不同切片厚度免疫組化標(biāo)記Ki-67對(duì)惰性淋巴瘤和侵襲性淋巴瘤鑒別診斷的影響

吉佳樂(lè)，曾 暉，徐 丹，張 宇，林 爽，姚馨悅，何志承

非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin lymphoma, NHL)是臨床上最常見(jiàn)的淋巴系統(tǒng)惡性增殖性疾病，占整個(gè)淋巴瘤的90%以上，發(fā)病率和病死率位居惡性腫瘤前10位，且呈逐年增加的趨勢(shì)[1]。目前臨床上最常見(jiàn)的兩種NHL分別是黏膜相關(guān)淋巴組織(mucosa associated lymphoid tissue, MALT)淋巴瘤和彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤(diffuse large B cell lymphoma, DLBCL)。Ki-67作為反應(yīng)細(xì)胞增殖的重要標(biāo)志物，其增殖指數(shù)(proliferation index, PI)高低可用于淋巴瘤分級(jí)鑒別診斷和預(yù)后指導(dǎo)，且Ki-67 PI值越高，患者預(yù)后越差[2]。在病理診斷工作中，通常采用免疫組織化學(xué)(immunohistochemistry, IHC)方法對(duì)Ki-67表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，其結(jié)果判讀的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性至關(guān)重要。ASCO/CAP指南指出處理手術(shù)病理標(biāo)本時(shí)，常規(guī)HE切片厚度應(yīng)在4～5 μm，但對(duì)IHC切片厚度并沒(méi)有給出明確標(biāo)準(zhǔn)。因此，本文選取了2、4、6、8 μm 4種切片厚度，對(duì)石蠟切片厚度與IHC染色中惰性淋巴瘤和侵襲性淋巴瘤組織Ki-67表達(dá)的影響進(jìn)行初步探討。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源收集陸軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院2016年4月～2019年4月收治的淋巴瘤標(biāo)本46例，其中MALT淋巴瘤18例，年齡46～78歲；DLBCL 28例，年齡27～77歲；所有患者術(shù)前均未進(jìn)行任何治療。

1.2 主要試劑及儀器Ki-67、OptiView DAB IHC Detection Kit購(gòu)自美國(guó)Ventana公司；BenchMark XT全自動(dòng)免疫組化染色機(jī)購(gòu)自美國(guó)Ventana公司。

1.3 IHC標(biāo)本經(jīng)固定脫水后制成蠟塊，并分別以2、4、6、8 μm厚度連續(xù)切片，60 ℃烤片備用。將制備好的切片放入BenchMark XT中，并設(shè)定相應(yīng)程序進(jìn)行染色：75 ℃烤片4 min；EZ Prep溶液76 ℃脫蠟4 min；Cell Conditioning Solution(CC1)抗原修復(fù)液99 ℃修復(fù)30 min；抑制劑孵育45 min；加入Ki-67抗體60 μL，37 ℃孵育40 min；Reaction Buffer Concentrate(10×)緩沖液清洗5 min；37 ℃下二抗孵育8 min；DAB顯色8 min，蘇木精Ⅱ襯染12 min，返藍(lán)液返藍(lán)4 min。

1.4 IHC結(jié)果判定平均陽(yáng)性染色面積百分比(average positive staining area percentage, APSAP)，可反映相應(yīng)病例染色結(jié)果中的陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)情況。姜洋等[3]研究表明：APSAP法分析IHC結(jié)果與人工計(jì)數(shù)分析方法的符合程度較高，可以作為衡量圖片中陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)的方法。細(xì)胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒為Ki-67陽(yáng)性細(xì)胞，同一病例不同切片厚度隨機(jī)選取8個(gè)(200×)相同視野。用Image J軟件對(duì)每個(gè)標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果中的陽(yáng)性信號(hào)進(jìn)行定量分析，得到相應(yīng)的APSAP，與臨床判讀的實(shí)際陽(yáng)性信號(hào)比例相比，誤差約5%。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 22.0軟件對(duì)Ki-67不同表達(dá)組的APSAP數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。采用t檢驗(yàn)和Two-way ANOVA分別對(duì)組內(nèi)和組間進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

為減少統(tǒng)計(jì)誤差，本實(shí)驗(yàn)根據(jù)Ki-67判讀結(jié)果，將MALT淋巴瘤分為低表達(dá)組(0≤Ki-67陽(yáng)性率<20%)、較低表達(dá)組(20%≤Ki-67陽(yáng)性率<40%)；將DLBCL分為中表達(dá)組(40%≤Ki-67陽(yáng)性率<60%)、較高表達(dá)組(60%≤Ki-67陽(yáng)性率<80%)、高表達(dá)組(Ki-67陽(yáng)性率≥80%)。

2.1 切片厚度對(duì)染色強(qiáng)度的影響與2 μm厚度切片相比，4、6、8 μm厚度切片非特異性染色逐漸增多；6、8 μm厚度切片的組織結(jié)構(gòu)與2、4 μm厚度切片相比出現(xiàn)一定程度組織脫落的現(xiàn)象(圖1～3)。切片厚度與MALT淋巴瘤和DLBCL中Ki-67表達(dá)呈正相關(guān)，隨著切片厚度的增加，病灶細(xì)胞核染色逐漸加深；當(dāng)切片厚度在4 μm(±1 μm)時(shí)，組織結(jié)構(gòu)相對(duì)完整，背景較為干凈，更利于細(xì)胞計(jì)數(shù)。

①A①B①C①D②A②B②C②D③A③B③C③D

2.2 切片厚度對(duì)APSAP的影響Ki-67低、較低、中、較高及高表達(dá)組中，各切片厚度之間比較差異有顯著性(P<0.05，表1)。比較各組中4種切片厚度的APSAP，結(jié)果提示組織切片越厚，其對(duì)應(yīng)的APSAP值越高。比較5組Ki-67表達(dá)中各組間4種切片厚度對(duì)應(yīng)的APSAP增長(zhǎng)幅度和標(biāo)準(zhǔn)差可以發(fā)現(xiàn)：低表達(dá)組、較高及高表達(dá)組中厚度4 μm或6 μm切片APSAP對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)差分別低于2 μm和8 μm。綜合分析結(jié)果顯示：隨著切片厚度的增加，Ki-67的APSAP也隨之增加；組織切片厚度為4 μm或6 μm時(shí)，誤差相對(duì)較小，可得到較為穩(wěn)定可靠的檢測(cè)結(jié)果。

表1 淋巴瘤組織不同切片厚度與Ki-67 APSAP的關(guān)系

3 討論

NHL具有很強(qiáng)的異質(zhì)性，根據(jù)腫瘤細(xì)胞增殖速度和臨床特點(diǎn)，臨床上主要將NHL分為惰性淋巴瘤、侵襲性淋巴瘤和高度侵襲性淋巴瘤[4]。目前最常見(jiàn)的是MALT淋巴瘤和DLBCL，MALT淋巴瘤臨床呈惰性表現(xiàn)；DLBCL有高度侵襲性且生長(zhǎng)快速，若低度惡性的MALT淋巴瘤患者不及時(shí)治療，惡化為DLBCL的機(jī)率較大[5]?；顧z穿刺組織如胃、腸等標(biāo)本較小且部分含有壞死或纖維化的病變成分，僅靠單一的形態(tài)學(xué)分析難以對(duì)NHL進(jìn)行準(zhǔn)確的分型分級(jí)，需結(jié)合免疫組化標(biāo)記對(duì)NHL進(jìn)行聯(lián)合診斷。Ki-67作為一種反映NHL細(xì)胞增殖活性的核表達(dá)蛋白，是MALT淋巴瘤和DLBCL鑒別診斷的關(guān)鍵指標(biāo)，Ki-67 PI是低度惡性MALT轉(zhuǎn)化為DLBCL的一種量化指標(biāo)[6-7]。Broyde等[8]研究顯示，Ki-67 PI為45%時(shí)，可作為區(qū)分惰性淋巴瘤和侵襲性淋巴瘤的臨界值，侵襲性淋巴瘤惡性程度高于惰性淋巴瘤，且在高侵襲性淋巴瘤中Ki-67表達(dá)顯著高于惰性淋巴瘤。Hashmi等[9]研究表明，Ki-67在MALT淋巴瘤中陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)一般不高于20%，在DLBCL中陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)一般不低于40%，有的呈過(guò)表達(dá)，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)達(dá)90%以上。由于淋巴組織細(xì)胞豐富、間質(zhì)少，切片過(guò)厚、染色深或有不著色的發(fā)白區(qū)等都會(huì)對(duì)病理醫(yī)師診斷造成困擾。

文獻(xiàn)報(bào)道，除標(biāo)本類(lèi)型、標(biāo)本的固定及脫水、石蠟包埋、切片質(zhì)量、抗原修復(fù)、一抗孵育、實(shí)驗(yàn)室水質(zhì)等因素外，組織切片厚度對(duì)IHC結(jié)果也存在一定影響[10-11]。由于淋巴瘤腫瘤細(xì)胞胞核較大，如果切片較薄可能使部分抗原信號(hào)丟失，導(dǎo)致Ki-67檢測(cè)受影響；而切片較厚則導(dǎo)致組織切片脫落，細(xì)胞計(jì)數(shù)過(guò)程中需不斷調(diào)節(jié)顯微鏡微距，同時(shí)也不易區(qū)分核分界，容易造成細(xì)胞計(jì)數(shù)差異，導(dǎo)致結(jié)果誤判。因此，需要探索出適宜的切片厚度，既能夠保持組織細(xì)胞完整性，又能染色均勻，易于計(jì)數(shù)，得到比較準(zhǔn)確穩(wěn)定的計(jì)數(shù)結(jié)果，為臨床病理診斷提供可靠依據(jù)。有研究報(bào)道組織切片間2 μm的差異對(duì)染色強(qiáng)度有一定程度的影響，導(dǎo)致IHC中標(biāo)志物染色結(jié)果的錯(cuò)誤判讀。本實(shí)驗(yàn)對(duì)MALT淋巴瘤和DLBCL兩種病變標(biāo)本切片厚度分別選取2、4、6、8 μm四個(gè)變量進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，隨著切片厚度的增加，病變部位細(xì)胞核染色逐漸加深：當(dāng)切片厚度為2 μm時(shí)，暴露細(xì)胞核層數(shù)相對(duì)較少，組織抗原暴露不充分，使IHC染色較淺且顏色對(duì)比不鮮明，對(duì)于陽(yáng)性細(xì)胞較少的標(biāo)本不好計(jì)數(shù)，同時(shí)病灶細(xì)胞核染色較淺；隨著切片厚度的增加，暴露細(xì)胞核層數(shù)逐漸增多，個(gè)別病灶細(xì)胞可能出現(xiàn)重疊，所以細(xì)胞核染色逐漸加深；此外，隨著切片厚度的增加，組織橫斷面細(xì)胞數(shù)增加，細(xì)胞核染色強(qiáng)度為3+的細(xì)胞數(shù)相對(duì)多于細(xì)胞核染色強(qiáng)度為2+和1+的細(xì)胞數(shù)，故組織總體染色強(qiáng)度加強(qiáng)。但是當(dāng)切片厚度為8 μm時(shí)，細(xì)胞結(jié)構(gòu)較厚，會(huì)出現(xiàn)非特異性染色，不利于細(xì)胞計(jì)數(shù)，并伴隨有部分組織斷裂和脫片。相比之下，4 μm和6 μm厚度切片組織結(jié)構(gòu)清晰完整，沒(méi)有明顯的組織斷裂和脫片，染色對(duì)比鮮明，可以很好的分辨并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。此外，本實(shí)驗(yàn)中Ki-67的APSAP也隨著切片厚度的增加而增加，中～低表達(dá)組、中表達(dá)組、中～高表達(dá)組及高表達(dá)組中切片厚度2～8 μm的APSAP差值大于15%，導(dǎo)致計(jì)算出來(lái)的陽(yáng)性細(xì)胞面積比例增大，使對(duì)應(yīng)的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)增多，從而也會(huì)導(dǎo)致Ki-67 PI出現(xiàn)較大差異。特別是對(duì)Ki-67增殖指數(shù)處于臨界值45%的組織而言，如果APSAP偏高，可能導(dǎo)致Ki-67增殖指數(shù)大于45%；APSAP偏低，可能導(dǎo)致Ki-67增殖指數(shù)小于45%，這兩種結(jié)果都可能誤導(dǎo)醫(yī)師對(duì)MALT淋巴瘤和DLBCL的鑒別診斷。所以，切片厚度過(guò)薄或過(guò)厚都會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞計(jì)數(shù)誤差較大，計(jì)數(shù)結(jié)果可能誤導(dǎo)醫(yī)師診斷。因此對(duì)于Ki-67增殖指數(shù)為45%左右的淋巴瘤組織，建議切片厚度在4～6 μm，該范圍內(nèi)的APSAP誤差較小，可獲得較為穩(wěn)定可靠的結(jié)果，更為準(zhǔn)確地輔助醫(yī)師診斷。