克氏原螯蝦黑鰓上一種木賊鐮刀菌的分離鑒定

趙楠 張世奇 唐自力 李浩 趙桂華,3

(1江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇句容 212400；2句容市水產(chǎn)技術(shù)指導(dǎo)站，江蘇句容 212400；3句容市潤(rùn)泰生物科技有限公司，江蘇句容 212400)

木賊鐮刀菌[Fusariumequiseti(Corda)Sacc.1886]是1種世界性真菌，也是克氏原螯蝦(俗稱小龍蝦)黑鰓上的1種真菌，小龍蝦是該真菌的新宿主。之前尚未有在溫帶至熱帶地區(qū)的小龍蝦中發(fā)現(xiàn)該真菌的報(bào)道。

最近幾年的研究發(fā)現(xiàn)，在小龍蝦養(yǎng)殖地區(qū)，由鐮刀菌屬(FusariumLink ex Fr 1809)引起的小龍蝦黑鰓病(black gill disease)普遍發(fā)生，常常造成小龍蝦死亡。黑鰓病又被稱為鐮刀菌病害(Fusarium disease)[1]。鐮刀菌屬種類繁多，是1類具有經(jīng)濟(jì)重要性的真菌。到2020年12月31日為止，該屬共記載了1 662個(gè)種、亞種、變種和?；?，有一些種類是動(dòng)植物的重要病原菌，有的也存在于土壤中。

在對(duì)螯蝦科(Astacidae)和擬螯蝦科(Parastacidae或Austroastracidae)蝦類的研究報(bào)道中，茄鐮刀菌[Fusariumsolani(Mart.)Sacc 1881][2-6]、尖孢鐮刀菌(F.oxysporumSchltdl.1824)[7]、肉紅色鐮刀菌[F.incarnatum(Roberge)Saccardo 1848][1,6]等均能引起黑鰓病，但尚未見(jiàn)木賊鐮刀菌引起小龍蝦黑鰓病的報(bào)道。

為了更好地預(yù)防和控制小龍蝦黑鰓病的發(fā)生和傳播，首先要準(zhǔn)確鑒定病原。本研究在實(shí)驗(yàn)室條件下的馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基上，對(duì)感染小龍蝦黑鰓病的病蝦鰓片進(jìn)行分離培養(yǎng)和純化，得到了1個(gè)鐮刀菌菌株，并通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察描述和DNA分子測(cè)序?qū)ζ溥M(jìn)行了種類鑒定，以期對(duì)小龍蝦養(yǎng)殖和病害防控提供新的依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料來(lái)源

2018年6月13日，在江蘇省句容市潤(rùn)泰生物科技有限公司養(yǎng)殖基地采集患黑鰓病的小龍蝦樣本，裝入標(biāo)本袋，放在4 ℃低溫冷藏箱備用。

1.2 組織分離方法

將病蝦的黑鰓用自來(lái)水沖洗后，再放在滅菌水中清洗3次，取出，用滅菌紙吸干鰓上的水分，用滅菌的剪刀將病鰓片剪下，在無(wú)菌條件下轉(zhuǎn)移到盛有馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿內(nèi)，放在(25±2)℃的PRX-250A型智能人工氣候箱內(nèi)(RH 70%，黑暗)培養(yǎng)。用此方法共分離20皿120塊黑鰓組織，4 d后取出檢查，統(tǒng)計(jì)分離結(jié)果。對(duì)不同顏色的真菌菌落分別進(jìn)行純化、編號(hào)。本研究中的菌株標(biāo)號(hào)為NLHf-3。對(duì)此次分離到的細(xì)菌不做進(jìn)一步研究。

1.3 形態(tài)觀察

將NLHf-3菌株接種到PDA平面培養(yǎng)基上，培養(yǎng)7～10 d(培養(yǎng)條件同1.2)，觀察菌落的生長(zhǎng)情況。

將NLHf-3菌株接種到滅菌載玻片上的PDA培養(yǎng)基上[8]，培養(yǎng)5～6 d(培養(yǎng)條件同1.2)，待產(chǎn)生分生孢子后，做成臨時(shí)玻片，在蔡斯(ZEISS Imager A1)光學(xué)顯微鏡下觀察，觀察分生孢子梗和分生孢子的形態(tài)，測(cè)量其大小(n=30)，并拍照。再根據(jù)相關(guān)資料[9-11]進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定。

1.4 DNA提取、純化和測(cè)序

該真菌的DNA提取、PCR擴(kuò)增和測(cè)序反應(yīng)的方法和步驟由南京金斯瑞生物科技有限公司協(xié)助完成。測(cè)序菌株代號(hào)為174(保存菌種NLHf-3，即黑鰓病真菌3號(hào)菌株)。

測(cè)序試驗(yàn)流程：(1)設(shè)計(jì)特異性引物。引物名稱為ITS1(TCCGTAGGTGAACCTGCGG),ITS4(TCCTCCGCTTATTGATATGC)；(2)提取基因組DNA；(3)合成引物，擴(kuò)增ITS區(qū)全序列，擴(kuò)增；(4)PCR產(chǎn)物純化，即使用膠回收方法進(jìn)行PCR產(chǎn)物純化；(5)使用ABI3730XL測(cè)序儀對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序；(6)在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中，通過(guò)NCBI的Blast檢索系統(tǒng)進(jìn)行序列同源性比對(duì)。

2 結(jié)果

2.1 分離結(jié)果

在120塊黑鰓組織(見(jiàn)圖1)上共得到真菌菌落73個(gè)，占60.8%；細(xì)菌菌落47個(gè)，占39.2%(本文不進(jìn)行研究)。經(jīng)初步鑒定，73個(gè)真菌菌落隸屬于5屬7種，其中包括木賊鐮刀菌。其他的分離結(jié)果在本文中不進(jìn)行討論，另外單獨(dú)發(fā)表。

2.2 木賊鐮刀菌

Fusariumequiseti(Corda)Sacc.,Syll.fung.(Abellini)4：707(1886)[9-11]。

MycoBank Number：199819。

異名(Synonymy)：SelenosporiumequisetiCorda,Icon.fung.(Prague)2:7(1838)；Fusariumequisetivar.crassumWollenw.,Fusariaautographicadelineata3:no.921(1930)。

木賊鐮刀菌種以下的分類單位有2個(gè)亞種，7個(gè)變種和3個(gè)?；?。

2.2.1 形態(tài)特征

在PDA培養(yǎng)基上[(25±2)℃，RH 70%]，菌落呈淡米黃色、疏松、棉絮狀(見(jiàn)圖2)，平均日生長(zhǎng)量約為1.1 cm。分生孢子梗單生(見(jiàn)圖3)、具分枝，其上著生倒棍棒狀的瓶梗，大小為(12.0～17.0)μm×(3.0～4.0)μm；大分生孢子形狀變化大，呈紡錘形或鐮刀形，3～5個(gè)分隔，具有明顯的基細(xì)胞，或稍彎曲，孢體中間寬、兩端漸收窄(見(jiàn)圖3)，大小為(31.0～47.0)μm×(4.0～5.0)μm；在PDA上小型分生孢子少。在菌絲上有厚垣孢子形成，單生或串生(見(jiàn)圖4)，表面較粗糙，呈球形或近球形，直徑為7～9 μm。在人工培養(yǎng)基上不產(chǎn)生有性世代。

2.2.2 分子鑒定

通過(guò)對(duì)NLHf-3菌株的菌絲進(jìn)行DNA提取，用ITS1和ITS4的通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到長(zhǎng)度為529 bp的特異性DNA片段。擴(kuò)增ITS區(qū)全序列，結(jié)果見(jiàn)圖5。

通過(guò)對(duì)擴(kuò)增片段進(jìn)行測(cè)序，用NCBI的Blast檢索系統(tǒng)在Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)中搜尋相似序列，結(jié)果與庫(kù)中登錄號(hào)為MH290363.1和KY910876.1(包括小亞基核糖體RNA基因，部分序列；ITS1 5.8S核糖體RNA基因，ITS2完整序列；大亞基核糖體RNA基因，部分序列)的同源性均為99%，因此可以確定小龍蝦黑鰓上的真菌菌株為木賊鐮刀菌(Fusariumequiseti)。

2.2.3 4種鐮刀菌形態(tài)比較

除了木賊鐮刀菌外，在小龍蝦黑鰓上還有茄鐮刀菌、尖孢鐮刀菌、肉紅色鐮刀菌等其他3種鐮刀菌的報(bào)道[1-7]。這幾種鐮刀菌形態(tài)特征雖有異同，但是，如果不借助于DNA測(cè)序結(jié)果，僅從形態(tài)上區(qū)分它們還存在一定難度。4種鐮刀菌分生孢子梗、分生孢子和厚垣孢子的區(qū)別特征見(jiàn)表1。木賊鐮刀菌的菌絲細(xì)胞中大多含有2～5個(gè)細(xì)胞核，但在個(gè)別的分生孢子細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了單核[12]，在分隔處會(huì)產(chǎn)生8個(gè)色氨酸鏈[13-14]。

圖1 小龍蝦黑鰓Fig.1 Black gills of Procambarus clarkii

圖2 菌株NLHf-3的菌落形態(tài)Fig.2 Colony morphologies of stain NLHf-3

a.單根分生孢子梗 single conidiophore; b.大分生孢子 macroconidium。 圖3 菌株NLHf-3的分生孢子梗和分生孢子Fig.3 Conidiophore and conidium of stain NLHf-3

a.單生 singly; b.串生 chains。 圖4 菌株NLHf-3的厚垣孢子Fig.4 Chlamydospore of stain NLHf-3

M.DNA Marker 3 000;1.stain NLHf-3。 圖5 菌株ITS 1和ITS 4區(qū)域PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.5 Electrophoregram figure of PCR amplification products in ITS 1 and ITS4 regions

3 總結(jié)和討論

木賊鐮刀菌作為小龍蝦體上微生物成員的1種，在我國(guó)屬于首次報(bào)道。

現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)有多種鐮刀菌(Fusariumspp.)能侵染蝦類，如小龍蝦、歐洲高貴小龍蝦(Astacusastacus)、土耳其小龍蝦(A.leptodactylus)、白爪小龍蝦(Austropotamobiuspallipes)、信號(hào)小龍蝦(Pacifastacusleniusculus)和西墨蘭絲螯蝦(Procambarussimulans)[4,15-17]、近緣螯小龍蝦(Cambarusaffinis)和叉肢螯蝦(Orconecteslimosus)[18]、澳大利亞白色螯蝦(Cheraxdestructoralbidus)和佛羅里達(dá)藍(lán)螯蝦(C.tenuimanus)[19]、龍蝦[20]、對(duì)蝦(Penaeusorientalis)及其他蝦類[3,21-24]。

表1 小龍蝦黑鰓上4種鐮刀菌的形態(tài)特征[10]

鐮刀菌導(dǎo)致小龍蝦病害的主要原因是鐮刀菌在生長(zhǎng)過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生多種毒素，對(duì)動(dòng)物機(jī)體造成病理性損傷，抑制免疫機(jī)能，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，如鐮刀菌T-2毒素(T-2 Toxin)會(huì)引起白細(xì)胞減少癥，使造血系統(tǒng)功能衰退。如果小龍蝦被木賊鐮刀菌感染，木賊鐮刀菌所分泌的毒素會(huì)對(duì)小龍蝦的細(xì)胞產(chǎn)生不良影響，從而引發(fā)病害。

木賊鐮刀菌是動(dòng)植物的病原菌，能分泌格鏈孢酚(Alternariol)、交鏈孢酚單甲醚(Djalonensone)、腺嘌呤核苷和過(guò)氧麥角甾醇[25]、醌類化合物[26]，以及伏馬素FB1(Fumonisin B1)和脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(嘔吐霉素，DON)。按其化學(xué)結(jié)構(gòu)和毒性，鐮刀菌毒素可以分為單端孢霉烯族化合物、玉米赤霉烯酮、丁烯酸內(nèi)酯和串珠鐮刀菌素。單端孢霉素類通常要溫度超過(guò)200 ℃才能被破壞[27]，而在飼料加工過(guò)程中，最高溫度只有(110±5)℃，還不至于破壞單端孢霉素類的化學(xué)結(jié)構(gòu)，因此，加工后的飼料中仍存在單端孢霉素，這對(duì)養(yǎng)殖小龍蝦是一種潛在的危害。

鐮刀菌是一類機(jī)會(huì)主義病原菌，也被稱為兼性寄生病原菌，在大多數(shù)情況下以腐生的方式依附在小龍蝦上，當(dāng)小龍蝦受傷后或蝦體免疫力下降時(shí)即可變成病原菌侵染小龍蝦，引發(fā)病害。尤其是生活在水體環(huán)境條件不佳或污染水體中的小龍蝦，其鰓片功能下降，嚴(yán)重時(shí)逐漸喪失呼吸功能，鰓片變黑，生長(zhǎng)受到嚴(yán)重影響[28]。

木賊鐮刀菌是否是引起小龍蝦黑鰓病或其他病害的主要病原菌，仍需進(jìn)行大量的致病性接種試驗(yàn)才能確定。同時(shí)，該真菌分泌的是哪一種毒素，其對(duì)小龍蝦的毒害作用機(jī)理還有待于進(jìn)一步研究。