敵百蟲對(duì)奧尼羅非魚幼魚的急性毒性及安全濃度評(píng)價(jià)

辛桂瑜 侯小露 梁敏敏 林文鋒 鄧少立 劉思妮 徐蘭程

(1玉林師范學(xué)院生物與制藥學(xué)院，廣西玉林 537000；2廣西農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，廣西南寧 530007)

羅非魚(Oreochromis)具有生長快、食性雜、抗病力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，是聯(lián)合國糧農(nóng)組織推薦的世界性優(yōu)良養(yǎng)殖魚種之一，也是我國重要的水產(chǎn)養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)品種[1]。奧尼羅非魚是雌性尼羅羅非魚(O.niloticus)和雄性奧利亞羅非魚(O.aureus)種間雜交獲得的雄性率較高的雜交一代[2]。該魚具有明顯的單性優(yōu)勢(shì)和雜交優(yōu)勢(shì)，因而成為羅非魚養(yǎng)殖的重要品種。然而近年來，隨著養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大和養(yǎng)殖密度的提高，養(yǎng)殖水質(zhì)不斷惡化，導(dǎo)致魚類疾病頻繁暴發(fā)，嚴(yán)重制約了羅非魚養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展[3]。

敵百蟲，化學(xué)名稱為O,O-二甲基-(2,2,2-三氯-1-羥基乙基)膦酸酯，屬有機(jī)磷酯類化合物，具有高效、低毒及低殘留等特點(diǎn)，在水產(chǎn)養(yǎng)殖生產(chǎn)中常用于防治魚類的寄生蟲病[4]。敵百蟲主要起到胃毒作用，兼有觸殺作用，可防治多種害蟲，一般加工成粉劑、乳劑使用，水產(chǎn)上一般使用晶體敵百蟲。雖然敵百蟲在農(nóng)藥中被列為低毒產(chǎn)品，但是魚類可經(jīng)食道、呼吸系統(tǒng)及皮膚接觸吸收過量的敵百蟲而導(dǎo)致中毒[5]。

目前已有敵百蟲對(duì)多種魚類毒性作用的研究報(bào)道[6-8]，但是對(duì)奧尼羅非魚毒性作用的報(bào)道較少。由于在堿性條件下，敵百蟲脫去氯化氫會(huì)轉(zhuǎn)化成“敵敵畏”，其毒性會(huì)大大增強(qiáng)。因此，本試驗(yàn)分別采用曝氣自來水和池塘水兩種pH不同的水，通過96 h半靜水式方法對(duì)奧尼羅非魚進(jìn)行急性毒性試驗(yàn)，以確定在曝氣自來水和池塘水條件下敵百蟲對(duì)奧尼羅非魚的半致死濃度和安全濃度，為羅非魚養(yǎng)殖生產(chǎn)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)用奧尼羅非魚幼魚購于玉林市魚聯(lián)苗種場(chǎng)。試驗(yàn)前將羅非魚放在盛有曝氣4 d的自來水的魚缸中暫養(yǎng)3 d，暫養(yǎng)期間充分增氧，投喂碾碎的羅非魚膨化飼料，每天飼喂2次，早晚各1次。試驗(yàn)前24 h停止投飼。選擇體態(tài)正常、顏色鮮亮、健康活潑、大小一致的個(gè)體用于試驗(yàn)。試驗(yàn)魚體長2.8～3.0 cm，體質(zhì)量0.48～0.50 g。曝氣組試驗(yàn)用水為曝氣4 d以上的自來水，水溫(23.5±2.0)℃，pH為6.5，溶解氧>5 mg/L；池塘組試驗(yàn)用水為養(yǎng)殖池塘水，水溫(23.5±2.0)℃，pH為8.5，溶解氧>5 mg/L。

1.2 試驗(yàn)藥品和儀器設(shè)備

晶體敵百蟲為遠(yuǎn)城康源獸藥有限公司產(chǎn)品，將其配制成質(zhì)量濃度為1 mg/L的母液，試驗(yàn)時(shí)按比例稀釋成所需的質(zhì)量濃度[9]。試驗(yàn)儀器設(shè)備有增氧機(jī)，電子天平，溫度計(jì)等，試驗(yàn)用容器為容積5 L的塑料盆(上口直徑37.5 cm，下底直徑20.5 cm，高12.0 cm)。

1.3 試驗(yàn)方法

參考有關(guān)資料[7-10]開展預(yù)試驗(yàn)。曝氣組(A組)和池塘組(B組)各設(shè)置6個(gè)敵百蟲質(zhì)量濃度，每個(gè)濃度投放10尾試驗(yàn)魚，觀察24 h內(nèi)試驗(yàn)魚的死亡情況，得到24 h的100%死亡濃度和0%死亡濃度，以此確定藥物試驗(yàn)濃度的上下限。

根據(jù)預(yù)試驗(yàn)得到的試驗(yàn)濃度上下限，曝氣組(A組)和池塘組(B組)按等對(duì)數(shù)間距各設(shè)置6個(gè)濃度組和1個(gè)空白對(duì)照組。曝氣組敵百蟲質(zhì)量濃度為1.35、1.82、2.45、3.31、4.47、6.03 mg/L；池塘組敵百蟲質(zhì)量濃度為0.01、0.14、0.21、0.31、0.46、0.68 mg/L。每個(gè)5 L塑料盆內(nèi)放入10尾奧尼羅非魚。試驗(yàn)期間不投飼，每24 h更換1次試驗(yàn)藥液，發(fā)現(xiàn)有死亡的試驗(yàn)魚及時(shí)撈出。試驗(yàn)開始8 h后，定時(shí)觀察試驗(yàn)魚的中毒情況及死亡癥狀[10]，并記錄24、48、72、96 h魚的死亡數(shù)量。如試驗(yàn)魚長時(shí)間無肉眼可見動(dòng)作，用小鑷子夾住魚的尾柄部，其對(duì)外界刺激無反應(yīng)即可判斷該魚已經(jīng)死亡。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用EXCEL軟件進(jìn)行處理，分別建立不同暴露時(shí)間(24、48、72、96 h)敵百蟲質(zhì)量濃度與奧尼羅非魚死亡率之間的線性回歸方程，根據(jù)回歸方程分別計(jì)算奧尼羅非魚在相應(yīng)暴露時(shí)間的半致死濃度(LC50)[11-13]。

安全濃度(SC)的計(jì)算公式[14]如下。

SC=0.1×96 h LC50

(1)

2 結(jié)果和分析

2.1 曝氣自來水條件下敵百蟲對(duì)奧尼羅非魚的急性毒性

試驗(yàn)期間觀察發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組的奧尼羅非魚一直表現(xiàn)正常。6個(gè)試驗(yàn)組的奧尼羅非魚起初活動(dòng)情況均為正常，8 h后，A3、A4組奧尼羅非魚開始表現(xiàn)異常，游動(dòng)變緩，慢慢地在水面漂游，魚體或靜臥或側(cè)臥，逐漸失去平衡，尾部緩緩擺動(dòng)，嘴巴慢慢張合，A5、A6組試驗(yàn)魚中毒表現(xiàn)較為明顯，出現(xiàn)興奮狀態(tài)，狂游亂竄，活動(dòng)劇烈，不時(shí)撞擊塑料盆壁；12 h后，A3、A4、A5、A6組奧尼羅非魚均呈現(xiàn)出興奮狀態(tài)，開始毫無目的地急速游動(dòng)，魚體漸漸失去平衡。隨著試驗(yàn)時(shí)長增加，中毒的奧尼羅非魚出現(xiàn)抽搐現(xiàn)象，呼吸停止，最后側(cè)翻死去，漂浮在水面。死亡后的奧尼羅非魚身體僵直，體色變黑，眼球突出并出現(xiàn)白色薄膜，鰓蓋出血，鰓蓋和口部張開。

曝氣自來水條件下敵百蟲對(duì)奧尼羅非魚的毒性試驗(yàn)結(jié)果見表1。對(duì)照組沒有出現(xiàn)死亡，A1、A2組在24、48 h沒有出現(xiàn)死亡，72 h出現(xiàn)死亡，A3、A4、A5、A6組在24 h出現(xiàn)死亡，而敵百蟲質(zhì)量濃度最高的A6組24 h試驗(yàn)魚即全部死亡。

將試驗(yàn)結(jié)果使用EXCEL軟件做線性回歸處理。以x為藥物的質(zhì)量濃度，y為死亡魚尾數(shù)，得到線性回歸方程，并計(jì)算出敵百蟲對(duì)奧尼羅非魚的半致死濃度(LC50)和安全濃度(SC)，結(jié)果見表2。

由表2可見，在同樣的試驗(yàn)時(shí)長內(nèi)，敵百蟲質(zhì)量濃度越高，對(duì)奧尼羅非魚的毒性就越大，奧尼羅非魚的死亡率越高；同一質(zhì)量濃度下，試驗(yàn)時(shí)間越長，奧尼羅非魚死亡率越高。結(jié)果顯示，曝氣自來水條件下敵百蟲對(duì)奧尼羅非魚24、48、72、96 h的半致死質(zhì)量濃度分別為3.68、3.31、2.05、1.57 mg/L，安全質(zhì)量濃度為0.157 mg/L。

2.2 池塘水條件下敵百蟲對(duì)奧尼羅非魚的急性毒性

試驗(yàn)期間，對(duì)照組的奧尼羅非魚表現(xiàn)正常，沒有出現(xiàn)死亡。池塘水樣采集時(shí)間為16：00，池塘水24 h內(nèi)pH的變化范圍為8.5～7.8，呈緩慢降低趨勢(shì)。試驗(yàn)開始時(shí)，6個(gè)試驗(yàn)組的奧尼羅非魚活動(dòng)情況均正常，8 h后，B1、B2、B3組試驗(yàn)魚開始表現(xiàn)異常，游動(dòng)變得緩慢，魚體靜臥或側(cè)臥，在水面漂游，開始失去平衡，尾部緩緩擺動(dòng)，嘴巴慢慢張合；B4、B5、B6組試驗(yàn)魚中毒表現(xiàn)較為明顯，出現(xiàn)興奮狀態(tài)，狂游亂竄，游動(dòng)劇烈，不時(shí)地撞擊塑料盆，此時(shí)測(cè)得水體pH為8.2。12 h后，pH降為8.0，B3、B4、B5、B6組試驗(yàn)魚表現(xiàn)出興奮狀態(tài)，毫無目的地急速游動(dòng)，魚體逐漸失去平衡，在水中翻滾。隨著試驗(yàn)時(shí)長增加，中毒的奧尼羅非魚開始抽搐，停止呼吸，最后側(cè)臥死去，漂浮于水面。死亡后的魚體僵直，體色變白，眼球突出并出現(xiàn)白色薄膜，鰓蓋出血，鰓蓋和口部張開。

表1 曝氣自來水條件下敵百蟲對(duì)奧尼羅非魚幼魚的毒性試驗(yàn)結(jié)果

表2 曝氣自來水條件下敵百蟲對(duì)奧尼羅非魚幼魚的半致死濃度(LC50)及其安全濃度(SC)

表3 池塘水條件下敵百蟲對(duì)奧尼羅非魚幼魚的毒性試驗(yàn)結(jié)果

池塘水條件下敵百蟲對(duì)奧尼羅非魚的毒性試驗(yàn)結(jié)果見表3。對(duì)照組沒有死亡，B1組在24 h、48 h均沒有試驗(yàn)魚死亡，72 h試驗(yàn)魚出現(xiàn)死亡。B2、B3、B4、B5、B6組在試驗(yàn)開始后24 h試驗(yàn)魚就出現(xiàn)死亡，而敵百蟲質(zhì)量濃度最高的B6組，24 h試驗(yàn)魚即全部死亡。

將試驗(yàn)結(jié)果使用EXCEL軟件做線性回歸處理。以x為藥物的質(zhì)量濃度，y為死亡魚尾數(shù)，得到線性回歸方程，并計(jì)算出敵百蟲對(duì)奧尼羅非魚的半致死濃度(LC50)和安全濃度(SC)，結(jié)果見表4。

由表4可見，在同樣的試驗(yàn)時(shí)長內(nèi)，敵百蟲質(zhì)量濃度越高，對(duì)奧尼羅非魚幼魚的毒性就越大，魚的死亡率越高；同一質(zhì)量濃度下，試驗(yàn)時(shí)間越長，奧尼羅非魚死亡率越高。結(jié)果顯示，在池塘水條件下敵百蟲對(duì)奧尼羅非魚24、48、72、96 h的半致死質(zhì)量濃度分別為0.35、0.29、0.17、0.13 mg/L，其安全質(zhì)量濃度為0.013 mg/L。

表4 池塘水水條件下敵百蟲對(duì)奧尼羅非魚幼魚的半致死濃度(LC50)及其安全濃度(SC)

3 討論

3.1 敵百蟲對(duì)魚類的毒性機(jī)理

有研究表明，給藥3 h后，敵百蟲的濃度在大腦組織中是最高的，然后會(huì)集中于脊髓和肌肉組織[15]。有資料表明，如魚類長期接觸低濃度的敵百蟲，不但體內(nèi)膽堿脂酶的活性會(huì)被抑制，而且還會(huì)損害肝、腎及體內(nèi)細(xì)胞的遺傳物質(zhì)。敵百蟲對(duì)水生動(dòng)物的殺滅作用是其水解產(chǎn)物“敵敵畏”所致。“敵敵畏”是1種膽堿脂酶抑制劑，能抑制生物體內(nèi)膽堿脂酶的活性，使機(jī)體失去水解破壞乙酸膽堿的能力，進(jìn)而使魚類、昆蟲、甲殼類等生物神經(jīng)失常而死亡。此外，敵百蟲還能使魚體的周圍神經(jīng)系統(tǒng)麻痹，發(fā)生遲發(fā)性神經(jīng)病變[16]。在本試驗(yàn)中，奧尼羅非魚表現(xiàn)出明顯的運(yùn)動(dòng)失常，出現(xiàn)了狂游、亂竄、失去方位感及無法控制身體等癥狀，與一些文獻(xiàn)資料中報(bào)道的相符。

3.2 敵百蟲與水體pH的關(guān)系

敵百蟲是1種高效低毒類殺蟲劑，在漁業(yè)生產(chǎn)中被廣泛使用。但敵百蟲在殺死敵害生物的同時(shí)，對(duì)養(yǎng)殖魚類也有一定的毒害作用，特別是在堿性條件下，敵百蟲脫去氯化氫會(huì)轉(zhuǎn)化成“敵敵畏”，其毒性增加10～15倍。敵百蟲脫去氯化氫轉(zhuǎn)化為“敵敵畏”的過程隨著水體pH的升高而加快[17]。在本試驗(yàn)中，曝氣自來水與池塘水在pH上有明顯的差別，曝氣自來水24 h內(nèi)的pH保持在6.5左右，而池塘水試驗(yàn)開始24 h內(nèi)的pH在7.8～8.5。試驗(yàn)結(jié)果顯示，在池塘水條件下敵百蟲的安全濃度(0.013 mg/L)明顯要低于曝氣自來水條件下的安全濃度(0.157 mg/L)，二者相差約12倍，因此，在池塘養(yǎng)殖生產(chǎn)中使用敵百蟲時(shí)應(yīng)根據(jù)水體的pH嚴(yán)格控制使用濃度。養(yǎng)殖水體的pH往往會(huì)不斷變化，如敵百蟲使用時(shí)機(jī)不當(dāng)會(huì)導(dǎo)致養(yǎng)殖魚類死亡。此外，敵百蟲對(duì)奧尼羅非魚的急性毒性還應(yīng)考慮水溫、溶解氧、魚體大小等因素，本試驗(yàn)測(cè)得的半致死濃度和安全濃度結(jié)果在生產(chǎn)上僅作參考。

3.3 “敵敵畏”對(duì)魚類的毒性機(jī)理

“敵敵畏”由敵百蟲脫去氯化氫轉(zhuǎn)化而成，是1種神經(jīng)性殺蟲劑，其作用機(jī)制主要是通過抑制腦突觸體膜上的腺苷，使突觸體膜上的乙酰膽堿酯酶等神經(jīng)遞質(zhì)大量聚集，從而使腦乙酰膽堿酯酶被抑制[18-19]。“敵敵畏”對(duì)魚類作用的研究報(bào)道較少。根據(jù)報(bào)道[20-22]，“敵敵畏”對(duì)鯽魚幼魚48、72、96 h的半致死濃度分別為45.1、30.4、23.3 mg/L，安全濃度為2.3 mg/L；對(duì)金魚24、48、72、96 h的半致死濃度分別為39.17、33.65、27.10、25.94 mg/L，安全濃度為2.5 mg/L；對(duì)草魚的96 h半致死濃度為21.9 mg/L，安全濃度為2.19 mg/L。本試驗(yàn)結(jié)果表明，在池塘水條件下敵百蟲對(duì)奧尼羅非魚的96 h半致死濃度為0.13 mg/L，安全濃度為0.013 mg/L，說明奧尼羅非魚對(duì)敵百蟲的耐受能力較差，因此對(duì)“敵敵畏”的耐受能力也差，少量的“敵敵畏”就可能導(dǎo)致奧尼羅非魚死亡。

3.4 敵百蟲的安全使用方法

本試驗(yàn)結(jié)果表明，在池塘水條件下奧尼羅非魚幼魚對(duì)敵百蟲較敏感，其安全濃度僅為0.013 mg/L，與曝氣自來水條件下得出的安全濃度相差12倍左右。所以，作為奧尼羅非魚的魚病防治藥物，使用敵百蟲時(shí)應(yīng)當(dāng)嚴(yán)格控制用量，在使用前應(yīng)進(jìn)行測(cè)試。根據(jù)敵百蟲對(duì)魚類毒性的作用規(guī)律，其毒性隨著水體pH的升高而加強(qiáng)，因此在生產(chǎn)中使用敵百蟲治療魚病或控制浮游生物時(shí)，應(yīng)根據(jù)水體pH的變化調(diào)整其使用劑量。由于光合作用，池塘水體的pH具有明顯的晝夜變化規(guī)律，表現(xiàn)為早晨(4：00—8：00)較低，下午(14：00—16：00)較高，pH變化范圍為7.8～8.5。因此，施用敵百蟲最好選擇在晴天早晨6：00或晚上22：00進(jìn)行。通常在晴天的早晨，浮游植物光合作用較弱，水體pH較低，傍晚pH又開始下降，至翌日凌晨降至最低。因此，在晴天早晨6：00或晚上22：00施藥，敵百蟲能逐漸發(fā)揮作用并逐步降解，至pH達(dá)到高峰時(shí)，敵百蟲已基本降解完畢，不易形成突發(fā)性“敵敵畏”高峰。此外，還必須考慮敵百蟲的累積作用，一般水體pH越低，敵百蟲殘留的時(shí)間越長[23]。因此，養(yǎng)殖池塘中不能在短時(shí)間內(nèi)反復(fù)多次使用敵百蟲，施用敵百蟲后也不能施放堿性的藥物或水體改良劑，以免水體pH突然升高。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)在水溫(23.5±2.0)℃、溶解氧>5 mg/L的條件下，分別研究了曝氣自來水(pH為6.5)和池塘養(yǎng)殖水(pH為8.5)中敵百蟲對(duì)奧尼羅非魚的急性毒性效應(yīng)。結(jié)果表明，在曝氣自來水條件下，敵百蟲對(duì)奧尼羅非魚24、48、72、96 h的半致死濃度質(zhì)量分別為3.68、3.31、2.05、1.57 mg/L，安全質(zhì)量濃度為0.157 mg/L；在池塘水條件下，敵百蟲對(duì)奧尼羅非魚24、48、72、96 h的半致死質(zhì)量濃度分別為0.35、0.29、0.17、0.13 mg/L，安全質(zhì)量濃度為0.013 mg/L。在池塘水條件下敵百蟲對(duì)奧尼羅非魚的毒性比在曝氣自來水中強(qiáng)，其安全濃度也相差約12倍，這一結(jié)果可為奧尼羅非魚養(yǎng)殖及水生毒理效應(yīng)試驗(yàn)提供參考。