miRNA-自噬軸在運動性心肌肥大中的作用機制

張 鈞

心肌組織包括心肌細胞和間質(zhì)兩部分，心肌細胞是高度分化的終末細胞，其收縮蛋白以α- 肌球蛋白為主，一般不能增殖，只有細胞體積的肥大。心肌細胞能夠?qū)ν饨绱碳ぷ龀鲞m應(yīng)性反應(yīng)，如不同程度或形式的損傷、應(yīng)激，或由長期運動訓(xùn)練、懷孕、機體自然生長等引起的生理性血流超負荷刺激，都會使心臟產(chǎn)生肥厚性的增長，此時其表型改變，體積增大[1-2]。一直以來，運動性心肌肥大被認為是一種生理性結(jié)構(gòu)肥大，是長期的運動訓(xùn)練導(dǎo)致機體在代謝方面發(fā)生的變化，表現(xiàn)為促進心肌細胞增殖與肥大、抑制心肌間質(zhì)纖維化、心肌血管再生等一系列的變化，心臟產(chǎn)生適應(yīng)性增大。其不僅能促進心臟功能的提高，而且有利于心臟健康。但由于運動性心肌肥大發(fā)生、發(fā)展過程具有復(fù)雜性，因此迄今為止，其具體的機制尚未被完全闡明。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，學(xué)者們在該領(lǐng)域的相關(guān)研究不斷深入，研究認為：運動性心肌肥大的發(fā)生已不僅僅是血流動力學(xué)作用下所引起的心肌細胞結(jié)構(gòu)與大小的改變，神經(jīng)體液因素也能夠通過各種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，調(diào)節(jié)應(yīng)答基因轉(zhuǎn)錄，促進心肌細胞的翻譯、合成，而形成心肌肥厚。當(dāng)前，關(guān)于運動性心肌肥大的研究，在基因?qū)用婧托盘杺鲗?dǎo)通路方面已取得了許多重要進展。已有研究表明，細胞自噬是基于溶酶體的一種胞內(nèi)降解途徑，對維持細胞和生物體的穩(wěn)態(tài)平衡有重要作用，參與了運動性心肌肥大的調(diào)控過程。微小RNA（miRNA）作為一種非編碼的單鏈RNA 分子，通過影響mRNA 和蛋白質(zhì)來調(diào)控基因的表達，miRNA 與運動性心肌肥大之間存在著聯(lián)系，目前miRNA 在調(diào)控運動性心肌肥大的心肌細胞基因轉(zhuǎn)錄后的表達有了一些研究進展。本文從細胞自噬和miRNA 入手，闡述細胞自噬和miRNA 在運動性心肌肥大形成中的作用及可能分子機制。

1 細胞自噬參與調(diào)控運動心肌肥大

細胞自噬（autophagy），是機體普遍存在的一種重要的代謝途徑，可降解衰老心肌細胞中折疊異常的蛋白質(zhì)和受損的細胞器[3]。根據(jù)哺乳動物中細胞內(nèi)容物轉(zhuǎn)移至溶酶體內(nèi)的不同途徑，細胞自噬可分為3 種類型：（1）巨自噬（macroautophagy），即細胞胞漿中的可溶性蛋白質(zhì)和變性壞死的細胞器被非溶酶體來源的雙層膜（多數(shù)人認為是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜）結(jié)構(gòu)所包裹，即形成自噬體，自噬體再將其攜帶到溶酶體中進行降解加工；（2） 微自噬（microautophagy），即細胞溶酶體膜直接包裹長壽命蛋白質(zhì)并在溶酶體內(nèi)降解；（3）分子伴侶介導(dǎo)的自噬（Chaperone-Mediated Autophagy，CMA），此 途 徑 形成的自噬僅存在于哺乳動物細胞中，細胞胞漿中的分子伴侶，如熱休克蛋白70（Heat Shock Cognate Protein of 70kd，HSC70） 在識別底物蛋白質(zhì)分子的特定氨基酸序列（如KFERQ 樣模體）后與之結(jié)合，而后分子伴侶-底物復(fù)合物再與溶酶體膜上受體（Lysosome Associated Membrane Protein Type2，LAMP2）結(jié)合，底物去折疊，溶酶體腔中的另外一種分子伴侶介導(dǎo)底物在溶酶體膜轉(zhuǎn)位，進入溶酶體腔的底物被水解酶分解為其組成成分后被細胞再利用。由于分子伴侶介導(dǎo)的自噬，其底物是可溶的蛋白質(zhì)分子，因此這種類型的自噬在清除受損或異常折疊的蛋白質(zhì)時具有選擇性。在哺乳動物心肌細胞中最常見的是巨自噬，心肌細胞自噬的整個過程一般可分為自噬誘導(dǎo)、自噬體形成、自噬溶酶體形成、內(nèi)容物降解4 個階段（圖1）[3]。即細胞質(zhì)中的線粒體等細胞器首先被稱為“隔離膜”的囊泡所包被，囊泡最終形成雙層膜結(jié)構(gòu)，即自吞噬體（autophagosome）；自吞噬體與胞內(nèi)體融合形成中間 自 體 吞 噬 泡 （Intermediate Autophagic Vacuoles，AVi/d）；最終自體吞噬泡的外膜與溶酶體融合形成降解自體吞噬泡 （Degrading Autophagic Vacuoles，AVd），由溶酶體內(nèi)的酶降解自體吞噬泡中的內(nèi)容物和內(nèi)膜。

圖1 自噬發(fā)生過程的不同階段示意圖[3]Figure1 Schematic Diagram of Autophagy at Different Stages[3]

在正常狀態(tài)下，由于要保持細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定性，細胞會處于低水平的自噬狀態(tài)，即基礎(chǔ)自噬，但當(dāng)細胞受到外界的刺激時，自噬水平會發(fā)生改變，如饑餓、長期有氧運動、胰高血糖素等因素均可提高細胞自噬水平。近來研究表明，自噬水平的變化參與調(diào)控心肌細胞能量代謝、 心肌蛋白質(zhì)合成及心肌細胞增殖等生理過程[4]。Nakai 等[5]在Atg5-/-基因敲除及沉默Atg7 基因后發(fā)現(xiàn)，小鼠心肌泛素化蛋白聚積，心肌細胞凋亡現(xiàn)象增加，自噬活性均明顯降低，心肌肥大產(chǎn)生。由此可見，自噬異常所導(dǎo)致的心肌蛋白質(zhì)過度聚積，可能是引起心肌肥大的重要原因。

運動作為一種機械性刺激，能夠增強心肌細胞的自噬水平。動物實驗研究表明，多種模式（自由轉(zhuǎn)輪、跑臺、游泳等）的運動均能上調(diào)心肌細胞的自噬活性[6]，這對維持運動過程中心臟在能量方面的需求，以及維持心臟正常的生理功能具有積極意義。由此可見，自噬在運動誘導(dǎo)的生理性心肌肥大中也具有重要作用。已有研究證實，自噬一方面能通過自噬-溶酶體（ALP）途徑清除長期運動刺激下心肌受損的細胞器及代謝產(chǎn)物（如自由基）[7]，將其轉(zhuǎn)換成能源物質(zhì)，維持心肌細胞能量代謝平衡，保證心肌蛋白的質(zhì)量；另一方面，可特異性地降解心肌合成過多的蛋白，有效控制心肌發(fā)生過度肥厚[8]，這在預(yù)防心肌生理性肥大向病理性肥大的轉(zhuǎn)變中具有重要意義。Willis 等[8]通過5 周運動干預(yù)后，發(fā)現(xiàn)CHIP-/-小鼠由于自噬通路的代償激活，及時清除了心肌細胞中異常折疊、 衰老的蛋白質(zhì)，以及受損的心肌細胞器，保證了心肌的蛋白質(zhì)量，從而在抑制小鼠心肌纖維化的進程中起到重要作用，提示心肌細胞自噬在調(diào)控心肌蛋白質(zhì)質(zhì)量控制，以及在保持心肌細胞正常的生理功能方面作用顯著。目前已有研究證明，通過10 周游泳運動使大鼠形成運動性心肌肥大，并觀察到運動性心肌肥大模型組大鼠心肌自噬小體顯著增加，自噬標(biāo)記蛋白LC3B、Beclin1 表達水平和自噬相 關(guān) 基 因 （Autophagy-Related Gene，Atg）Atg4B、Atg5、Atg7、Atg12、ULK1 在基因和蛋白方面的表達水平均顯著增加，而自噬受損蛋白SQSTM1 的表達明顯下調(diào)[9]。還有研究表明，大鼠在長期耐力訓(xùn)練后，心肌細胞微管相關(guān)蛋白輕鏈3B（Microtubule-Associated Protein Light Chain 3，LC3B）和Beclin1 均顯著上調(diào)[10]；此外，有研究發(fā)現(xiàn)，運動引起自噬活性的增加主要與運動顯著上調(diào)腺苷酸活化蛋白激酶（Adenosine Monophosphate Activated Protein Kinase，AMPK）的表達水平有關(guān)，運動可引起心肌細胞內(nèi)單磷酸腺苷/ 腺嘌呤核苷三磷酸（Adenosine Monophosphate/5'-Adenylate Triphosphate，AMP/ATP） 上調(diào)，從而提高AMPK 活性。研究發(fā)現(xiàn)，AMPK 可通過直接影響雷帕霉素靶向蛋白 （Mammalian Target Of Rapamyoin，mTOR）的活化水平[11]，引起心肌自噬水平的上調(diào)；AMPK 還可通過提高p27 蛋白的活性、活化真核細胞延伸因子-2（Eukaryotic Elongation Factor 2，eEF2）促進自噬形成[12-13]。以上研究結(jié)果說明，心肌細胞自噬水平的上調(diào)參與了運動性心肌肥大的形成，但其具體是通過何種作用機制實現(xiàn)對運動性心肌肥大的調(diào)控，還有待通過實驗進一步系統(tǒng)地進行驗證。

2 miRNA 介導(dǎo)運動性心肌肥大形成

圖2 MicroRNA 的生物發(fā)生及其作用方式[14]Figure2 Biogenesis of MicroRNA and Its Mode of Action[14]

miRNA 是一類大小約為22 nt 的單鏈小分子RNA，是由具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的約70～90 個堿基大小的單鏈RNA 前體經(jīng)過Dicer 酶加工后生成，它們通過與靶基因3'- 端UTR 堿基完全或不完全互補的方式，影響mRNA 的存在時間或翻譯過程，從而發(fā)揮對基因表達的調(diào)控作用（圖2）[14]。miRNAs 在心肌細胞肥大、心臟發(fā)育、心肌間質(zhì)重塑和心肌功能變化等方面具有重要的調(diào)節(jié)作用[10,15]，其涉及的信號通路參與了心肌肥厚的發(fā)生，如MAPK、PI3K-AKT、JAK 等信號通路。miRNAs 一直以來被作為參與調(diào)節(jié)復(fù)雜的病理性心肌肥大的重要因素，而受到廣泛研究。關(guān)于miRNAs 在運動誘導(dǎo)的生理性心肌肥大中扮演的角色及作用，相關(guān)文獻報道尚不多見。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，miRNAs 也參與調(diào)節(jié)運動性心肌肥大。運動能夠調(diào)節(jié)心肌多個miRNAs 的表達，這為運動性心肌肥大相關(guān)機制的研究提供了新的視野。

miRNAs 與運動的關(guān)系已成為當(dāng)前運動科學(xué)相關(guān)研究領(lǐng)域的關(guān)注點。此前，多名學(xué)者已通過在體實驗證實心臟、 骨骼肌以及循環(huán)中的miRNAs 變化參與了運動誘導(dǎo)的機體適應(yīng)性[15-16]。近年來國內(nèi)外的研究表明，miRNAs 在運動性心肌肥大形成中也扮演了重要的角色，并通過調(diào)控其靶基因及相關(guān)信號通路對心肌肥大產(chǎn)生顯著的影響。有研究發(fā)現(xiàn)，在不同的游泳訓(xùn)練所誘導(dǎo)的左心室肥大 （Left Ventricular Hypertrophy，LVH） 動物模型中，大鼠左心室miR-27a、miR-27b 均發(fā)生顯著上調(diào)，miR-143 呈現(xiàn)顯著下調(diào)[17]。該實驗通過基因芯片技術(shù)對比了大鼠運動性心肌肥大模型和正常大鼠心肌細胞的miRNAs 后發(fā)現(xiàn)，運動性心肌肥大的心肌中miRNAs 存在顯著差異，研究表明，運動性心肌肥大模型組大鼠心肌miR-124 顯著 下 調(diào)，miR-21、miR-144 和miR-145 表 達 水 平 呈 顯著上調(diào)。進一步的研究證實，上述差異表達的miRNAs（miR-124、miR-21、miR-144 和miR-145）可 能 分別通過靶向其下游靶基因PIK3α（miR-21）、PTEN（miR-144 和miR-21）和TSC2（miR-145）激 活PI3K/AKT/mTOR 信號，從而介導(dǎo)運動性心肌肥大的形成[18]；Palabiyik 等[19]也發(fā)現(xiàn)運動訓(xùn)練后心肌中miR-21 和miR-133 的表達改變是通過激活PI3K/AKT/mTOR 而發(fā)揮作用的。Qi 等[20]在運動誘導(dǎo)的左心室肥厚大鼠模型中使用高通量miRNA 芯片技術(shù)篩選了具有表達差異的miRNAs。結(jié)果顯示，在運動性誘導(dǎo)的生理性肥大心肌中，有216 個miRNAs 發(fā)生顯著變化（其中77個miRNAs 顯著上調(diào)，139 個miRNAs 顯著下調(diào)），并通過信號通路富集，發(fā)現(xiàn)MAPK、自噬等信號通路在運動性心肌肥大的形成和發(fā)展中發(fā)揮了重要的作用。目前也有一些學(xué)者通過動物實驗，先后驗證了miRNAs 在運動性心肌肥大中的作用[21-25]。此外，有研究發(fā)現(xiàn)，循環(huán)血中的miRNA 表達水平與運動性心肌肥大密切相關(guān)，從事耐力項目的運動員在長期運動訓(xùn)練后血液循環(huán)中miR-21 的表達顯著增加[26-28]。Mooren等[29]通過研究發(fā)現(xiàn)，馬拉松運動員在運動后即刻所測得的血液中，多個miRNAs（miR-1、miR-133、miR-206、miR-208b 和miR-499）表達水平均出現(xiàn)顯著上調(diào)。進一步的研究發(fā)現(xiàn)，miR-1 與左心室射血分?jǐn)?shù)（EF%）呈現(xiàn)顯著負相關(guān)，miR-133a 與室間隔的厚度呈現(xiàn)顯著的正相關(guān)關(guān)系。以上結(jié)果提示，miR-1 和miR-133a 可能是運動性心肌肥大（即運動員心臟）發(fā)生的潛在生物學(xué)標(biāo)記。血液中miR-126 對維持血管完整度、促進血管再生和增進心臟健康等方面作用顯著。Schmitz 等[30]以30 名男運動員和31 名女運動員為研究對象，進行4 周低強度運動和高強度運動訓(xùn)練，檢測了運動員血液中miR-126 的表達水平，研究發(fā)現(xiàn)，這兩種運動方式對miRNA 的影響存在差異，參與低強度運動訓(xùn)練的隊員血液中miR-126 的表達增加，而高強度運動訓(xùn)練未顯著影響運動員血液中的miR-126 表達水平。說明miRNA 的表達對運動強度具有一定的敏感性。因此，循環(huán)miRNA 在運動性心肌肥大及增強心臟功能等方面具有潛在的應(yīng)用價值。以上研究結(jié)果提示，在運動性心肌肥大發(fā)生、發(fā)展的過程中miRNAs 的表達水平變化具有重要的調(diào)控作用； 此外，miRNAs 還可作為運動性心肌肥大形成的生物學(xué)標(biāo)志物。但明晰miRNAs 在運動性心肌肥大形成中的具體作用及機制，仍需對其功能進行研究驗證。

3 miRNA-自噬軸在運動性心肌肥大發(fā)生中的作用

細胞自噬對細胞內(nèi)能量變化、 氧化應(yīng)激等信號較為敏感，對于維持內(nèi)環(huán)境平衡是不可或缺的。研究表明，自噬過程需要非常精準(zhǔn)的調(diào)控，miRNAs 在多個組織中對細胞自噬的調(diào)控起著關(guān)鍵作用[31-35]。miRNA 通過與目標(biāo)mRNA 的3'- 端UTR 互補匹配，使目標(biāo)mRNA 降解，繼而抑制蛋白翻譯[36-38]。研究發(fā)現(xiàn)，在自噬的誘導(dǎo)階段，哺乳動物細胞內(nèi)由ULK1 同系物Atg13 和ULK2 同系物Atg1 和Atg17 組成的ULK 復(fù)合體介導(dǎo)了自噬的誘導(dǎo)過程，而mTOR 激酶作為自噬的“門控開關(guān)”[39]，被認為是調(diào)控自噬誘導(dǎo)發(fā)生階段的重要激酶。據(jù)已有文獻報道，miRNAs 實現(xiàn)對自噬的調(diào)控是通過作用于不同的自噬相關(guān)基因：如Beclin1 是miR-30a 的靶基因[40]，Atg5 是miR-181a 的 靶基因[41]，miR-204 可直接下調(diào)LC3B 的表達，抑制自噬的發(fā)生[42]。此外，還存在一些潛在的與自噬-溶酶體通路有關(guān)的功能性調(diào)節(jié)miRNAs，包括miR-130、miR-124、miR-204 和miR-142，LAMP1/2、v-SNARE 蛋白和囊泡相關(guān)膜蛋白7（Vesicle-Associated Membrane Protein 7，VSMP7） 等可能是這些miRNAs 的靶標(biāo)基因[43]。目前，在運動性心肌肥大中，已有學(xué)者通過在體實驗證明了自噬信號途徑在運動性心肌肥大形成中的作用，并且在體外細胞實驗中闡明了miR-204-5p、miR-497-3p 和miR-26b 分別通過靶向LC3B、Beclin1和ULK1 在運動性心肌肥大中發(fā)揮的作用[20]。由此可見，心肌細胞自噬參與了運動性心肌肥大的形成過程，其作用機制之一是通過miRNAs 對自噬相關(guān)基因的靶向調(diào)控作用實現(xiàn)。然而，關(guān)于miRNAs 之間是否還可能存在交互影響，通過協(xié)同作用進一步在運動性心肌肥大中調(diào)控自噬水平，目前鮮有報道。

由此可見，在運動性心肌肥大中，細胞自噬和miRNAs 在不同的層面發(fā)揮重要的調(diào)控作用，且二者在調(diào)控運動性心肌肥大形成的過程中存在著內(nèi)在的聯(lián)系。長期以來，關(guān)于運動增強心肌保護效應(yīng)、促進心臟健康的生物學(xué)機制已開展了深入的研究。值得注意的是，在運動對心血管健康促進效應(yīng)的眾多研究中，運動強度一直是備受關(guān)注的問題[44]。有學(xué)者提出運動對心臟的健康是把“雙刃劍”[45-46]。長期規(guī)律的有氧運動能夠有效降低心血管疾病的發(fā)病率，減輕其癥狀，對其具有良好的預(yù)防和治療作用。在運動對心血管健康的相關(guān)研究中，已有新的研究數(shù)據(jù)表明，運動強度和不良心血管事件之間呈U 型關(guān)系，適度運動要顯著優(yōu)于不運動，但劇烈運動對一些人群反而可能起到副作用（圖3）[47-48]。英國體育運動科學(xué)協(xié)會（British Association of Sports and Exercise Science，BASES） 和美國衛(wèi)生與公眾服務(wù)部 （Department of Health and Human Services，DHHS）建議，健康成年人每周應(yīng)進行150 min 的中等強度（相當(dāng)于3～6 METS）或75 min的大強度有氧運動鍛煉，而競技運動員每周要進行超過20 h 的高強度運動（超過15 METS）。如此高強度的運動需要在長時間內(nèi)，心輸出量持續(xù)增加5～7 倍。長期從事大強度運動訓(xùn)練，運動員迷走神經(jīng)緊張度顯著增高，心臟沖動的起源與傳導(dǎo)隨之發(fā)生一系列的生理改變[47]。但當(dāng)這些改變超出一定的范圍時，會導(dǎo)致心律失常（以陣發(fā)性心動過速、房室傳導(dǎo)阻滯、束支傳導(dǎo)阻滯、干擾性房室脫節(jié)、期前收縮、游走性心律等為特征）、心肌纖維化及一些未能被及時發(fā)現(xiàn)的潛在心血管風(fēng)險因素的出現(xiàn)[49-52]。已有相關(guān)研究表明，當(dāng)心律失常、心力衰竭等病理性現(xiàn)象出現(xiàn)時，心肌細胞自噬水平呈顯著增強的趨勢。這是因為自噬是通過適應(yīng)性和非適應(yīng)性的調(diào)節(jié)在心血管的健康適應(yīng)中扮演著雙重角色。一方面，細胞自噬既是一種廣泛存在的正常生理過程，正常水平的自噬可以保護細胞免受環(huán)境刺激的影響，在保持正常心血管功能方面具有保護性機制作用；另一方面，其又是細胞對不良環(huán)境的一種防御機制，參與多種心臟疾病的病理發(fā)生、發(fā)展過程，自噬過度與自噬不足均會參與心臟相關(guān)疾病的形成，甚至推動疾病的發(fā)展。Garcia等[53]和Chen 等[54]在術(shù)后房顫患者的右心房取樣發(fā)現(xiàn)自噬空泡的聚集和自噬標(biāo)志物L(fēng)C3 的表達減少，提示在術(shù)后房顫發(fā)生中心臟自噬水平下降，學(xué)者們認為術(shù)前自噬的增強很可能是在為心律失常的心臟提供能量的適應(yīng)性保護，提示長期高強度的運動所導(dǎo)致的運動員心律失常、自噬水平提高，正是心肌適應(yīng)性保護機制的體現(xiàn)。然而還有研究發(fā)現(xiàn)，適度的運動在緩解心律失常、 心力衰竭等病理性心臟疾病中能夠通過調(diào)控自噬水平而實現(xiàn)對病理性心臟的有效干預(yù)治療[8,55-56]。

圖3 運動促進心臟健康的效應(yīng)[47]Figure3 Effect of Exercise on Heart Health[47]

綜上所述，運動作為一種外源性刺激，心肌自噬水平的持續(xù)增強，可在預(yù)防運動誘導(dǎo)的生理性肥大向病理性肥大的轉(zhuǎn)變中起到警示作用。此外，運動通過調(diào)節(jié)心肌miRNAs 的表達，激活與心肌蛋白合成相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，使心肌產(chǎn)生適應(yīng)性肥大，增強心功能。同時，miRNAs 還能夠通過靶向作用于自噬相關(guān)基因而調(diào)控運動性心肌肥大。但目前在運動心肌肥大模型中尚未有關(guān)于miRNAs 的協(xié)同作用對心肌細胞自噬的影響，以及更為系統(tǒng)的關(guān)于心肌細胞自噬和miRNAs 的相互調(diào)節(jié)作用的報道，還有待進一步探究。總之，闡明心肌細胞自噬和miRNAs 的相互關(guān)系，及其在運動性心肌肥大中所具有的獨特作用，可為進一步補充和完善運動性心肌肥大中自噬基因表達調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，以及完善運動誘導(dǎo)心肌肥大的分子調(diào)控理論提供依據(jù)。

4 研究展望

心肌細胞在受到工作負荷刺激后，其信號會翻譯為促進細胞生長的電信號和（或）生化信號。關(guān)于運動性心肌肥大發(fā)生分子機制的研究，還有待進一步深入探討，為更加完善運動性心肌肥大的理論基礎(chǔ)提供依據(jù)。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，效應(yīng)器Yes 相關(guān)蛋白 （Yes Associated Protein，YAP）/ 具有PDZ 結(jié)合域的轉(zhuǎn)錄共刺激因子（Transcriptional Co-Activator with PDZ-Binding Motif，TAZ） 在促進心肌細胞增殖中發(fā)揮重要的作用[57]，并且其對心肌具有一定的保護效應(yīng)[58]。動物研究已經(jīng)證明了YAP 活性的平衡在正常心臟形成中的意義，并且YAP 除了參與正常的心臟發(fā)育外，還能夠調(diào)控成年心肌細胞的增殖[59]。因此在運動性心肌肥大中YAP/TAZ 的作用與機制值得探究。