慮煩湯對大鼠缺血性卒中后焦慮行為影響的研究*

沈莉 ，白曉丹 ，高雅 ，張光銀 ，袁卓 ，徐士欣

（1．天津中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，天津 300193；2．天津中醫(yī)藥大學，天津 301617）

缺血性腦卒中后情感障礙是腦卒中常見的并發(fā)癥之一，主要包括腦卒中后焦慮、抑郁或抑郁/焦慮共病等，發(fā)生率為20%～65%，對腦卒中患者的功能康復產(chǎn)生了嚴重的影響，顯著增加腦卒中后患者的致殘率和病死率[1]。腦卒中的高致殘率對患者身心損害巨大，加上腦部本身的損害對精神狀態(tài)的影響，使卒中后焦慮（PSAD）的發(fā)病率進一步升高[2-3]。慮煩湯是天津市名中醫(yī)顏紅教授依據(jù)臨床用藥經(jīng)驗，遵循中醫(yī)藥理論研發(fā)出的治療焦慮障礙的中藥制劑，在10余年治療焦慮障礙相關疾病中取得了良好的臨床療效[4]。前期研究結(jié)果表明，慮煩湯可明顯改善患者的軀體焦慮癥狀，患者服用慮煩湯后納差、腹脹、口干、易汗出、心悸等癥狀明顯減輕，可能與調(diào)節(jié)T淋巴細胞、去甲腎上腺素（NE）以及5-羥色胺（5-HT）水平有關[5-6]。有研究提示，卒中后焦慮障礙，常常以軀體化焦慮為主[2]。本研究基于以上認識，建立大鼠腦缺血后焦慮復合模型，通過高架十字迷宮，曠場實驗、明暗箱實驗以及Morris水迷宮等行為學實驗，以初步評價慮煩湯不同劑量對腦缺血后大鼠焦慮行為學的改善作用，為以后進一步研究中醫(yī)藥抗焦慮的臨床效應提供參考。

1 材料

1.1 實驗動物 SPF級雄性健康SD成年大鼠60只，體質(zhì)量（210±10）g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，合格證號：SCXK（京）2016-0006。將實驗動物飼養(yǎng)于中國醫(yī)學科學院放射醫(yī)學研究所SPF級動物實驗室，12 h晝夜節(jié)律，正常光照時間12 h/d，室內(nèi)溫度控制在22～24℃之間，相對濕度保持在40%～60%之間，提供獨立飼養(yǎng)空間，單籠飼養(yǎng)，保持安靜環(huán)境。大鼠保持充足的飼料飼養(yǎng)，自由攝食飲水，所有物品均定期清潔消毒。實驗流程均嚴格按照中國醫(yī)學科學院放射醫(yī)學研究所實驗動物管理條例進行操作，實驗動物均給予人道主義關懷，且嚴格遵循實驗動物法管理條例。

1.2 實驗藥物與試劑 慮煩湯由柴胡10 g，淡豆豉10 g，生梔子 10 g，生地 10 g，赤芍 10 g，煅磁石 30 g，生龍齒 30 g，炒枳殼 10 g，白芍 10 g，牡丹皮 10 g，黃連 6 g，蓮子心 10 g，百合 30 g，遠志 10 g，夜交藤30 g，茯苓20 g組成，原藥材由天津中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院藥劑科提供，每劑藥煎煮300 mL。過濾，濾液濃縮至含生藥2 g/mL，并濾過除菌，保存?zhèn)溆?。鹽酸丁螺環(huán)酮片（北大醫(yī)藥股份有限公司，國藥準字H19990302），水合氯醛（國藥集團化學試劑有限公司批號20171222）。

1.3 儀器與設備 硅膠線栓（L3600-AAA，廣州佳靈生物科技有限公司），高架十字迷宮實驗裝置、曠場行為觀察箱（100 cm×100 cm×50 cm）、明暗箱（40 cm×25 cm×25 cm）均由深圳市瑞沃德生命科技有限公司提供。Morris水迷宮購自淮北正華生物儀器設備有限公司（型號：Morris型），Anymaze動物視頻行為學觀察及自動分析系統(tǒng)（含計算機、攝像監(jiān)控及Anymaze行為學分析軟件）由上海欣軟信息科技有限公司提供。

2 方法

2.1 大鼠卒中后焦慮復合模型制備 大鼠適應性飼養(yǎng)1周后，進行模型制備。參照Longa方法[7]，應用改良的線栓法永久性阻斷大鼠左側(cè)大腦中動脈，制作SD大鼠永久性腦缺血卒中動物模型（MCAO）。術后采用Longa評分法[7]觀察缺血性腦卒中大鼠神經(jīng)功能缺損情況。經(jīng)過神經(jīng)功能評分合格的MCAO大鼠在SPF實驗環(huán)境中單籠飼養(yǎng)5 d以適應環(huán)境。適應期結(jié)束后，開始進行持續(xù)7 d的定時喂水訓練，即每日 9∶00—9∶10 和 21∶00—21∶10 固定時間段給大鼠兩次飲水，每次持續(xù)10 min，其余時間撤掉水瓶不給水，并將水瓶放在大鼠看不見的位置。訓練7 d后開始應激實驗，即在第8天晚21∶00-21∶10開始進行時長為14 d的空瓶刺激[8-9]。具體方法：模型組大鼠在規(guī)定的喂水時間段施加無規(guī)律的空瓶刺激使得大鼠產(chǎn)生情緒應激反應，空瓶刺激每日進行1次或者每2日1次；空白組大鼠進行模型構建期間給予定期喂水，與喂水訓練相同。整個實驗期間，所有實驗動物自由取食，并觀察大鼠在空瓶刺激前后體質(zhì)量的變化情況。詳細的空瓶刺激實驗方法，見表1。

2.2 分組與給藥 復核因素造模后死亡9只大鼠，經(jīng)高架十字迷宮實驗篩選，剔除3只既未進入開放臂，也未進入封閉臂的大鼠，2只反復跌落高架的大鼠，最終選出36只SPF級的雄性健康SD成年大鼠作為進一步研究藥物治療的對象。將36只大鼠稱體質(zhì)量編號1-36號，再根據(jù)體質(zhì)量隨機分為4組，每組9只。各組分組及處理方法如下：模型組、丁螺環(huán)酮組、慮煩湯低劑量組、慮煩湯高劑量組，加上原有的空白組共計5組46只實驗大鼠，分組完成后記錄體質(zhì)量。空白組和模型組不進行藥物干預。其余3組大鼠在每日接受藥物干預：丁螺環(huán)酮組每只大鼠以鹽酸丁螺環(huán)酮3 mg/（kg·d）劑量灌胃[10]；慮煩湯低劑量組和慮煩湯高劑量組大鼠分別給予慮煩湯1.6 g/（kg·d）和3.2 g/（kg·d）劑量灌胃，空白組按相同劑量給予稀釋藥物用的滅菌純凈水。每日灌胃1次，共灌胃2周。

2.3 高架十字迷宮實驗 實驗在安靜無干擾的環(huán)境下進行。首先在計算機中設定好高架十字迷宮的開放臂、閉合臂、中央?yún)^(qū)的區(qū)域范圍大小和大鼠的編號。將大鼠輕柔抓起置于迷宮中央?yún)^(qū)域，使其頭部正對其中一個開放臂，與此同時計算機軟件開始運行，開啟計時、攝像并實時跟蹤記錄大鼠5 min內(nèi)分別進入開放臂的次數(shù)（OE）在開放臂滯留時間（OT）和進入開放臂和封閉臂的總次數(shù)（TE），由上述指標計算出：1）開放臂滯留時間的比例（OT%）：OT%=OT/300×100%。2）開放臂進入次數(shù)的比例（OE%）：OE%=OE/TE×100%。每只大鼠測試1次，所有大鼠行為學測試在每次測試完后用75%乙醇擦拭測試裝置，清除糞便，消除氣味，以便進行下一只大鼠的測試。

2.4 明暗箱實驗 在實驗開始前，設置計算機，先將大鼠放入另一動物盒中，任由其自由探究5 min，之后將大鼠輕柔抓起置于明箱中央，使其背朝通道，記錄5 min內(nèi)大鼠的活動情況，并記錄大鼠在明箱運動距離（mm），進入明箱次數(shù)（T）和進入明箱時間（s）。實驗在安靜無干擾的環(huán)境下進行，每只大鼠只測試1次，每次測試1只大鼠。

2.5 曠場實驗 將大鼠輕柔抓起置于曠場實驗箱正中格，開啟攝像機記錄5 min內(nèi)大鼠的活動情況。觀察的指標：1）大鼠運動總路程；2）大鼠進入中央?yún)^(qū)時間；3）大鼠進入中央?yún)^(qū)次數(shù)。實驗環(huán)境要求安靜無干擾，每只測試1次，每次測試1只大鼠。

表1 空瓶刺激安排表Tab.1 Uncertain empty bottle stimulation schedule

2.6 Morris水迷宮實驗 所有組別大鼠在以上各項行為學檢測結(jié)束24 h后采用Morris水迷宮進行學習記憶功能的檢測，參照Heo等[10]方法，實驗檢測的具體步驟分為兩個主要階段：1）尋找平臺訓練：將大鼠放置于平臺熟悉30 s后，從目標象限以外的任意象限入水點各入水訓練1次，每次訓練間隔約為1～2 h，持續(xù)訓練5 d。2）空間探索實驗：在大鼠訓練5 d后撤除平臺，將大鼠從距離目標象限最遠的入水點放入水中，觀察并記錄120 s內(nèi)其搜索原平臺的游泳軌跡，記錄大鼠在空間探索階段的總運動距離（mm），靶象限活動距離（mm）和靶象限活動時間（s）作為評價大鼠運動能力及記憶能力的指標。

2.7 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 25．0統(tǒng)計軟件進行分析，數(shù)據(jù)分析結(jié)果采用均數(shù)±標準差（±s）表示，干預前后的比較采用配對t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法，以P＜0．05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 研究結(jié)果

3.1 大鼠體質(zhì)量變化情況 結(jié)果表明，模型組大鼠在MACO和慢性應激后體質(zhì)量均有下降，經(jīng)藥物干預2周后大鼠體質(zhì)量均有回升。與模型組比較，中藥慮煩湯低劑量組和高劑量組大鼠均在治療后體質(zhì)量顯著上升（P＜0．01），丁螺環(huán)酮組大鼠體質(zhì)量也有所上升（P＜0．05）。見表 2。

表2 藥物干預前后各組大鼠體質(zhì)量變化情況（±s）Tab.2 Changes of body weight of rats in each group before and after drug intervention（±s）g

表2 藥物干預前后各組大鼠體質(zhì)量變化情況（±s）Tab.2 Changes of body weight of rats in each group before and after drug intervention（±s）g

注：與模型組比較，*P＜0．05，**P＜0．01；與治療前比較，#P＜0．05，##P＜0．01。

組別 動物數(shù) 藥物干預前 藥物干預后空白組 10 238．50±3．24 260．70± 6．43##模型組 9 217．22±4．49 225．33± 3．81#丁螺環(huán)酮組 9 219．89±9．57 229．44± 9．22*##慮煩湯低劑量組 9 215．00±8．22 232．41± 8．35**##慮煩湯高劑量組 9 219．00±4．30 234．12±11．74**##

3.2 高架十字迷宮實驗 與空白組比較，模型組大鼠開放臂進入時間比和次數(shù)比均減小，差異具有顯著的統(tǒng)計學意義（P＜0．01）。高劑量慮煩湯能夠顯著提高開放臂進入次數(shù)比，與模型組比較，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0．05）。與模型組比較，丁螺環(huán)酮組、慮煩湯低劑量組開放臂進入次數(shù)比無統(tǒng)計學差異（P＞0．05），但有促進大鼠進入開放臂進入次數(shù)的趨勢。見表3。

表3 高架十字迷宮中各組大鼠行為學比較（±s）Tab.3 Behavioral comparison of rats in each groups in elevated plus maze tes（t±s）%

表3 高架十字迷宮中各組大鼠行為學比較（±s）Tab.3 Behavioral comparison of rats in each groups in elevated plus maze tes（t±s）%

注：與空白組比較，*P＜0．01；與模型組比較，#P＜0．05。

組別 動物數(shù) 開放臂進入時間比 開放臂進入次數(shù)比空白組 10 43．10±19．51 48．60±13．70模型組 9 17．78±15．55* 16．67±15．02*丁螺環(huán)酮組 9 24．00±18．91 22．22±14．15慮煩湯低劑量組 9 33．56±19．32 24．33±20．90慮煩湯高劑量組 9 36．00±27．25 37．56±22．17#

3.3 曠場實驗 藥物干預2周后大鼠曠場實驗數(shù)據(jù)顯示，模型組運動的總路程、進入中央?yún)^(qū)時間以及進入中央?yún)^(qū)次數(shù)均減少，與空白組比較，差異具有顯著的統(tǒng)計學意義（P＜0．01）。與模型組比較，丁螺環(huán)酮組（P＜0．05）、煩湯低劑量組（P＜0．05）和慮煩湯高劑量組（P＜0．01）大鼠進入中央?yún)^(qū)時間均有所提高；與模型組比較，丁螺環(huán)酮組（P＜0．05）和慮煩湯高劑量組（P＜0．01）大鼠的運動路程均有所增加，而慮煩湯低劑量組未見統(tǒng)計學差異（P＞0．05）。在提高大鼠進入中央?yún)^(qū)次數(shù)方面，各給藥組均無統(tǒng)計學差異（P＞0．05）。見表 4。

表4 藥物干預后各組大鼠曠場實驗數(shù)據(jù)比較（±s）Tab.4 Comparison of open field experiments of rats in each groups after drug intervention（±s）

表4 藥物干預后各組大鼠曠場實驗數(shù)據(jù)比較（±s）Tab.4 Comparison of open field experiments of rats in each groups after drug intervention（±s）

注：與空白組比較，**P＜0．01；與模型組比較，#P＜0．05，##P＜0．01。

進入中央?yún)^(qū)次數(shù)（次）空白組 1 0 2 0 8 7 1．5 0±8 9 9 3．6 9 1 2 4．2 9±6 6．6 1 2．0 0±1．8 3模型組 9 2 5 1 5．7 3±1 1 2 7．2 8** 6．0 7±1 0．9 7**0．5 6±0．8 8**丁螺環(huán)酮組 9 8 6 5 7．7 3±4 2 0 0．8 4# 7 4．9 2±7 1．2 2# 0．7 8±0．6 7慮煩湯低劑量組 9 7 8 7 2．4 3±5 5 5 8．2 2 8 6．8 3±8 0．9 2# 1．0 0±1．0 0慮煩湯高劑量組 9 1 2 4 2 3．1 3±6 1 3 7．2 2##1 1 9．1 0±7 0．0 2##1．1 1±0．9 3組別 動物數(shù) 總路程（m m） 進入中央?yún)^(qū)時間（s）

3.4 明暗箱實驗 與空白組比較，模型組大鼠進入明箱次數(shù)以及在明箱運動距離顯著減少（P＜0．01）。與模型組比較，慮煩湯高劑量組大鼠進入明箱次數(shù)延長（P＜0．05）。丁螺環(huán)酮組和慮煩湯高劑量組大鼠在明箱運動距離顯著延長（P＜0．05），與模型組比較，各組藥物干預后，大鼠進入明箱時間無統(tǒng)計學差異（P＞0．05）。見表 5。

3.5 Morris水迷宮實驗 Morris水迷宮測試結(jié)果顯示，與空白組比較，模型組大鼠在水迷宮中的總運動距離、靶象限距離以及靶象限活動時間均減少，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0．05 或 P＜0．01）。慮煩湯高劑量組延長了大鼠在水迷宮中的總運動距離，與模型組比較，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0．05）。見表 6。

表5 明暗箱測試中各組大鼠行為學比較（±s）Tab.5 Behavioral comparison of rats in each groups in light-dark box test（±s）

表5 明暗箱測試中各組大鼠行為學比較（±s）Tab.5 Behavioral comparison of rats in each groups in light-dark box test（±s）

注：與空白組比較，**P＜0．01；與模型組比較，#P＜0．05。

進入明箱時間（s）空白組 10 4．30±3．43 1 605．33±1 185．64 136．94± 92．45模型組 9 1．22±1．39** 268．82± 240．17**164．86±112．11丁螺環(huán)酮組 9 2．67±1．87 653．57± 283．57# 116．02± 71．24慮煩湯低劑量組 9 2．56±1．59 438．43± 345．19 134．30±101．09慮煩湯高劑量組 9 4．11±1．45#1 169．35± 757．97# 129．55± 69．34組別 動物數(shù) 進入明箱次數(shù)（次）明箱運動距離（mm）

表6 Morris水迷宮測試中各組大鼠行為學比較（±s）Tab.6 Behavioral comparison of rats in each groups in Morris water maze（±s）

表6 Morris水迷宮測試中各組大鼠行為學比較（±s）Tab.6 Behavioral comparison of rats in each groups in Morris water maze（±s）

注：與空白組比較，*P＜0．05，**P＜0．01；與模型組比較，#P＜0．05。

靶象限活動時間（s）空白組 10 631．22±426．24 178．72±130．73 12．55±6．01模型組 9 210．62±110．84**69．74± 38．77* 7．61±2．67*丁螺環(huán)酮組 9 465．92±302．15 86．49± 60．09 8．18±4．55慮煩湯低劑量組 9 402．03±295．33 86．18± 92．14 7．91±4．96慮煩湯高劑量組 9 611．86±392．74#138．83±118．77 9．91±5．66組別 動物數(shù) 總運動距離（mm）靶象限距離（mm）

4 討論

PSAD是一種常見的腦卒中并發(fā)癥，其病因尚未完全明確，臨床治療方法也多種多樣，由于其可嚴重影響患者的生活質(zhì)量，近年來關于腦卒中后焦慮的研究也日益增多[11-12]。本院心身科應用慮煩湯在治療焦慮相關疾病10余年，臨床療效顯著[4]。慮煩湯選用柴胡疏肝解郁，生地養(yǎng)血益陰以柔肝；白芍養(yǎng)肝陰、平肝陽、調(diào)肝氣，黃連、梔子、百合、蓮子心清心除煩，茯神、夜交藤安心神、養(yǎng)心血，配以生龍齒、磁石寧心定志，滋陰潛陽。諸藥合用，共奏寧心除煩、疏肝解郁之效，從而緩解焦慮患者坐臥不寧，緊張恐懼，多慮失眠等諸多癥狀[4，6]。

高架十字迷宮是焦慮行為學研究中應用最廣泛的平臺之一[13]。既往研究提示，大鼠在高架十字迷宮裝置中會出現(xiàn)擔心緊張，發(fā)作性驚恐等多種焦慮行為，本研究顯示模型組大鼠開放臂進入時間比和次數(shù)比均減小，高劑量慮煩湯能夠顯著提高開放臂進入次數(shù)比。曠場實驗是利用動物懼怕空曠環(huán)境但又喜歡探索的心理沖突，檢測嚙齒類動物的自發(fā)活動[14]，其中大鼠運動總路程反應了大鼠的活動度和興奮性，大鼠進入中央?yún)^(qū)次數(shù)反應了大鼠對新環(huán)境的探究行為，大鼠進入中央?yún)^(qū)時間反應了大鼠對環(huán)境的適應度。本研究結(jié)果提示，模型組大鼠進入中央?yún)^(qū)的時間和進入中央?yún)^(qū)次數(shù)均見明顯減少，提示大鼠出現(xiàn)對空曠場所恐懼的焦慮樣行為。丁螺環(huán)酮、低劑量慮煩湯和高劑量慮煩湯均提高了大鼠進入中央?yún)^(qū)時間，高劑量慮煩湯提高了大鼠的運動路程。Morris水迷宮在嚙齒動物的空間學習記憶能力評價中具有非常重要的地位[15]。Cechetti等[16]的研究結(jié)果表明MCAO大鼠記憶能力顯著下降，本研究結(jié)果進一步提示，MCAO復合慢性空瓶應激可使大鼠出現(xiàn)明顯的認知能力下降。以上數(shù)據(jù)提示在實驗過程中，經(jīng)過復合方法造模，大鼠出現(xiàn)了自主活動減少，緊張恐懼等焦慮的行為學現(xiàn)象。經(jīng)藥物干預后，大鼠自主活動和探索行為有所增加，與前期臨床研究相符合。

焦慮障礙的發(fā)病機制復雜，包括神經(jīng)遞質(zhì)學說、遺傳學說以及神經(jīng)內(nèi)分泌學說等，本研究僅從焦慮行為學的角度進行了探討，慮煩湯抗焦慮的物質(zhì)基礎研究尚有待于進一步探討。