基于不同酸堿值與培養(yǎng)養(yǎng)分差異的螺旋藻擴(kuò)殖生產(chǎn)優(yōu)化研究

方鑫源 ，鄭皓遠(yuǎn) ，2，3

（1.三明學(xué)院海峽理工學(xué)院，福建 三明 365004；2.三明學(xué)院資源與化工學(xué)院，福建 三明 365004；3.藥用植物開發(fā)利用福建省高校工程研究中心，福建 三明 365004）

螺旋藻是微藻之一，同時(shí)也是第三代生質(zhì)能源發(fā)展所使用的主要藻種。螺旋藻是一種低等的多細(xì)胞生物，無成形細(xì)胞核，屬原核生物，因其外觀排列成螺旋狀而得名螺旋藻，是由法國科學(xué)家克里門特博士于20 世紀(jì)60 年代在非洲探險(xiǎn)時(shí)所發(fā)現(xiàn)[1]。螺旋藻易于培養(yǎng)且生長繁殖非常迅速。其生長繁殖方式主要以營養(yǎng)繁殖為主，工業(yè)培養(yǎng)時(shí)，一般在低濃度條件下，給予其適宜生長環(huán)境，經(jīng)歷3～5 d 的時(shí)間，其數(shù)量就能增長約一倍[2]。螺旋藻既能進(jìn)行光合作用，又是很多底層動(dòng)物重要的食物來源，而且它還能提供一些具有抗氧化作用的色素蛋白[3]。例如蝦紅素（也叫蝦青素）是最強(qiáng)的天然抗氧化劑之一，抗氧化性極強(qiáng)，近年來被廣泛應(yīng)用于抗氧化性、抗腫瘤等多種領(lǐng)域[4-5]。但其實(shí)蝦體內(nèi)的蝦青素是蝦通過攝取一些含有蝦紅素的藻類累積在體內(nèi)的。有一些蝦的蝦青素已被證明是與紅體相關(guān)的主要類胡蘿卜素，例如黑虎蝦（Penaeus monodon，也叫斑節(jié)蝦）的顏色[6]。

螺旋藻的藻體包含大量的蛋白質(zhì)（含量約為55%～70%），是人類至今發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)含量最高的生物[7-8]。螺旋藻包含的豐富的蛋白質(zhì)和色素蛋白是天然的優(yōu)質(zhì)蛋白源，長期服用螺旋藻可以提高人體免疫力[9]。早前也有許多商家將其添加到魚類、禽類飼料中，用以代替蛋白源[10]。

今天，螺旋藻因其具有很多方面的優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用在很多方面，養(yǎng)殖和加工螺旋藻已經(jīng)成為一個(gè)現(xiàn)代化的大產(chǎn)業(yè)[11]。螺旋藻在未來仍具有很大的發(fā)展空間，相信螺旋藻憑借著它多方面的優(yōu)點(diǎn)和科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展會(huì)越來越受人們的重視，以后的螺旋藻產(chǎn)品會(huì)越來越多樣化，出現(xiàn)在我們的日常生活中[12]。

但是現(xiàn)如今在工業(yè)的培養(yǎng)上，螺旋藻的生產(chǎn)成本仍舊較高，而許多廠家由于缺乏后續(xù)的處理加工過程，其主要的利潤都來源于售賣螺旋藻的干粉，導(dǎo)致利潤較低[13]。因此，該試驗(yàn)研究的主要目的是為了改善螺旋藻的培養(yǎng)條件，希望通過試驗(yàn)控制法探究不同的影響螺旋藻生長的條件，借此找到能夠提高螺旋藻產(chǎn)量、降低螺旋藻生產(chǎn)成本的方法，用以提高培養(yǎng)螺旋藻的經(jīng)濟(jì)效益。

1 材料與方法

1.1 化學(xué)試劑

HCl；NaOH；NaCl；NaHCO3；MgSO4·6H2O；FeSO4·6H2O；K2SO4；CaCl2·2H2O；NaNO3；K2HPO4；EDTA；H3BO3；ZnSO4·7H2O；MnCl2·4H2O；CoCl2·6H2O；CuSO4·5H2O；Mo7O24（NH4）6·4H2O；

1.2 試驗(yàn)藻種

該試驗(yàn)藻種為鈍頂螺旋藻（Spirulina platensis），在分類上屬植物界，藍(lán)藻門，藍(lán)藻綱，斷殖藻目，顫藻科，螺旋藻屬。

1.3 螺旋藻干重檢量線制作[14]

分別用吸管吸取高濃度的螺旋藻種藻液10 次，使用分光光度計(jì)，在660 nm 處測定，將其分別稀釋至 0.1～1.0 吸光度（OD 值），并分別記錄其吸光度。用吸管吸取10 種不同吸光值的藻液各30 mL，使用高速離心機(jī)，分別于4 500 r/min、離心力24 g下離心20 min，去上清后，加入15 mL 逆滲透水，混勻后，于4 500 r/min、離心力24 g 下繼續(xù)離心20 min，洗去其他雜質(zhì)，去上清，于35 ℃的烘干機(jī)中烘干24 h，并取出稱重。記錄數(shù)據(jù)，并表格與制作檢量線，用EXCEL 表格求其OD 值與其干重的關(guān)系方程式。

1.4 不同起始pH 值的螺旋藻培養(yǎng)

1.4.1 螺旋藻培養(yǎng)液配置[14]按表1 的成分比例配置螺旋藻營養(yǎng)液，并滅菌備用。

表1 螺旋藻培養(yǎng)液配方

1.4.2 微量元素溶液配置 按表2 的成分比例配置螺旋藻微量元素溶液。

螺旋藻培養(yǎng)液是以營養(yǎng)液與微量元素溶液之比為1 000∶1 的比例配置而成。

1.4.3 滅菌前處理

取6 根容量為150 mL 的光反應(yīng)器，與配置完成的螺旋藻培養(yǎng)液一起置于高溫高壓滅菌鍋中（121 ℃，0.12 MPa）滅菌 20 min。

表2 微量元素溶液配置表

1.4.4 藻種配置

吸取50 mL 高濃度的螺旋藻藻種，以冷卻后的螺旋藻培養(yǎng)液稀釋，用分光光度計(jì)在660 nm 波長處測量，調(diào)整螺旋藻液初始的OD 值約為0.15。

1.4.5 pH 值調(diào)整[15]

取600 mL 配置好的螺旋藻液平均分為6 份，分別倒入6 根光反應(yīng)器中，使用水質(zhì)檢測儀檢測其pH 值，用滴管緩慢滴加NaOH 溶液與鹽酸溶液，分別調(diào)整6 根光反應(yīng)器中螺旋藻液的pH 值為7、8、9、10、11 和 12。

1.4.6 其他條件設(shè)置

用照度計(jì)測量，調(diào)整整個(gè)培養(yǎng)裝置的光照強(qiáng)度為3 000 lx，調(diào)整空氣幫浦空氣流速為400 cc/min，對螺旋藻進(jìn)行24 h 不間斷光照培養(yǎng)，每隔24 h 分別取樣使用分光光度計(jì)在660 nm 波長處測定其OD 值，并記錄，制作成OD 值變化表。

1.5 不同起始生質(zhì)濃度的螺旋藻培養(yǎng)

取2 份300 mL 培養(yǎng)液，加入螺旋藻藻液混勻后使用分光光度計(jì)在660 nm 波長處測定其OD 值并分別調(diào)整至其OD 值約0.15 和1.50 后，分別放入6 根光反應(yīng)器中。不調(diào)整其pH 值（原始pH 值為9.10）。并保持其他條件與1.4 試驗(yàn)條件一致，并每隔24 h 取樣，使用分光光度計(jì)在660 nm 的波長處測定其OD 值，并記錄，制作成OD 值變化表。螺旋藻培養(yǎng)裝置、螺旋藻培養(yǎng)液的配置方法、滅菌前處理步驟皆與前述試驗(yàn)步驟一致。

1.6 不同比例培養(yǎng)基濃度的螺旋藻培養(yǎng)

用1 g/L 的NaCl 溶液，與培養(yǎng)基混合分別調(diào)配成培養(yǎng)基含量為1/2 濃度以及3/4 濃度的培養(yǎng)基各300 mL，加入高濃度的藻種，混合均勻后在660 nm處測量其OD 值，調(diào)整其OD 值到0.15 左右。各取100 mL 分別放入6 根光反應(yīng)器中，其他條件與之前對照培養(yǎng)時(shí)一致。每隔24 h 取樣，用分光光度計(jì)在660 nm 的波長下測量并記錄其OD 值變化。并與1.4 試驗(yàn)中螺旋藻的起始OD 值為0.15 左右的試驗(yàn)組進(jìn)行對照，比較其差異。螺旋藻培養(yǎng)裝置的設(shè)置、螺旋藻培養(yǎng)液的配置方法、滅菌前處理步驟、其他條件的設(shè)置皆與1.4 試驗(yàn)步驟一致，不調(diào)整其pH 值。

2 結(jié)果與討論

2.1 螺旋藻干重檢量線制作

螺旋藻干重稱量數(shù)據(jù)見表3。由圖1 螺旋藻干重檢量線可知得到的檢量線的R 平方值為0.980 5，具有較高的可信度。

藻干重與檢量線的關(guān)系為每30 mL 藻液的藻干重=0.213×OD-0.021，單位為 g。

每毫升螺旋藻的干重（g）=（OD 值×0.213-0.021）÷30×體積（mL）

表3 螺旋藻干重稱量數(shù)據(jù)

圖1 螺旋藻干重檢量線圖

2.2 不同起始pH 值的螺旋藻培養(yǎng)

如圖2 所示，螺旋藻在初始pH 值為12 的情況下，生長的狀況非常差，藻液偏黃（螺旋藻大量死亡），只有些許綠色。初始pH 值為7～11 的情況對螺旋藻的生長影響較不明顯。剛開始進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，不同pH 值環(huán)境的螺旋藻液并沒什么明顯差異，培養(yǎng)14 d 后，初始 pH 值為 7～11 的 5 個(gè)試驗(yàn)組的螺旋藻液顏色外觀差異不大，而初始pH 值為12 的試驗(yàn)組的螺旋藻液較其他試驗(yàn)組明顯顏色偏淡（螺旋藻密度低）。因螺旋藻培養(yǎng)液的初始pH 值在9.10 左右，相對來說堿性不高，而初始pH 值處于7～11 對螺旋藻的生長影響較不明顯。

圖2 不同起始pH 值培養(yǎng)后的螺旋藻OD 值變化圖

2.3 不同起始生質(zhì)濃度的螺旋藻培養(yǎng)

圖3 所見，指出初始培養(yǎng)OD 值為0.161 的也就是1～3 號(hào)光反應(yīng)器，從開始培養(yǎng)至第12 天，每天的OD 值都有一定程度的增長。而初始培養(yǎng)OD值為1.538 的也就是4～6 號(hào)光反應(yīng)器，在培養(yǎng)的前8 d 內(nèi)，螺旋藻的濃度有明顯的增長，而在培養(yǎng)了8 d之后，螺旋藻的OD 值趨于穩(wěn)定，沒有明顯的增長。

圖3 不同起始濃度值培養(yǎng)后的螺旋藻平均OD 值變化圖

2.4 不同比例的培養(yǎng)基濃度螺旋藻培養(yǎng)

如圖4 不同比例的培養(yǎng)基螺旋藻平均OD 值變化圖指出，在前6 d 的培養(yǎng)中，1/2 培養(yǎng)基的螺旋藻OD 值增長速度與正常培養(yǎng)基的螺旋藻OD 值增長速度接近，而3/4 培養(yǎng)基的螺旋藻的OD 值增長速度則要比正常培養(yǎng)基的螺旋藻OD 值增長速度要快。在第6 天至第12 天的培養(yǎng)中，1/2 培養(yǎng)基的螺旋藻OD 值增長速度已經(jīng)開始明顯慢于其他兩組，而3/4 培養(yǎng)基的螺旋藻OD 值增長速度與正常培養(yǎng)基的螺旋藻OD 值增長速度非常接近。在培養(yǎng)了12 d 之后，3/4 培養(yǎng)基的螺旋藻液OD 值基本已不再有持續(xù)的增長，保持相對穩(wěn)定在2.8 左右，到培養(yǎng)的第17 天時(shí)，藻的OD 值仍然只有2.85，而正常培養(yǎng)基的螺旋藻OD 值仍在持續(xù)增長，并在培養(yǎng)的第17 天增長到了3.955。

從試驗(yàn)結(jié)果我們可以知道，3/4 比例的培養(yǎng)基雖然最終的螺旋藻OD 值只能達(dá)到2.8 左右，比不上正常的培養(yǎng)基，但其完全可以在前12 d 的螺旋藻培養(yǎng)中替代正常培養(yǎng)基使用（工業(yè)培養(yǎng)的螺旋藻一般在螺旋藻生長對數(shù)期的低OD 值階段收獲，此時(shí)螺旋藻的生長速度最快最有經(jīng)濟(jì)效益），這種將鹽水與培養(yǎng)基以1∶3 的比例混合而成作為螺旋藻培養(yǎng)基的做法若是可以實(shí)行，那在工業(yè)的培養(yǎng)上可以節(jié)省約1/4 的培養(yǎng)基原料成本，這對降低螺旋藻工業(yè)培養(yǎng)的成本有很大的利用價(jià)值。而1/2 比例的培養(yǎng)基雖然在前6 d 的OD 值增長與正常培養(yǎng)基的OD 值增長速率近似，但其在第六天之后OD 值的增長速率太慢，且其最后的OD 值也比另外兩組要低不少，在工業(yè)的培養(yǎng)上可以說是沒有太大的利用價(jià)值。

圖4 不同比例的培養(yǎng)基螺旋藻平均OD 值變化圖

3 結(jié)論

研究前期，先對螺旋藻分別在初始pH 值為7～12 的不同環(huán)境下進(jìn)行光照強(qiáng)度為3 000 Lux、24 h光照培養(yǎng)研究，培養(yǎng)時(shí)間為14 d。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)除初始pH 值為12 的高堿性環(huán)境不適合用在螺旋藻的培養(yǎng)，其他7～11 的pH 值對螺旋藻的生長無較大影響。故不再繼續(xù)進(jìn)行關(guān)于初始pH 值的的探討。后續(xù)研究，進(jìn)行初始生質(zhì)濃度不同的螺旋藻培養(yǎng)，最終螺旋藻藻液的OD 值相差不大，這也表明正常培養(yǎng)時(shí)，培養(yǎng)液存在營養(yǎng)過剩的狀況，有望通過稀釋培養(yǎng)基的比例來降低其培養(yǎng)成本。第三階段研究使用1/2、3/4 兩種不同濃度比例的培養(yǎng)基進(jìn)行螺旋藻培養(yǎng)，并與第二階段研究中的正常培養(yǎng)基的培養(yǎng)結(jié)果進(jìn)行對比。結(jié)果表明，3/4 比例的培養(yǎng)基可以替代正常培養(yǎng)基進(jìn)行螺旋藻的前期培養(yǎng)，以此來降低培養(yǎng)成本。但到了培養(yǎng)后期3/4 比例培養(yǎng)基螺旋藻的生長速度及最高生質(zhì)濃度均不如正常培養(yǎng)基。而1/2 比例的培養(yǎng)基雖然在前6 d 的培養(yǎng)中不會(huì)比正常的培養(yǎng)基差，但在后續(xù)的培養(yǎng)中其螺旋藻的生長速率及最高生質(zhì)濃度明顯低于另外兩組，所以利用價(jià)值較低。

4 致謝

感謝“福建省中青年教師教育科研項(xiàng)目（JT180493）”以及“福建省科技特派員（明財(cái)（教）指（2018）135號(hào)）”等項(xiàng)目資助完成研究。