的差異均不顯著(P>0.05)。

表3 給藥6周后對各劑量組大鼠血液學(xué)指標(biāo)的影響

由表4可見，通腎顆粒給藥6周后對高、中、低劑量組和對照組雄性大鼠和雌性大鼠的TP、ALT、BUN、AST、Cr、GLU、ALB均差異不顯著(P>0.05)，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

停藥2周后血液學(xué)和生化指標(biāo)測定結(jié)果見表5和表6。

由表5可見，通腎顆粒停藥2周后對高、中、低劑量組和對照組的雄性大鼠和雌性大鼠紅細(xì)胞數(shù)、血紅蛋白含量和白細(xì)胞總數(shù)均差異不顯著(P>0.05)。

表5 停藥2周后對各劑量組大鼠血液學(xué)指標(biāo)的變化

由表6可見，通腎顆粒停藥2周后高、中、低劑量組和對照組雄性大鼠和雌性大鼠的ALT、AST、GLU、TP、ALB、BUN、CR差異均不顯著(P>0.05)，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表6 停藥2周后對各劑量組大鼠生化指標(biāo)的影響

2.3 大鼠臟器系數(shù)測定結(jié)果

臟器系數(shù)試驗(yàn)結(jié)果見表7。由表7可見，為期6周的灌胃，并沒有對大鼠的臟器系數(shù)造成影響。通腎顆粒對雄性與雌性大鼠的高、中、低劑量組、對照組的各個(gè)器官的臟器系數(shù)均沒有顯著差異(P>0.05)，說明通腎顆粒在中長期試驗(yàn)中不會對大鼠的臟器產(chǎn)生負(fù)面作用。

表7 通腎顆粒對各劑量大鼠臟器系數(shù)的影響

2.4 病理學(xué)檢查結(jié)果

試驗(yàn)結(jié)束，對3個(gè)試驗(yàn)組和對照組大鼠剖檢后，分離采集其主要臟器，包括心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟等器官，肉眼觀察無明顯的病理變化。分別取試驗(yàn)組和對照組中雌、雄大鼠心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟等器官特征性組織部位，制成切片，置于顯微鏡下觀察，未發(fā)現(xiàn)各器官的病理變化。心肌纖維呈束，無斷裂；肝細(xì)胞無明顯腫大、壞死等變化；脾臟結(jié)構(gòu)清晰，無組織病變；肺臟結(jié)構(gòu)清楚，肺泡清晰可見；腎臟組織結(jié)構(gòu)正常，腎小球和腎小管形態(tài)正常，且間質(zhì)細(xì)胞未見增生現(xiàn)象(圖1)。

圖1 大鼠病理組織學(xué)觀察

3 討論

亞慢性毒性是指人或動物連續(xù)較長時(shí)間接觸較大劑量的化學(xué)物所出現(xiàn)的中毒效應(yīng)，用以觀察較長時(shí)期毒性作用性質(zhì)和確定毒物的靶器官。本試驗(yàn)中，將通腎顆粒連續(xù)灌胃SD大鼠6周后，觀察各組大鼠的一般性指標(biāo)和生理生化指標(biāo)，以及中毒癥狀、動物體重變化、生活規(guī)律觀察、精神狀態(tài)、血液指標(biāo)與生化指標(biāo)檢測、尸檢、臟器系數(shù)、器官組織學(xué)檢查等。研究表明大鼠在持續(xù)服用通腎顆粒期間，生活規(guī)律、毛發(fā)、習(xí)慣、狀態(tài)、尿液、糞便等一般性指標(biāo)均無異常；血液指標(biāo)與生化指標(biāo)、體重變化、臟器系數(shù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果為血常規(guī)、血液生化的數(shù)值各組差異不顯著(P>0.05)，試驗(yàn)組和對照組體重存在顯著差異(P<0.01)，臟器系數(shù)的數(shù)值各組差異不顯著(P>0.05)。綜合研究結(jié)果，表明通腎顆粒對大鼠的血液指標(biāo)、生化指標(biāo)和臟器無明顯影響。但若長期大量使用，會對雄性、雌性大鼠的生長造成一定的抑制作用。

通腎顆粒亞慢性毒性試驗(yàn)結(jié)果顯示，通腎顆粒對于SD大鼠的生活狀態(tài)、血常規(guī)和生化指標(biāo)以及內(nèi)臟器官等均無影響。表明該藥物毒性低，安全性高，在臨床上具有一定的推廣應(yīng)用價(jià)值。