輸入蛋白α3 在外周感覺(jué)神經(jīng)元調(diào)節(jié)慢性疼痛

輸入蛋白α (Importin α) 是真核細(xì)胞進(jìn)行核轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中起關(guān)鍵作用的核轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的一個(gè)亞家族，參與大細(xì)胞（如神經(jīng)元）的胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程。盡管不同輸入蛋白之間的特異性存在重疊，但由于表達(dá)譜的差異和對(duì)被載蛋白親和力的不同，使得單個(gè)輸入蛋白能調(diào)節(jié)特殊的功能。本文作者試圖通過(guò)對(duì)Importin α3 敲除鼠的行為學(xué)研究來(lái)探索神經(jīng)元中輸入蛋白的功能。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Importin α3 敲除鼠特異地表現(xiàn)為對(duì)傷害性熱刺激的反應(yīng)減弱，并在注射辣椒素后沒(méi)有表現(xiàn)出明顯的痛反應(yīng)。

本文作者通過(guò)鞘內(nèi)注射腺相關(guān)病毒9 (AAV9) 急性敲減或過(guò)表達(dá)Importin α3 等方法來(lái)確認(rèn)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，與給予對(duì)照shRNA 的小鼠相比，Importin α3 敲減鼠表現(xiàn)為對(duì)傷害性熱反應(yīng)的縮足潛伏期延長(zhǎng)，而對(duì)探索行為和運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)功能沒(méi)有任何顯著的影響。通過(guò)對(duì)敲除鼠進(jìn)行Importin α3 過(guò)表達(dá)后的表型反轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)證實(shí)了以上表型的特異性。相反，在敲除鼠中進(jìn)行shRNA 敲減后不能進(jìn)一步地延長(zhǎng)縮足潛伏期。因此，Importin α3 的特異性缺失會(huì)減弱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物對(duì)各種傷害性刺激的反應(yīng)。

接下來(lái)，本文作者用坐骨神經(jīng)分支選擇損傷模型 (SNI) 來(lái)評(píng)估Importin α3 在神經(jīng)病理性疼痛中的作用。在SNI 后的3 個(gè)多月內(nèi)定期檢測(cè)野生型 (WT) 小鼠和基因敲除小鼠對(duì)機(jī)械刺激的敏感性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，WT 鼠和Importin α3 敲除鼠的早期反應(yīng)相似，但從第60 天（晚期）開始有所不同：Importin α3缺失的小鼠表現(xiàn)出對(duì)SNI 的耐受性增加、對(duì)觸覺(jué)的敏化性降低、并減少了無(wú)刺激狀態(tài)下的足爪蜷縮現(xiàn)象，而WT 小鼠沒(méi)有表現(xiàn)出任何的改善。在SNI 造模之前，敲減Importin α3 也得到了類似的結(jié)果：從SNI 造模后60 天開始，給予對(duì)照shRNA 的模型鼠在CatWalk 步態(tài)分析中表現(xiàn)出典型的爪印寬度減少的自發(fā)足爪蜷縮表型，而給予Importin α3 shRNA的模型鼠表現(xiàn)出步態(tài)參數(shù)的改善和足爪蜷縮表型的減輕。機(jī)械敏感性實(shí)驗(yàn)表明，對(duì)照shRNA 鼠和Importin α3 shRNA 鼠的神經(jīng)病理性疼痛反應(yīng)在損傷后60 天內(nèi)的表型相似；而從第60 天起，與對(duì)照shRNA 鼠相比，Importin α3 敲減鼠的縮足反射明顯改善。因此，Importin α3 的敲除和急性敲減都顯著緩解了SNI 誘導(dǎo)的慢性神經(jīng)病理性疼痛。

由于多種不同類型的細(xì)胞參與神經(jīng)病理性疼痛，Importin α3 對(duì)神經(jīng)病理性疼痛的作用是否特異地發(fā)生在感覺(jué)神經(jīng)元呢？本文作者首先驗(yàn)證了鞘內(nèi)注射AAV-PHP.S（一種外周神經(jīng)元特異性衣殼亞型）可特異性并有效地感染背根神經(jīng)節(jié) (DRG) 神經(jīng)元。之后在SNI 模型鼠鞘內(nèi)注射AAV-PHP.S 載送Importin α3 shRNA，行為學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，SNI 模型建立后在感覺(jué)神經(jīng)元內(nèi)敲減Importin α3 也能減輕神經(jīng)病理性疼痛。

為了進(jìn)一步研究Importin α3 敲除減輕SNI 誘導(dǎo)的神經(jīng)病理性疼痛的分子機(jī)制，本文作者比較了SNI 后1 周和11 周（疼痛明顯緩解時(shí)）的DRG 轉(zhuǎn)錄組，篩選出一些因Importin α3 缺失而受到影響的轉(zhuǎn)錄因子。在這些因子中，由于c-Fos 是一個(gè)公認(rèn)的疼痛通路激活標(biāo)志物，因此激活蛋白1 (AP1) 家族被優(yōu)先考慮進(jìn)行下一步研究。對(duì)SNI 后4 個(gè)AP1靶基因的定量分析顯示，與WT 相比，Importin α3缺失的DRG 中Syngap1 和RTL1 的表達(dá)減少，而Syngap1既往被認(rèn)為是參與觸覺(jué)處理過(guò)程的一個(gè)分子。

c-Fos 的特點(diǎn)是既有Importin α 結(jié)合的核定位信號(hào)，又有轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 (transportin) 的結(jié)合基序，而轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是一種獨(dú)特的核輸入因子。文獻(xiàn)報(bào)道Importin α和c-Fos 兩個(gè)核輸入因子家族的多個(gè)成員在感覺(jué)神經(jīng)元中廣泛表達(dá)。本研究也證實(shí)Importin α3 和c-Fos 在DRG 神經(jīng)元中確有表達(dá)。并發(fā)現(xiàn)它們之間的相互作用通過(guò)在轉(zhuǎn)染的Neuro2a 細(xì)胞中鄰近生物素化方法和感覺(jué)神經(jīng)元中的內(nèi)源性蛋白鄰位連接技術(shù) (PLA) 而證實(shí)。在Importin α3 敲除的神經(jīng)元中，c-Fos 的基礎(chǔ)水平表達(dá)沒(méi)有改變。在WT 鼠DRG 神經(jīng)元中c-Fos 大部分在核內(nèi)，而在Importin α3 缺失神經(jīng)元中只有很少或幾乎沒(méi)有c-Fos 的核積聚現(xiàn)象。因此，Importin α3 是成熟感覺(jué)神經(jīng)元發(fā)生c-Fos 核積聚所必需的。

c-Fos 抑制劑T-5224 是一個(gè)鎮(zhèn)痛有效性正在研究中的藥物。本文作者通過(guò)腹腔注射T-5224 對(duì)WT和Importin α3 缺失鼠的作用進(jìn)行了比較，研究發(fā)現(xiàn)T-5224 可延長(zhǎng)WT 鼠對(duì)傷害性熱刺激的縮足潛伏期，但在Importin α3 缺失鼠中除了已經(jīng)存在的疼痛減弱之外，沒(méi)有更大的影響。然而，T-5224 改善了WT鼠在SNI 誘導(dǎo)后1 周的vonFrey 實(shí)驗(yàn)中的縮足潛伏期，而對(duì)這個(gè)時(shí)間點(diǎn)的Importin α3 敲除或敲減鼠沒(méi)有影響。因此，認(rèn)為干預(yù)c-Fos 具有鎮(zhèn)痛作用，而Importin α3 可能主要在神經(jīng)病理性疼痛的后期維持階段發(fā)揮作用。

為了確認(rèn)AP1 通路是晚期神經(jīng)病理性疼痛所必需的，本文作者在SNI 模型鼠對(duì)c-Fos 或c-Jun 基因進(jìn)行了敲減。與Importin α3缺失的效果類似，c-Fos敲減減弱了對(duì)傷害性熱刺激的敏感性，而不影響基礎(chǔ)機(jī)械刺激的敏感性；而c-Jun 敲減既減弱了對(duì)傷害性熱刺激的敏感性，也減輕了對(duì)傷害性機(jī)械刺激的敏感性。進(jìn)一步比較c-Fos、c-Jun 和Importin α3敲減在SNI 模型中作用，發(fā)現(xiàn)這三種shRNA 均在神經(jīng)損傷后67～90 天時(shí)間段，顯著緩解了神經(jīng)病理性疼痛；此外，神經(jīng)元內(nèi)特異性表達(dá)a-Fos（即AP1 顯性負(fù)型形式），顯著降低了小鼠對(duì)傷害性熱刺激敏感性，而不影響對(duì)基礎(chǔ)機(jī)械刺激敏感性，但能顯著緩解SNI 的晚期神經(jīng)病理性疼痛。因此，認(rèn)為抑制AP1 通路可以減輕SNI 模型誘發(fā)的神經(jīng)病理性疼痛。

最后，本文作者使用Connectivity Map (CMap) 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行生物信息學(xué)篩選，搜索可能作用于Importin α3-c-Fos 通路的藥物。篩查了大約50 種CMap 得分較高的化合物，其中有35 種對(duì)疼痛的作用還不明確。本文作者選擇了其中3 種化合物進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)，它們是阿馬靈（抗心律失常的生物堿）、舒馬唑（強(qiáng)心劑）和磺胺甲二唑（抗生素）。研究發(fā)現(xiàn)，阿馬靈對(duì)傷害性熱刺激無(wú)影響，但舒馬唑和磺胺甲二唑在實(shí)驗(yàn)中均表現(xiàn)出有效性：后兩種藥物在SNI 的早期和晚期都表現(xiàn)出時(shí)間和劑量依賴性的鎮(zhèn)痛作用，與敲除或敲減Importin α3 一樣有效地改善SNI 鼠對(duì)傷害性機(jī)械刺激的反應(yīng)。此外，舒馬唑和磺胺甲二唑可顯著減少WT 神經(jīng)元中c-Fos的核積聚，但對(duì)Importin α3 缺失神經(jīng)元中的c-Fos核積聚沒(méi)有任何影響。以上研究結(jié)果表明，模擬Importin α3 缺失的藥物可以重現(xiàn)在Importin α3 突變鼠中觀察到的鎮(zhèn)痛和c-Fos 核定位效應(yīng)。

綜上所述，在神經(jīng)病理性疼痛的維持階段，Importin α3 通過(guò)干擾感覺(jué)神經(jīng)元c-Fos 的核輸入過(guò)程，降低對(duì)傷害性刺激的敏感性，而特異性發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用。直接抑制c-Fos 功能，在神經(jīng)病理性疼痛的早期和維持階段均可有效鎮(zhèn)痛，表明c-Fos 核輸入的其他方式或其他轉(zhuǎn)錄因子可能控制早期的痛反應(yīng)過(guò)程，而Importin α3 在晚期慢性疼痛中起關(guān)鍵作用。最近有研究發(fā)現(xiàn)在脊髓環(huán)路水平上，快速厭惡行為和持續(xù)性疼痛反應(yīng)有所不同，不同類型細(xì)胞在機(jī)械敏感性和傷害感受作用也不同。本研究表明，Importin α3 對(duì)持續(xù)性神經(jīng)病理性疼痛的調(diào)控作用發(fā)生在外周感覺(jué)神經(jīng)元水平。以前的研究發(fā)現(xiàn)Importin α3 和c-Fos 在小鼠和人類DRG 中是保守的，而最近的一項(xiàng)研究報(bào)道了神經(jīng)病理性疼痛病人DRG中AP1 家族基因顯著上調(diào)，突顯了Importin α3 作為鎮(zhèn)痛靶點(diǎn)的潛力。由于現(xiàn)有鎮(zhèn)痛藥的止痛效果有限，加上明顯的不良反應(yīng)，慢性疼痛的臨床治療滿意度不足。而最常用的阿片類藥物具有耐受性和依賴性的多重風(fēng)險(xiǎn)，又可能導(dǎo)致不同程度的濫用。目前在疼痛領(lǐng)域中正在進(jìn)行藥物研發(fā)的大多數(shù)靶點(diǎn)屬于離子通道和神經(jīng)遞質(zhì)受體，它們多位于質(zhì)膜和突觸處。Importin α3 在分子識(shí)別和亞細(xì)胞定位水平提供了可替代的新靶點(diǎn)，為未來(lái)鎮(zhèn)痛藥的研發(fā)提供了新機(jī)遇。