趨化因子CXCL10 作為神經(jīng)病理性疼痛生物標記物的研究*

鄧雨濤 程祝強 高永靜 姜保春

（1 南通大學(xué)疼痛醫(yī)學(xué)研究院，特種醫(yī)學(xué)研究院，南通226019；2 東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院疼痛科，南京 210002）

疼痛是繼體溫、呼吸、脈搏和血壓之后的第五大生命指征，其特殊之處在于目前沒有客觀的生物儀器進行檢測，疼痛程度的評估主要依賴病人的主觀感受，臨床上也缺少疼痛診斷、預(yù)后和治療有效性判斷的生物標志物。慢性疼痛是指持續(xù)或反復(fù)發(fā)作超過3 個月的疼痛，其中由軀體感覺神經(jīng)系統(tǒng)損傷或疾病引起的神經(jīng)病理性疼痛 (neuropathic pain, NP) 是臨床常見的慢性疼痛[1]。長期的慢性疼痛會導(dǎo)致病人無法正常工作、睡眠和飲食等，嚴重影響病人的身心健康、社會關(guān)系和生活質(zhì)量，給家庭和社會帶來沉重的負擔(dān)[2]。目前針對慢性疼痛尤其是NP 的治療，臨床上缺乏有效的治療藥物和檢驗指標，因此亟需對慢性疼痛的發(fā)病機制和客觀反映疼痛情況的生物標志物進行研究。

理想的疼痛診療生物標記物應(yīng)能夠準確反應(yīng)疼痛程度和進展情況，并能預(yù)測由急性向慢性轉(zhuǎn)化的風(fēng)險等級，測量過程中應(yīng)滿足容易、快速、廉價和可重復(fù)等條件。血漿和腦脊液被認為是生物標志物研究的理想選擇，血漿中的前列腺素 E2 (prostaglandin E2, PGE2)、神經(jīng)生長因子 (nerve growth factor, NGF)和白細胞介素2，以及腦脊液 (cerebrospinal fluid, CSF) 中的膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子 (glial cell line-derived neurotrophic factor, GDNF)、P 物 質(zhì)(substance P, SP) 等被證明與不同類型疼痛的發(fā)生發(fā)展相關(guān)[3]。遺傳類生物標記物則主要圍繞離子通道、G 蛋白偶聯(lián)受體和藥物代謝等基因的單核苷酸多態(tài)性進行 (single nucleotide polymorphisms, SNPs) 研究[3]。遺憾的是，現(xiàn)階段關(guān)于疼痛標記物的研究尚處于起步階段，雖發(fā)現(xiàn)了一些潛在的生物標記物，但其臨床有效性和應(yīng)用范圍需作進一步研究，且仍需篩選并確定新的理想標記物。

大量的動物實驗證明慢性疼痛常伴隨著外周和中樞的組織損傷和炎癥。外周組織、背根神經(jīng)節(jié)(DRG)、脊髓和腦中的趨化因子在慢性疼痛的發(fā)生和維持中發(fā)揮了重要作用[1]。趨化因子是一類分泌型的細胞因子或信號蛋白，由50 多個成員組成。趨化因子通過形成可溶性或固定的濃度梯度調(diào)控免疫細胞由低濃度向高濃度遷移[1]。神經(jīng)損傷或組織損傷后，趨化因子不僅從浸潤的免疫細胞和膠質(zhì)細胞中表達上調(diào)、釋放、導(dǎo)致外周敏化，而且中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的神經(jīng)元、小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞也能夠合成并釋放趨化因子，通過敏化感覺神經(jīng)元，進一步增強膠質(zhì)激活和神經(jīng)炎癥等導(dǎo)致中樞敏化[4]。趨化因子在導(dǎo)致外周敏化和中樞敏化的同時，還可分泌進入血液和腦脊液，或可作為慢性疼痛的生物標志物[5,6]。

CXCL10 (C-X-C motif chemokine 10) 屬于CXC型趨化因子配體，通過與CXCR3 受體結(jié)合發(fā)揮作用。CXCL10 和CXCR3 能夠在外周和中樞神經(jīng)系統(tǒng)中表達[7,8]，參與脫髓鞘神經(jīng)病變、神經(jīng)炎癥和多發(fā)性硬化癥等神經(jīng)系統(tǒng)功能異常和疾病的調(diào)控[7,9,10]。CXCL10/CXCR3 信號在外周和脊髓中參與慢性疼痛和慢性瘙癢的調(diào)控[11,12]。本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)在脊神經(jīng)結(jié)扎 (spinal nerve ligation, SNL) 誘導(dǎo)的NP模型中CXCL10 在脊髓背角神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細胞中表達增加，通過與CXCR3 結(jié)合介導(dǎo)星形膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元的相互作用促進NP[11]。而且鞘內(nèi)注射CXCL10 誘導(dǎo)小鼠痛覺過敏[13]，表明CXCL10 在脊髓的表達與NP 存在密切關(guān)系。但在急性和慢性疼痛條件下，CXCL10 在小鼠和病人的腦脊液和血液的表達水平變化還未見報道。

本研究采用小鼠L5脊神經(jīng)結(jié)扎模型及慢性炎癥疼痛模型，觀察比較了不同疼痛模型小鼠CSF 與血清中CXCL10 的表達變化，并首次檢測了急性帶狀皰疹、帶狀皰疹后神經(jīng)痛和慢性關(guān)節(jié)炎病人血清和CSF 中CXCL10 的含量，探討其作為NP 臨床診斷指標的可能性。

方 法

1.材料

動物：健康成年雄性ICR 小鼠，由南通大學(xué)動物實驗中心提供。人的脊髓、DRG 和淋巴結(jié)組織由美國National Disease Research Interchange (NDRI) 和南通大學(xué)附屬醫(yī)院病理科提供。腦脊液和血液樣品由東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院疼痛科收集提供。

試劑和藥品：CXCL10 抗體 (Goat, R&D Systems, AF-466-NA)；CXCR3 抗體(Rabbit, 博士德生物，PB0038)；熒光二抗，Cy3-donkey anti-goat IgG、Cy3-donkey anti-rabbit IgG 和Alex-488-donkey anti-mouse (Jackson)；近紅外熒光基團標記二抗IRDye 800CW goat anti-rabbit IgG（美國LICOR Odyssey）；RIPA組織裂解液 (Beyotime)；BCA 蛋白濃度測定試劑盒 (Thermal Scientific)；人和小鼠CXCL10 ELISA 試劑盒，Human CXCL10/IP-10 Quantikine ELISA Kit、Mouse CXCL10/IP-10/CRG-2 DuoSet ELISA (R&D Systems)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（南京諾唯贊）；其余化學(xué)試劑由美國Sigma 公司提供。

實驗所用主要儀器：熒光定量PCR 儀 StepOnePlus (Applied Biosystems)；普通PCR 儀 (Applied Biosystems)；電泳儀(Bio-Rad Laboratories)；倒置激光共聚焦顯微鏡SP8 (Leica)；Odyssey 雙色紅外熒光掃描儀（美國LI-COR）；多功能酶標儀（美國BioTek）；冰凍切片機 (Thermo Scientific)；高速冷凍離心機 (Eppendorf)。

2.方法

（1）疼痛模型建立

神經(jīng)病理性疼痛模型的建立：將健康成年ICR小鼠隨機分為正常組 (Naive)，假手術(shù)組 (Sham)和模型組 (SNL)。SNL 組小鼠禁食禁水8 h，使用異氟烷吸入麻醉剃除小鼠背部毛發(fā)后用碘伏消毒，在其背部距髂脊1 cm 處切開皮膚，延腰背部正中線外白線處縱向分離肌肉，鉗斷L6腰椎橫突使L5脊神經(jīng)暴露并分離，使用6-0 絲線結(jié)扎。之后縫合肌肉、筋膜和皮膚，置于溫暖環(huán)境中蘇醒。Sham 組動物的手術(shù)過程同SNL 組，但不結(jié)扎L5脊神經(jīng)。

急性疼痛模型建立：小鼠分為Naive 組和急性疼痛組 (Formalin)。在清醒狀態(tài)下，向小鼠左側(cè)足底皮內(nèi)注射5% Formalin 20 μl 制備急性炎癥性疼痛模型。

慢性炎癥性疼痛模型建立：動物分為Naive 組和慢性炎癥性疼痛模型組 (CFA)。向小鼠左側(cè)足底皮內(nèi)注射50% CFA 20 μl制備慢性炎癥性疼痛模型。

Naive 組小鼠不作任何處理。

（2）RT-PCR 和semi-quantitative PCR

組織中的總RNA 提?。盒∈笪氘惙槁樽砗螅蒙睇}水灌流后取脾臟、淋巴結(jié)、脊髓、腦和DRG。用Trizol 提取RNA。用 OD 儀測量 RNA 濃度與純度，OD260/280 在 1.8-2.0 且 OD260/230大于2 為宜。

每個樣本取1 μg 總RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。引物由生工或Invitrogen（上海）合成，具體引物序列見表1。

半定量RT-PCR 及瓊脂糖凝膠電泳：半定量RT-PCR 實驗所采用的樣本、反應(yīng)體系及引物與Real-time PCR 一致，但反應(yīng)循環(huán)數(shù)不同：比較小鼠CXCL10 在脾臟、淋巴結(jié)、脊髓、腦和DRG 中的表達含量采用的Ct 值為30；比較小鼠CXCR3 在脾臟臟、淋巴結(jié)、脊髓、腦和DRG 中的表達含量采用的Ct 值為35。然后對PCR 產(chǎn)物進行瓊脂糖電泳。

人的脊髓、DRG 和淋巴結(jié)組織RNA 提取和PCR 方法與小鼠一致，具體引物序列見表1。

（3）免疫熒光

表1 小鼠Cxcl10、Cxcr3 和內(nèi)參β-actin 引物序列Table 1 Primer sets for the human and mouse Cxcl10, Cxcr3, β-actin and Gapdh

小鼠經(jīng)異氟烷吸入麻醉后，經(jīng)生理鹽水和4%多聚甲醛灌注固定。取小鼠脾臟和腘窩淋巴結(jié)，4%多聚甲醛后固定過夜，蔗糖脫水后切片，厚度為14 μm。

免疫熒光染色：PBS (0.01 M，pH 值7.4)洗片；加5%羊血清室溫封閉2 h 后加一抗(CXCL10, 1:100; CXCR3, 1:200)，4℃過夜后經(jīng)PBS 漂洗加入Cy3 標記的熒光二抗(1:1000, Jackson ImmunoResearch)；室溫孵育2 h。晾干后封片，激光共聚焦顯微鏡下拍照觀察。

（4）Western Blot 分析

組織蛋白質(zhì)提?。盒∈蠼?jīng)異氟烷麻醉，生理鹽水經(jīng)心臟灌流后取材，用RIPA 蛋白裂解液提取蛋白。用BCA 法測定蛋白濃度。每孔加入30 μg 蛋白進行電泳，濕法轉(zhuǎn)膜將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上；5% BSA 室溫封閉2 h，4℃一抗過夜孵育(CXCR3, 1:1000; GAPDH, 1:1 0000)；次日室溫復(fù)溫1 h 后TBST 漂洗；用5% BSA 稀釋近紅外熒光基團標記的二抗，室溫孵育2 h；Odyssey 雙色紅外熒光掃描儀成像。

人的脊髓和淋巴結(jié)組織CXCR3 蛋白表達檢測方法與小鼠相同。

（5）CSF 樣本及血清樣本收集與處理

小鼠CSF 收集與處理：4%水合氯醛腹腔注射麻醉小鼠，用腦立體定位儀對小鼠頭部進行固定。剃毛后碘伏消毒后劃開皮膚與肌肉，暴露環(huán)枕膜。用玻璃電極抽取CSF 25 μl，-80℃保存。

小鼠血液樣本收集與處理：小鼠尾部采血：小鼠用異氟烷麻醉后將小鼠尾巴用75%酒精棉球反復(fù)擦拭，用剪刀剪去尾尖1～2 mm，用1.5 ml EP管收集尾尖血液，采血后用棉球壓迫止血每次采血100 μl。將新鮮血液放入SST 血清分離管中，室溫下放置30 min，待血細胞凝集后，離心吸取血清，凍于-80 冰箱存放。

人腦脊液CSF 和血液樣本的收集與處理：收集非疼痛病人（Control，無急慢性疼痛病史、無炎癥性疾?。⒓毙詭畎捳钌窠?jīng)痛 (herpes zoster neuralgia, HZN)、帶狀皰疹后神經(jīng)痛 (postherpetic neuralgia, PHN)和骨性關(guān)節(jié)炎 (osteoarthritis, OA) 疼痛病人的血液和腦脊液。本研究經(jīng)東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院倫理委員會批準，所有病人均簽署知情同意書。用腰椎穿刺法采集各組病人腦脊液 1 ml -80℃冰箱凍存。將5 ml 新鮮血液放入SST 血清分離管中，室溫下放置30 min，待血細胞凝集后，離心吸取血清 -80℃冰箱凍存。提供腦脊液樣本和血液樣本的病人的數(shù)量、性別、年齡、病程和視覺模擬評分法 (visual analogue scale, VAS)評分數(shù)據(jù)見表2、3。

（6）ELISA

樣品制備：用RIPA 裂解液提取人淋巴結(jié)和脊髓組織蛋白，具體方法與Western Blot 實驗一致，提取后的蛋白上清用Calibrator Diluent RD5K 進行10 倍稀釋：10 μl 蛋白上清 + 90 μl Calibrator Diluent RD5K。血清和CSF 樣本根據(jù)說明書要求進行稀釋。

根據(jù)試劑盒說明進行操作，每孔加入75 μl Calibrator Diluent RD5K 稀釋后的蛋白樣品。經(jīng)加樣、富集孵育、洗板、加酶標抗體、再次洗板、底物顯色和終止反應(yīng)步驟后酶標儀讀取450 nm 下樣本的OD 值。

表2 腦脊液捐獻者的基本信息(±SEM)Table 2 The general information of CSF donor (±SEM)

表2 腦脊液捐獻者的基本信息(±SEM)Table 2 The general information of CSF donor (±SEM)

視覺模擬評分法VAS Control 8 1F/7M 55.0±5.1 0 0 HZN (< 1 m) 6 4F/2M 63.0±2.9 21.2±3.5 d 5.3±0.6 PHN (> 1 m) 15 7F/8M 68.9±2.0 28.9±20.4 m 5.1±0.4 OA 6 5F/1M 66.0±2.1 15.9±0.6 m 3.8±0.6組別 Group例數(shù)Number性別Gender女/男(F/M)年齡Age疼痛持續(xù)時間Pain duration

表3 血清捐獻者的基本信息(±SEM)Table 3 The general information of serum donor (±SEM)

表3 血清捐獻者的基本信息(±SEM)Table 3 The general information of serum donor (±SEM)

視覺模擬評分法VAS Control 8 1F/7M 55.0±5.1 0 0 HZN (< 1 m) 9 5F/4M 60.1±2.5 16.0±3.1 d 5.6±0.6 PHN (> 1 m) 15 8F/7M 68.8±2.2 25.5±20.5 m 5.5±0.4 OA 6 5F/1M 66.0±2.1 15.9±0.6 m 3.8±0.6組別Group例數(shù)Number性別Gender女/男(F/M)年齡Age疼痛持續(xù)時間Pain duration

擬合標準曲線，根據(jù)OD 值計算樣品濃度：將不同濃度的標準品(500 pg/ml、250 pg/ml、125 pg/ml、62.5 pg/ml、31.3 pg/ml、15.6 pg/ml 和7.8 pg/ml)和其對應(yīng)的OD 值在Excel 上畫出散點圖，為散點圖添加趨勢線，回歸分析類型選擇線性，即Y = A*X + B，R2≥0.98。將每孔樣品的OD 值代入方程，計算樣品濃度。

（7）圖像和統(tǒng)計學(xué)處理

圖像分析及處理：處理使用Image J 軟件對WB 進行圖像處理，統(tǒng)計各條帶的灰度值；用CXCR3 條帶的灰度值與內(nèi)參GAPDH 蛋白灰度值（均扣除背景）的比值作為最終統(tǒng)計數(shù)據(jù)，用以表示相應(yīng)蛋白的相對表達量。

3. 統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié) 果

1. CXCL10 在正常小鼠的脾臟、淋巴結(jié)、DRG、脊髓和腦中均有表達

RT-PCR 擴增曲線顯示，Cxcl10在小鼠脾臟、淋巴結(jié)、DRG、脊髓和腦中都有基礎(chǔ)表達，表達量從高到低依次為脾臟、淋巴結(jié)、脊髓、腦和DRG（見圖1A）。Semi-quantitative PCR 結(jié)果也顯示Cxcl10在上述組織中均有一定量的基礎(chǔ)表達，表達高低順序與RT-PCR 結(jié)果一致（見圖1B）。免疫熒光結(jié)果顯示CXCL10 蛋白在小鼠脾臟和淋巴結(jié)中具有較高的基礎(chǔ)表達，與PCR 結(jié)果相符合（見圖1C、D）。

圖1 CXCL10 在免疫器官和神經(jīng)組織中的基礎(chǔ)表達 (A) RT-PCR 擴增曲線展示Cxcl10 基因在小鼠脾臟、淋巴結(jié)、DRG、脊髓和腦組織中的基礎(chǔ)表達；(B)瓊脂糖凝膠電泳展示Cxcl10 基因在小鼠脾臟、淋巴結(jié)、DRG、脊髓和腦組織中的semi-quantitative PCR 擴增產(chǎn)物；(C)免疫熒光檢測小鼠脾臟中CXCL10 的表達；(D)免疫熒光檢測小鼠淋巴結(jié)中CXCL10 的表達Fig. 1 The basal expression of CXCL10 in the immune organs and nervous tissues of adult mice (A) The amplification curve of real-time PCR shows basal expression of Cxcl10 in the spleen, lymph nodes, DRG, spinal cord, and brain; (B) Agarose gel electrophoresis display products of Cxcl10 semi-quantitative PCR from spleen, lymph nodes, DRG, spinal cord, and brain; (C) Immunofluorescence shows CXCL10 expression in the spleen; (D) Immunofluorescence shows CXCL10 expression in the lymph node.

2. CXCR3 在正常小鼠的脾臟、淋巴結(jié)、DRG、脊髓和腦組織中均有表達

RT-PCR 擴增曲線顯示，Cxcr3在小鼠脾臟、淋巴結(jié)、DRG、脊髓和腦中都有基礎(chǔ)表達，表達量從高到低依次為淋巴結(jié)、脾臟、脊髓、腦和DRG（見圖2A）。Semi-quantitative PCR 結(jié)果也顯示Cxcr3在上述組織中均有一定量的基礎(chǔ)表達，表達高低順序與擴增曲線顯示結(jié)果一致（見圖2B）。免疫熒光結(jié)果顯示CXCR3 蛋白在小鼠淋巴結(jié)和脾臟中都具有較高的基礎(chǔ)表達，與PCR 結(jié)果相符合（見圖2C、D）。

3.神經(jīng)病理性疼痛小鼠CSF 和血清中CXCL10含量顯著增加

本研究采用ICR 小鼠構(gòu)建了SNL 誘導(dǎo)的神經(jīng)病理性疼痛模型、福爾馬林誘導(dǎo)的急性痛模型以及CFA 誘導(dǎo)的慢性炎癥痛模型，取CSF 與血清進行CXCL10 含量測定。ELISA 結(jié)果顯示，與Naive 和Sham 組相比，SNL 術(shù)后10 天小鼠CSF 中CXCL10含量顯著上升（見圖3A）；然而，F(xiàn)ormalin 誘導(dǎo)的急性炎癥性疼痛和CFA 誘導(dǎo)的慢性炎癥性疼痛小鼠CSF 中CXCL10 含量與Naive 組相比無明顯變化（見圖3B、C）。與Na?ve 和Sham 組相比，SNL 術(shù)后1天和10天小鼠血清中CXCL10含量均顯著上升（見圖3D）；注射Formalin 的小鼠血清中CXCL10 含量與Naive 組相比無明顯變化（見圖3E）；注射CFA 的小鼠血清中CXCL10 含量與Naive 組相比顯著上升（見圖3F）。

4. CXCL10 及CXCR3 在正常人淋巴結(jié)、DRG和脊髓中均有表達

圖2 CXCR3 在免疫器官和神經(jīng)組織中的基礎(chǔ)表達 (A) RT-PCR 擴增曲線展示Cxcr3 基因在小鼠脾臟、淋巴結(jié)、DRG、脊髓和腦組織中的基礎(chǔ)表達；(B)瓊脂糖凝膠電泳展示Cxcr3 基因在小鼠脾臟、淋巴結(jié)、DRG、脊髓和腦組織中的semi-quantitative PCR 擴增產(chǎn)物；(C)免疫熒光檢測小鼠脾臟中CXCR3 的表達；(D)免疫熒光檢測小鼠淋巴結(jié)中CXCR3 的表達。Fig. 2 The basal expression of CXCR3 in the immune organs and nervous tissues of adult mice (A) The amplification curve of real-time PCR shows basal expression of Cxcr3 in the spleen, lymph nodes, DRG, spinal cord, and brain; (B) Agarose gel electrophoresis display products of Cxcr3 semi-quantitative PCR from the spleen, lymph nodes, DRG, spinal cord, and brain; (C) Immunofluorescence shows CXCR3 expression in the spleen; (D) Immunofluorescence shows CXCR3 expression in the lymph node.

為了確定CXCL10 及CXCR3 在人免疫器官和神經(jīng)組織中的表達，本研究用RT-PCR 檢測了正常人的脊髓、DRG 和淋巴結(jié)中Cxcl10和Cxcr3的表達。結(jié)果顯示Cxcl10mRNA 表達從高到低依次為淋巴結(jié)、脊髓和DRG，Cxcr3mRNA 表達從高到低依次為淋巴結(jié)、DRG 和脊髓（見圖4A）。Western Blot結(jié)果表明CXCR3在脊髓和淋巴結(jié)中均有表達，且淋巴結(jié)中表達高于脊髓（見圖4B），ELISA 結(jié)果顯示CXCL10 在人脊髓和淋巴結(jié)中均有表達，同樣是淋巴結(jié)中的表達高于脊髓（見圖4C）。

5. CXCL10 在神經(jīng)病理性疼痛病人以及關(guān)節(jié)炎疼痛病人CSF 和血清中的含量

為了檢測CXCL10 在疼痛病人CSF 和血清中是否含量增加，我們用ELISA 方法檢測了非疼痛病人、急性帶狀皰疹、帶狀皰疹后神經(jīng)痛和骨性關(guān)節(jié)炎疼痛病人CSF 和血清中CXCL10 的含量。結(jié)果顯示，急性帶狀皰疹和帶狀皰疹后神經(jīng)痛病人CSF中CXCL10 含量顯著高于對照組，而骨性關(guān)節(jié)炎痛病人CSF 中CXCL10 未見增加（見圖5A）。同樣檢測了他們血清中CXCL10 的含量，ELISA 結(jié)果顯示只有帶狀皰疹后神經(jīng)痛病人血清中CXCL10 的含量顯著高于對照組（見圖5B）。

圖3 不同疼痛模型小鼠CSF 及血清中CXCL10 蛋白含量 (A-C) CXCL10 在神經(jīng)病理性疼痛模型、急性和慢性炎癥疼痛模型小鼠CSF 中的含量變化（A:*P < 0.05，與Sham組相比較，Student's t-test；B, C: P > 0.05，與Naive 組相比，Student's t-test）；(D-F) CXCL10 在神經(jīng)病理性疼痛模型、急性和慢性炎癥疼痛模型小鼠血清中的含量變化（D:*** P < 0.001, **P < 0.01，與Sham 組相比，Student's t-test；E: P > 0.05，與Naive 組相比，Student's t-test；F:*** P < 0.001，與Naive 組相比，Student's t-test）Fig. 3 CXCL10 levels in the Serum and CSF of different pain models of mice (A-C) CXCL10 levels in the CSF of SNL-induced neuropathic pain mice, the formalin-induced acute pain mice, and CFA-induced chronic inflammatory pain mice (A: *P < 0.05, compared with group Sham, Student's t-test; B, C: P > 0.05, compared with group Naive, Student's t-test); (D-F) CXCL10 levels in the serum of SNL-induced neuropathic pain mice, the formalin-induced acute pain mice, and CFA-induced inflammatory pain mice (D: ***P < 0.001, ** P < 0.01, compared with group Sham, Student's t-test; E: P > 0.05, compared with group Naive, Student's t-test; F: ***P < 0.001, compared with group Naive, Student's t-test).

圖4 CXCR3 和CXCL10 在人淋巴結(jié)、脊髓和DRG 中的基礎(chǔ)表達 (A)瓊脂糖凝膠電泳展示Cxcl10 與Cxcr3 基因在人脊髓、DRG 和淋巴結(jié)中的基礎(chǔ)表達情況；(B)正常人脊髓和淋巴結(jié)中CXCR3 蛋白表達情況，淋巴結(jié)中CXCR3 表達高于脊髓。注：脊髓上樣量30 μg，淋巴結(jié)上樣量為15 μg；(C)正常人脊髓和淋巴結(jié)中CXCL10 蛋白表達情況，淋巴結(jié)中CXCL10 表達高于脊髓（***P < 0.01, Student's t-test）Fig. 4 The basal expression of CXCL10 and CXCR3 in the lymph node, spinal cord, and DRG of healthy subjects (A) Agarose gel electrophoresis show basal expression of Cxcl10 and Cxcr3 in human DRG, spinal cord and lymph nodes; (B) Western blot determination of CXCR3 expression in human spinal cord and lymph nodes, the expression of CXCR3 in the lymph node is higher than that in the spinal cord. Please note that 30 μg spinal cord sample and 15 μg lymph node sample were loaded; (C) ELISA determination of CXCL10 expression in the spinal cord and lymph node. The expression of CXCL10 in the lymph node is significantly higher than that in the spinal cord (***P < 0.01, Student's t-test).

圖5 不同疼痛類型病人CSF 及血清中CXCL10 蛋白含量 (A) CXCL10 在急性帶狀皰疹、帶狀皰疹后神經(jīng)痛和骨性關(guān)節(jié)炎疼痛病人CSF 中的含量變化（**P < 0.01, *P < 0.05與Control 組相比，one-way ANOVA）；(B) CXCL10 在急性帶狀皰疹、帶狀皰疹后神經(jīng)痛和骨性關(guān)節(jié)炎疼痛病人血清中的含量變化（*P < 0.05, 與Control 組相比，one-way ANOVA）Fig. 5 CXCL10 levels in the serum and CSF of patients with different pain types (A) CXCL10 levels in the CSF of HZN patients, PHN patients, and OA patients (**P < 0.01, *P < 0.05, compared with group Control, one-way ANOVA); (B) CXCL10 levels in the serum of HZN, PHN, and OA patients (*P < 0.05, compared with group Control, one-way ANOVA).

討 論

本研究采用RT-PCR、半定量RT-PCR、Western Blot、免疫熒光等生化手段，結(jié)合神經(jīng)病理性疼痛模型、急慢性炎癥疼痛模型研究了小鼠CXCL10 與其受體CXCR3 的組織表達情況，以及正常和模型小鼠的血清和CSF 中CXCL10 的含量變化。而且，本研究還檢測了CXCL10 及CXCR3 在正常人和疼痛病人不同組織中的基礎(chǔ)表達以及在血清和CSF 中的含量。研究結(jié)果顯示：CXCL10 和CXCR3 在小鼠脾臟、淋巴結(jié)、DRG、脊髓、腦組織中均有基礎(chǔ)表達；在神經(jīng)病理性疼痛、慢性炎癥疼痛等慢性疼痛情況下小鼠CSF 和血清中CXCL10 含量有不同程度變化，而急性疼痛時無明顯變化；CXCL10 和CXCR3 在正常人淋巴結(jié)、脊髓和CSF 中均有表達，在帶狀皰疹后神經(jīng)痛病人的CSF 和血清中CXCL10含量也顯著增加，但骨性關(guān)節(jié)炎性疼痛病人CSF 和血清中無顯著變化。提示CXCL10 在CSF 和血清中的含量變化可能與神經(jīng)病理性疼痛密切相關(guān)。

PCR 結(jié)果發(fā)現(xiàn)CXCL10 和CXCR3 在小鼠脾臟、淋巴結(jié)、DRG、脊髓和腦組織中均有表達。由于脾臟和淋巴結(jié)是主要的外周免疫器官，大量的T 淋巴細胞和B 淋巴細胞定居在其中發(fā)育并成熟，且CXCL10 和CXCR3 在免疫細胞上高表達[14]，因此CXCL10 和CXCR3 在脾臟和淋巴結(jié)中的基礎(chǔ)表達相對較高。本研究證明CXCL10 和CXCR3 在DRG、脊髓和腦中也有一定的基礎(chǔ)表達，提示可能和神經(jīng)系統(tǒng)的功能調(diào)節(jié)有關(guān)。有文獻報道CXCL10/CXCR3 信號通過介導(dǎo)神經(jīng)免疫調(diào)節(jié)參與神經(jīng)炎性疾病的發(fā)病機制調(diào)控[15]。過敏性接觸性皮炎小鼠DRG 中的CXCL10和CXCR3 表達上調(diào)，參與癢覺信息的調(diào)控[8]。本實驗室也曾證明正常情況下CXCL10 與其受體CXCR3 均在小鼠脊髓背角神經(jīng)元中有表達；SNL 后脊髓內(nèi)的CXCL10 表達大幅增加，且除了在神經(jīng)元中表達，還能在星形膠質(zhì)細胞中表達；脊髓中CXCL10/CXCR3信號能夠介導(dǎo)疼痛條件下脊髓背角神經(jīng)元興奮性和突觸傳遞的調(diào)節(jié)，促進神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生和維持[11]。CXCL10/CXCR3 信號在腦中還能夠介導(dǎo)高血糖癥大鼠海馬區(qū)小膠質(zhì)細胞激活和星形膠質(zhì)細胞增生，調(diào)控長期的突觸形成和行為表現(xiàn)[16]。

不同疼痛條件下人和小鼠CSF 和血清中的CXCL10 在神經(jīng)病理性疼痛中的含量情況還未見報道。本研究中觀察到CXCL10 的基礎(chǔ)表達分布較為廣泛。神經(jīng)病理性疼痛模型小鼠CSF 和血清中的CXCL10 含量均顯著上升，CFA 引起的炎癥痛模型小鼠血清中CXCL10 含量顯著上升、但在CSF 中上調(diào)不顯著，表明CSF 中的CXCL10 含量變化與神經(jīng)病理性疼痛相關(guān)，和炎癥痛沒有明顯的相關(guān)。這種現(xiàn)象的原因可能有：①引起神經(jīng)病理性疼痛的外周神經(jīng)損傷和神經(jīng)病變對中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥影響更大；②注射CFA 對外周免疫系統(tǒng)有重要影響、但對中樞神經(jīng)系統(tǒng)基因表達影響不明顯；③ Formalin 引起的組織損傷在短時間內(nèi)對外周和中樞影響都較小。另外，CXCL10 在不同疼痛病人血清和CSF 中含量不同，不論是HZN 還是PHN 病人，他們的CSF 中CXCL10 含量較對照組均顯著上升，PHN 病人血清中CXCL10 含量也顯著上升，這與神經(jīng)病理性疼痛小鼠CXCL10 在CFS 和血清中的變化一致。以上結(jié)果表明CSF 和血清中的CXCL10 含量變化與慢性神經(jīng)病理性疼痛發(fā)生發(fā)展相關(guān)。以往研究表明CXCL10在外周和中樞能夠?qū)е律窠?jīng)病理性疼痛的產(chǎn)生和維持[11]，當降低CXCL10 表達后能夠減輕疼痛行為，由此推測當疼痛治愈后，CXCL10 在外周和中樞的表達有可能降低，血液和CSF 中的含量也有可能降低。

綜上所述，PHN 病人CSF 和血清中CXCL10特異性升高，具有重要的診斷學(xué)意義。目前臨床上缺乏慢性痛發(fā)病前期以及預(yù)后的蛋白類診斷標志物。趨化因子由于能夠參與神經(jīng)炎癥和疼痛調(diào)節(jié)，且具備蛋白分子量小、易于擴散進入血液和CSF、易于免疫學(xué)檢測等優(yōu)點，因此很可能成為NP 診斷和治療的標志物。本研究證實趨化因子CXCL10 具備上述特點或可成為檢測神經(jīng)病理疼痛的潛在生物診斷標記物，具有良好的應(yīng)用開發(fā)前景。值得注意的是本研究中臨床樣本量還較小，需要以后收集更多臨床樣本分析疼痛程度與血液和CSF 中CXCL10含量的相關(guān)性。而且，本研究只檢測了SNL 模型小鼠和PHN 病人的血清和CSF 中的CXCL10 含量，在其它類型的神經(jīng)病理性疼痛模型或者其它臨床類型的NP 是否有同樣變化，仍需進一步研究。另外，由于血清中CXCL10 可作為系統(tǒng)性紅斑狼瘡、慢性移植物抗宿主病和川崎病等疾病的生物標志物[17～19]，CSF 中的CXCL10 含量還與脊髓損傷以及損傷后的運動恢復(fù)程度相關(guān)[20]，因此在將來的研究和應(yīng)用中還應(yīng)考慮CXCL10 與上述疾病并發(fā)時，CXCL10 的診斷意義和含量變化特點。