豬瘟病毒實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立及初步應(yīng)用

楊 峰，陳立強(qiáng) ，許信剛，張為民*，張 琪*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌 712100；2.安康學(xué)院現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生物科技學(xué)院，陜西安康 725000)

豬瘟病毒(Classical swine fever virus，CSFV)屬于黃病毒科瘟病毒屬，感染豬機(jī)體后會(huì)導(dǎo)致豬瘟，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)將豬瘟列為必須報(bào)告的動(dòng)物傳染病之一，我國(guó)將其列為一類(lèi)動(dòng)物疫病[1]。CSFV感染豬不分年齡、性別和品種，四季均可發(fā)生，哺乳仔豬和保育仔豬發(fā)病率較高，成年豬長(zhǎng)期帶毒、排毒，形成垂直和水平傳播，在豬場(chǎng)反復(fù)循環(huán)。我國(guó)除西藏等地外，其他地區(qū)時(shí)有CSF發(fā)生的報(bào)道，給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[2-3]。

自20世紀(jì)90年代以來(lái)，隨著我國(guó)對(duì)豬瘟疫苗的大面積使用，豬瘟常呈非典型的溫和臨床經(jīng)過(guò)，以及長(zhǎng)期的隱性帶毒感染，這給臨床診斷造成了較大的困難[4]。因此，臨床上常借助反轉(zhuǎn)錄PCR(reverse transcription PCR，RT-PCR)方法檢測(cè)CSFV，然而,常規(guī)的RT-PCR方法在靈敏度和重復(fù)性以及病毒含量測(cè)定等方面存在一些不足。實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR)因具有操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、重復(fù)性好、耗時(shí)短、結(jié)果量化等優(yōu)點(diǎn)，逐漸在實(shí)驗(yàn)室對(duì)CSFV檢測(cè)中得到了廣泛的應(yīng)用[5-8]，其中SYBR Green熒光染料法RT-qPCR比探針?lè)ㄙM(fèi)用較低，故得到較普遍的使用，但其存在染料重分布等缺點(diǎn)，而飽和熒光染料Eva Green解決了這一問(wèn)題。本研究針對(duì)NCBI中登錄的豬瘟病毒的E2基因設(shè)計(jì)特異性引物，建立基于Eva Green熒光染料的 RT-qPCR檢測(cè)方法，以期為CSFV的臨床檢測(cè)提供一種特異、靈敏、快速及量化的方法，能夠高效、快速地的檢出早期感染和隱性帶毒者，為豬瘟防控與凈化提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 毒株和菌株 豬瘟病毒(CSFV)、豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)、豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovirus 2，PCV2)和豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)，西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室分離保存；感受態(tài)細(xì)胞DH5α大腸埃希氏菌，購(gòu)自康維世紀(jì)生物科技公司。

1.1.2 待檢組織或病料 31份病料來(lái)自陜西省不同地區(qū)規(guī)?；B(yǎng)豬場(chǎng)臨床剖檢疑似感染CSFV豬的扁桃體、淋巴結(jié)和脾臟等，每頭豬的各種組織混合為1份病料。

1.1.3 主要試劑 DNA Marker DL2 000和2×TaqMaster Mix，康維世紀(jì)生物科技公司產(chǎn)品；Trizol試劑、RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，天根生化科技公司產(chǎn)品；EasyPure Quick Gel Extraction Kit、pEAST-T1克隆試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒，全式金生物公司產(chǎn)品；2×Eva Green Premix，ABM生物科技公司產(chǎn)品。

1.1.4 主要儀器 實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(TL988)，西安天隆生物儀器有限公司;高速冷凍離心機(jī)(D3024R)，美國(guó)貝克曼股份有限公司產(chǎn)品；立式壓力蒸汽滅菌器(LS-50HJ)，江陰濱江醫(yī)療設(shè)備有限公司產(chǎn)品；凝膠成像分析系統(tǒng)(Geno Sens1800)，北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司產(chǎn)品；電子天平(DTC)，亞津電子科技公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)及合成 參考NCBI中登錄的豬瘟病毒的E2基因序列(EF683623.1，F(xiàn)J598612.1，DQ907718.1等)，分析其保守序列，用Primer 5軟件設(shè)計(jì)一對(duì)引物。所設(shè)計(jì)的熒光定量特異性上、下游引物序列分別為CSFV-F：5'- TTTACCCACTTCCGTGACATT -3'，CSFV-R：5'- GACACCCGTCCACCCTATT -3'，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為190 bp。引物由西安擎科澤西生物公司合成并稀釋至10 μmol/L，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 CSFV RNA的提取及逆轉(zhuǎn)錄 取保存的病毒液200 μL，加1 mL Trizol試劑，使用Trizol法提RNA，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，得到的cDNA置 -20℃存儲(chǔ)或進(jìn)行普通RT-PCR。

1.2.3 RT-PCR擴(kuò)增 反應(yīng)體系50 μL：2×TaqMaster Mix、模板、上游引物、下游引物分別為25 μL、6 μL、4 μL、4 μL，雙蒸水補(bǔ)足。反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 25 s，56 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，共30個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。

1.2.4 RT-qPCR陽(yáng)性質(zhì)粒及標(biāo)準(zhǔn)模板制備 按照膠回收試劑盒回收1.2.3擴(kuò)增的目的片段，并將其按照pEAST-T1克隆試劑盒構(gòu)建重組質(zhì)粒菌。重組質(zhì)粒菌經(jīng)常規(guī)PCR鑒定為陽(yáng)性后，將重組質(zhì)粒菌中的陽(yáng)性質(zhì)粒按照試劑盒的操作步驟提取，進(jìn)行測(cè)序分析。用超微量光譜分析儀測(cè)定陽(yáng)性質(zhì)粒濃度，按照以下公式將濃度轉(zhuǎn)化為拷貝數(shù)，然后進(jìn)行10-1～10-9的梯度稀釋。稀釋后的質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)模板，置-20 ℃保存?zhèn)溆??？截悢?shù)(copies/μL)=C×NA/MW，式中C為陽(yáng)性質(zhì)粒測(cè)定的濃度，單位為ng/μL，NA取值為6.02×1023copies/mol，MW為平均分子量，單位為Dolton。

1.2.5 RT-qPCR擴(kuò)增 反應(yīng)體系10 μL：2×Eva Green Premix、標(biāo)準(zhǔn)模板、上游引物、下游引物分別為5 μL、1 μL、0.3 μL、0.3 μL，ddH2O補(bǔ)足。反應(yīng)條件：95 ℃ 10 min：95 ℃ 3 s，60 ℃ 30 s，采集熒光信號(hào)，35個(gè)循環(huán)。

1.2.6 RT-qPCR反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)建立 選取濃度稀釋了10-2～10-8的標(biāo)準(zhǔn)模板為模板，以雙蒸水為陰性對(duì)照模板，進(jìn)行RT-qPCR擴(kuò)增。結(jié)果以RT-qPCR儀自帶軟件分析繪制擴(kuò)增曲線(xiàn)、標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)和熔解曲線(xiàn)。

1.2.7 RT-qPCR特異性試驗(yàn) 用建立的RT-qPCR方法分別檢測(cè)PEDV、PCV2、PRV、PRRSV的cDNA或者DNA，驗(yàn)證建立的RT-qPCR方法的特異性。

1.2.8 RT-qPCR靈敏性試驗(yàn) 選取濃度稀釋了10-7～10-10的標(biāo)準(zhǔn)模板為陽(yáng)性模板，以雙蒸水為陰性對(duì)照模板，進(jìn)行RT-qPCR方法。選取濃度稀釋了10-6～10-9的標(biāo)準(zhǔn)模板為陽(yáng)性模板，以雙蒸水為陰性對(duì)照模板，進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增，將所得結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，比較兩種方法的靈敏度。

1.2.9 RT-qPCR重復(fù)性試驗(yàn) 以同一批次不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)模板和不同批次不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)模板為陽(yáng)性模板，以雙蒸水為陰性對(duì)照模板，進(jìn)行RT-qPCR擴(kuò)增，分別計(jì)算組內(nèi)和組間變異系數(shù)。

1.2.10 臨床樣本的檢測(cè) 取疑似CSFV感染的病料，加適量PBS研磨，將研磨液凍融3次后提取RNA并反轉(zhuǎn)錄，得到的cDNA做待測(cè)樣本，以標(biāo)準(zhǔn)模板做陽(yáng)性對(duì)照模板，以ddH2O為陰性對(duì)照模板，用所建立的RT-qPCR檢測(cè)，然后將RT-qPCR檢測(cè)為陽(yáng)性的樣品進(jìn)行常規(guī)RT-PCR檢測(cè)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果進(jìn)行比較。

2 結(jié)果

2.1 常規(guī)RT-PCR對(duì)豬瘟病毒E2基因的擴(kuò)增

對(duì)CSFV E2基因進(jìn)行常規(guī)RT-PCR擴(kuò)增，結(jié)果與預(yù)期大小一致，目的片段為190 bp，而且無(wú)雜帶(圖1)，說(shuō)明提取并逆轉(zhuǎn)錄得到的為CSFV的cDNA，且設(shè)計(jì)的引物可作為檢測(cè)CSFV的特異性引物，可以進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000;1.CSFV RT-PCR產(chǎn)物；2.陰性對(duì)照

2.2 重組陽(yáng)性質(zhì)粒常規(guī)PCR鑒定

將菌液用熒光定量特異性引物進(jìn)行常規(guī)PCR檢測(cè)，結(jié)果為190 bp目的片段(圖2)。將鑒定為陽(yáng)性的質(zhì)粒測(cè)序，通過(guò)Blast比對(duì)，結(jié)果同源性達(dá)99%，說(shuō)明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000;1.陽(yáng)性質(zhì)粒普通PCR產(chǎn)物；2.陰性對(duì)照M.DNA Marker DL 2 000;1.PCR products of positive plasmids;2.Negative control

2.3 RT-qPCR標(biāo)準(zhǔn)模板的制備

用超微量光譜分析儀測(cè)定提取質(zhì)粒的濃度為110.5 ng/μL，OD260/OD280值為1.885，計(jì)算得拷貝數(shù)為2.447×1010copies/μL，將其稀釋至濃度分別為2.447×109、2.447×108、2.447×107、2.447×106、2.447×105、2.447×104、2.447×103、2.447×102、2.447×101、2.447×100copies/μL，置-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 RT-qPCR反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)建立

RT-qPCR 標(biāo)準(zhǔn)模板的擴(kuò)增曲線(xiàn)如圖3所示，相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)如圖4所示，其熔解曲線(xiàn)如圖5所示。在2.447×102copies/μL～2.447×108copies/μL的濃度區(qū)間內(nèi)，所得拷貝數(shù)(x)與Ct值(y)的線(xiàn)性方程為y=-3.285+36.158x，線(xiàn)性相關(guān)系數(shù)R2=1.000，顯示了良好的線(xiàn)性關(guān)系。熔解曲線(xiàn)峰型單一，無(wú)雜峰，熔解溫度一致， Tm=83.5 ℃。

1～7.2.447×108 copies/μL～2.447×102 copies/μL；NC.陰性對(duì)照1-7.RT-qPCR amplification curve of 2.447×108 copies/μL to 2.447×102 copies/μL；NC.Negative control

圖4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

圖5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR熔解曲線(xiàn)

2.5 RT-qPCR特異性試驗(yàn)

分別以PEDV、PCV2、PRV和PRRSV的cDNA或者DNA為反應(yīng)模板，用建立的RT-qPCR方法擴(kuò)增，結(jié)果表明只有CSFV有熒光信號(hào)(圖6)，熔解曲線(xiàn)峰型單一，無(wú)雜峰，熔解溫度為83.5 ℃(圖7)，說(shuō)明所建立的RT-qPCR特異性好。

圖6 RT-qPCR特異性試驗(yàn)擴(kuò)增曲線(xiàn)

圖7 RT-qPCR特異性試驗(yàn)熔解曲線(xiàn)

2.6 RT-qPCR靈敏性試驗(yàn)

以2.447×103copies/μL～2.447×100copies/μL的標(biāo)準(zhǔn)模板為反應(yīng)模板，進(jìn)行RT-qPCR方法擴(kuò)增。以 2.447×104copies/μL～2.447×101copies/μL的標(biāo)準(zhǔn)模板作為反應(yīng)模板，進(jìn)行普通PCR擴(kuò)增。結(jié)果表明，RT-qPCR檢測(cè)的拷貝數(shù)最低為2.447×101copies/μL(圖8)，普通PCR檢測(cè)的拷貝數(shù)最低為2.447×103copies/μL(圖9)，說(shuō)明建立的RT-qPCR檢測(cè)方法比普通RT-PCR靈敏性提高100倍。

1～4.2.447×103 copies/μL～2.447×100 copies/μL;NC.陰性對(duì)照1-4.RT-qPCR amplification curve of 2.447×103 copies/μL to 2.447×100 copies/μL;NC. Negative control

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000;1～4. 2.447×104 copies/μL～2.447×101 copies/μL；NC.陰性對(duì)照M.DNA Marker DL 2 000;1-4.2.447×104 copies/μL to 2.447×101 copies/μL;NC.Negative control

2.7 RT-qPCR重復(fù)性試驗(yàn)

以2.447×106、2.447×106、2.447×104copies/μL的標(biāo)準(zhǔn)模板為反應(yīng)模板，每個(gè)模板做3個(gè)重復(fù)，進(jìn)行組內(nèi)重復(fù)試驗(yàn)(表1)，每隔1周做1次，每次做3個(gè)重復(fù)，計(jì)算平均值，做3次，進(jìn)行組間重復(fù)試驗(yàn)(表2)。結(jié)果顯示，建立的RT-qPCR的變異系數(shù)小于1.5%，其重復(fù)性表現(xiàn)優(yōu)異。

表1 RT-qPCR組內(nèi)重復(fù)試驗(yàn)

表2 RT-qPCR組間重復(fù)試驗(yàn)

2.8 檢測(cè)方法的初步應(yīng)用

用普通RT-PCR和建立的RT-qPCR對(duì)懷疑CSFV感染的31份臨床病料進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果用普通RT-PCR檢出25份陽(yáng)性，RT-qPCR檢測(cè)出29份陽(yáng)性(包括普通RT-PCR檢出25份陽(yáng)性在內(nèi))，RT-qPCR比普通RT-PCR多檢出4份。

3 討論

目前，我國(guó)豬瘟由大規(guī)模暴發(fā)轉(zhuǎn)變?yōu)樯l(fā)或地方流行，臨床上由典型癥狀轉(zhuǎn)變?yōu)榉堑湫桶Y狀、隱性帶毒、持續(xù)感染。因此，通過(guò)分子生物學(xué)技術(shù)檢測(cè)手段對(duì)早期感染和隱性帶毒者高效、快速的檢出，就可以為豬瘟防控與凈化提供一定的幫助。分子生物學(xué)檢測(cè)方法主要有常規(guī)RT-PCR、套式RT-PCR、多重RT-PCR及實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR,其中用熒光標(biāo)記方法檢測(cè)特異性產(chǎn)物的RT-qPCR技術(shù)，因其靈敏度高、重復(fù)性好、定量準(zhǔn)確、耗時(shí)短、過(guò)程封閉等眾多優(yōu)點(diǎn)，逐漸在病原體檢測(cè)、目的基因表達(dá)量、疫苗質(zhì)量控制等方面得到廣泛的使用[9]。

RT-qPCR有熒光染料法和Taqman探針?lè)▋煞N，由于Taqman探針?lè)ㄏ鄬?duì)熒光染料法比較昂貴，因此使用最多的是熒光染料法，其中SYBR熒光法使用的最普遍，然而該熒光是一種不飽和熒光，在濃度高的時(shí)候會(huì)對(duì)PCR的擴(kuò)增過(guò)程產(chǎn)生一定的抑制，所以在使用時(shí)加入的量相對(duì)較小，這樣又會(huì)致使DNA的雙鏈位點(diǎn)不能被熒光染料充分的全部結(jié)合。但是Eva Green與此不同，它是飽和熒光染料，沒(méi)有非飽和染料“染料重排”的缺點(diǎn)，制作的熔解曲線(xiàn)分辨率相對(duì)較高，而且其可以在擴(kuò)增過(guò)程當(dāng)中及時(shí)地從DNA雙鏈中釋放出來(lái)，從而降低了對(duì)PCR擴(kuò)增過(guò)程的影響，因此使用Eva Green染料定量，比使用SYBR染料準(zhǔn)確性高[10]。故此，本研究選取Eva Green作為RT-qPCR的熒光染料。

因?yàn)闊晒馊玖夏軌虮唤Y(jié)合到任何脫氧核糖核酸的雙鏈間，所以RT-qPCR熒光染料法的引物在設(shè)計(jì)時(shí)要認(rèn)真考慮長(zhǎng)度、退火溫度、保守性、二聚體、發(fā)夾結(jié)構(gòu)等方面的問(wèn)題，尤其是其中的引物二聚體和發(fā)夾結(jié)構(gòu)問(wèn)題，其關(guān)系到定量的準(zhǔn)確性[11]。在試驗(yàn)時(shí)，還要注意做好防污染工作，盡管試驗(yàn)操作比較簡(jiǎn)單，但操作中的污染如氣溶膠的污染會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性的結(jié)果；在制作標(biāo)準(zhǔn)模板時(shí)，要使陽(yáng)性質(zhì)粒完全混合均勻，以此保證標(biāo)準(zhǔn)模板的濃度梯度正確性。以上方面考慮的越周全，得到的結(jié)果越穩(wěn)定，越可靠。

國(guó)內(nèi)流行的豬瘟病毒基因型以基因2群和1群為主[12]，其中CSFV E2基因的蛋白對(duì)病毒毒力影響很大[13]，因此本研究選擇CSFV E2基因的保守序列，設(shè)計(jì)了一對(duì)用于RT-qPCR擴(kuò)增目的片段為190 bp的特異性引物，構(gòu)建陽(yáng)性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)模板，將Eva Green作為信號(hào)報(bào)告熒光。結(jié)果表明，建立的CSFV RT-qPCR檢測(cè)方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)線(xiàn)性關(guān)系良好，各梯度標(biāo)準(zhǔn)模板擴(kuò)增效率一致，熔解曲線(xiàn)峰型單一。本研究建立的CSFV RT-qPCR檢測(cè)方法特異性強(qiáng)，只能檢測(cè)出CSFV，最低檢測(cè)拷貝數(shù)為2.447×101copies/μL，與普通RT-PCR相比靈敏性提高100倍；重復(fù)試驗(yàn)的變異系數(shù)在1.5%之內(nèi)，重復(fù)性良好；用建立的RT-qPCR方法檢測(cè)31份懷疑CSFV感染的樣本，結(jié)果比普通RT-PCR的檢測(cè)結(jié)果多出4份陽(yáng)性；整個(gè)RT-qPCR擴(kuò)增過(guò)程只需45 min，時(shí)間過(guò)程短。綜上所述，本研究建立的豬瘟病毒實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法具有良好的特異性、靈敏性和重復(fù)性，而且耗時(shí)短，可用于臨床檢測(cè)豬瘟病毒感染。