N6-甲基腺苷修飾在卵母細(xì)胞發(fā)育過程中作用機(jī)制的研究進(jìn)展

李艷梅，王乃輝，孫小燕，張學(xué)紅

(1.蘭州大學(xué)第一醫(yī)院，蘭州 730000；2.蘭州大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，蘭州 730000；3.甘肅省生殖醫(yī)學(xué)與胚胎重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州 730000)

近年來，真核生物中發(fā)現(xiàn)的RNA修飾已超過150多種，其中N6-甲基腺苷(m6A)是最常見、最豐富和最保守的修飾方式，并且以一種動(dòng)態(tài)、可逆的方式調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)mRNA的甲基化水平[1]。甲基轉(zhuǎn)移酶、去甲基酶和甲基結(jié)合蛋白共同調(diào)節(jié)m6A的動(dòng)態(tài)可逆修飾。其中，m6A甲基轉(zhuǎn)移酶包括：甲基轉(zhuǎn)移酶樣蛋白3(METTL3)、甲基轉(zhuǎn)移酶樣蛋白14(METTL14)、Wilms腫瘤抑制因子(WT1)相關(guān)蛋白(WTAP)、RNA結(jié)合基序蛋白15(RBM15)、類病毒m6A甲基轉(zhuǎn)移酶(VIRMA/KIAA1429)，稱為“寫入者”(Writer)；去甲基化酶包括：脂肪量和肥胖相關(guān)蛋白(FTO)、ALKB同源物5(ALKBH5)，稱為“擦除器”(Eraser)；m6A甲基結(jié)合蛋白包括：YTH結(jié)構(gòu)域家族蛋白(YTHDC1/2、YTHDF1/2/3)、胰島素樣生長(zhǎng)因子mRNA結(jié)合蛋白(IGF2BP1/2/3)，稱為“解讀器”(Reader)。越來越多的證據(jù)表明，m6A修飾通過影響RNA的正常代謝過程，如剪接[2]、翻譯[3]、穩(wěn)定[4]和降解[5]等，從而參與調(diào)控多種疾病的發(fā)生發(fā)展[6-8]。

卵母細(xì)胞發(fā)育過程分為生長(zhǎng)、成熟和排卵3個(gè)不同的階段。生發(fā)泡破裂(GVBD)通常被認(rèn)為是卵母細(xì)胞成熟的一個(gè)標(biāo)志。在哺乳動(dòng)物中，卵母細(xì)胞停滯在減數(shù)分裂前期直到青春期，然后，在神經(jīng)、激素和分子信號(hào)的聯(lián)合調(diào)控下，發(fā)育成熟的生發(fā)囊泡卵母細(xì)胞(GV)恢復(fù)減數(shù)分裂并發(fā)生GVBD；隨后，同源染色體配對(duì)，微管在減數(shù)分裂中期Ⅰ(MI)組裝成雙極紡錘體，同源染色體附著于紡錘體并在紡錘絲的牽拉下作為第1極體從卵母細(xì)胞排出，完成第1個(gè)減數(shù)分裂周期；之后，卵母細(xì)胞進(jìn)入第2個(gè)減數(shù)分裂周期，并在減數(shù)分裂中期Ⅱ(MⅡ)再次停止；經(jīng)過精子受精或孤雌激活后，卵母細(xì)胞再次恢復(fù)并完成第2次減數(shù)分裂，繼續(xù)早期胚胎發(fā)育。既往研究顯示，正常甲基化參與細(xì)胞的減數(shù)分裂過程，甲基化發(fā)生改變可影響減數(shù)分裂過程并改變細(xì)胞命運(yùn)[9-10]。卵母細(xì)胞作為雌性生殖細(xì)胞，其發(fā)生和成熟過程的順利進(jìn)行對(duì)后續(xù)合子、胚胎和子代發(fā)育都有重大意義。

m6A甲基轉(zhuǎn)移酶、去甲基酶和甲基結(jié)合蛋白的相關(guān)成員在卵母細(xì)胞的生長(zhǎng)、成熟過程中所起的作用機(jī)制有很多研究進(jìn)展，現(xiàn)綜述如下。

一、m6A甲基轉(zhuǎn)移酶對(duì)卵母細(xì)胞發(fā)生的影響

1.METTL3：是第1個(gè)被鑒定的m6A甲基轉(zhuǎn)移酶，其在酵母和人類中高度保守。METTL3在各個(gè)發(fā)育階段的卵母細(xì)胞的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中均可被檢測(cè)到，GV期卵母細(xì)胞中METTL3主要定位于細(xì)胞核。METTL3通過影響性激素合成和紡錘體形成過程中的關(guān)鍵基因表達(dá)來影響卵母細(xì)胞的成熟。敲除小鼠胚胎干細(xì)胞中的Mettl3后會(huì)阻礙胚胎干細(xì)胞分化，并導(dǎo)致早期胚胎致死[11]。將Mettl3 siRNA微注射到小鼠GV期卵母細(xì)胞后，雖然卵母細(xì)胞減數(shù)分裂正常，但是后續(xù)第1極體排出率顯著降低，卵母細(xì)胞中Cltc、Pcnt、Spdl-1和Msy2的mRNA相對(duì)表達(dá)量均顯著升高，而Western blot卻顯示各蛋白豐度降低[12]，表明Mettl3 siRNA處理后GV期卵母細(xì)胞內(nèi)Cltc、Pcnt、Spdl-1和Msy2的翻譯效率降低。有研究發(fā)現(xiàn)，Cltc、Pcnt、Spdl-1和Msy2在小鼠卵母細(xì)胞紡錘體形成和染色體重組過程中起到了重要調(diào)控作用[13-14]。成年雌性Mettl3突變(Zmettl3m/m)斑馬魚的m6A水平降低，卵泡中Npr、Igf3、Star、3βhsd和Cyp19a1a的表達(dá)量顯著降低，垂體中Lh、Npr和Igf3的表達(dá)量顯著降低[15]。Tang等[16]研究發(fā)現(xiàn)，Lh、Npr和Igf3對(duì)雌性斑馬魚卵母細(xì)胞的成熟和排卵有刺激作用。Fsta可抑制HCG誘導(dǎo)的卵母細(xì)胞成熟，Zmettl3m/m斑馬魚卵泡中Fsta的表達(dá)水平顯著增加[15]。由此可見，卵母細(xì)胞的成熟由多個(gè)環(huán)節(jié)協(xié)同作用，而METTL3在體內(nèi)通過多個(gè)途徑影響卵母細(xì)胞的生長(zhǎng)、成熟，一旦功能缺失就會(huì)導(dǎo)致卵母細(xì)胞早期發(fā)育停滯。

2.METTL14：與METTL3一樣，METTL14也是甲基轉(zhuǎn)移酶的核心成員。在“寫入”甲基的過程中，METTL3起催化作用，METTL14則促進(jìn)甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物與RNA結(jié)合。有報(bào)道發(fā)現(xiàn)，在豬卵母細(xì)胞中抗壞血酸可能通過抑制METTL14的表達(dá)而降低MII期m6A的整體水平，進(jìn)而影響細(xì)胞周期和細(xì)胞發(fā)育[17]。然而，METTL14對(duì)卵母細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育具體的作用機(jī)制還有待今后進(jìn)一步深入研究。

3.WTAP：是一種與剪接因子共定位的核蛋白，可與WT1特異性結(jié)合，在細(xì)胞功能和癌癥(如上皮性卵巢癌)進(jìn)展中發(fā)揮重要作用[18]。WTAP作為m6A甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物的重要成員，WTAP和RBM15均為依賴于METTL3和METTL14的調(diào)節(jié)蛋白。環(huán)亮氨酸是一種蛋氨酸腺苷轉(zhuǎn)移酶抑制劑，可通過降低S-腺苷蛋氨酸的濃度而降低整體m6A水平。有研究發(fā)現(xiàn)，將豬的卵丘復(fù)合體(COCs)在環(huán)亮氨酸中暴露24 h后，卵丘細(xì)胞的擴(kuò)張受到抑制、GVBD率顯著下降、阻滯減數(shù)分裂過程使MI期細(xì)胞增加，同時(shí)，WTAP表達(dá)也顯著增加[19]。

4.KIAA1429：KIAA1429是一種新鑒定出的m6A甲基轉(zhuǎn)移酶，通過調(diào)節(jié)選擇性剪接參與卵母細(xì)胞的發(fā)育和減數(shù)分裂。在引導(dǎo)m6A在mRNA的區(qū)域選擇性沉積中發(fā)揮關(guān)鍵作用[20]。據(jù)BioGPS數(shù)據(jù)庫(kù)統(tǒng)計(jì)，Kiaa1429在小鼠卵母細(xì)胞中高表達(dá)[21]，表明它可能是卵母細(xì)胞某一特定功能的關(guān)鍵因子。Hu等[22]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)小鼠卵母細(xì)胞特異性缺失Kiaa1429(Kiaa1429Zp3cKO)后，小鼠卵泡發(fā)育停滯在初級(jí)卵泡期，卵母細(xì)胞GVBD失敗。在卵母細(xì)胞中KIAA1429定位于核斑，核斑中富含pre-mRNA處理因子和參與選擇性剪接的因子[23]。當(dāng)卵母細(xì)胞中Kiaa1429缺失后，YTHDC1位點(diǎn)數(shù)量顯著減少，說明卵母細(xì)胞中KIAA1429對(duì)核斑中特定mRNA處理因子的定位具有重要作用。

二、m6A去甲基酶對(duì)卵母細(xì)胞發(fā)生的影響

1.FTO：FTO是第1個(gè)被報(bào)道的m6A去甲基酶[24]，在卵母細(xì)胞內(nèi)定位于核斑和細(xì)胞質(zhì)。與對(duì)照組相比較，卵巢功能不全(POI)患者的卵巢組織和卵巢顆粒細(xì)胞中FTO的轉(zhuǎn)錄和翻譯水平均顯著降低，細(xì)胞增殖顯著降低而凋亡顯著增加[25]。Sun等[26]研究發(fā)現(xiàn)，不孕癥患者卵泡液和顆粒細(xì)胞中FTO的表達(dá)水平隨著患者卵巢衰老程度增加而逐漸降低，m6A水平增加。由于人卵母細(xì)胞受倫理等的限制，缺少直接對(duì)人卵母細(xì)胞進(jìn)行FTO基因干預(yù)的研究。盡管如此，由于顆粒細(xì)胞承擔(dān)著卵母細(xì)胞物質(zhì)運(yùn)輸和信號(hào)傳遞等重要作用，我們可以推測(cè)，當(dāng)顆粒細(xì)胞的增殖和凋亡改變時(shí)，必然會(huì)影響到卵母細(xì)胞的正常生長(zhǎng)。FTO與卵母細(xì)胞的直接聯(lián)系還需要更多后續(xù)研究來揭示。

2.ALKBH5：ALKBH5和FTO同屬于ALKB家族，然而ALKBH5對(duì)卵巢顆粒細(xì)胞的影響并未表現(xiàn)出與FTO類似的現(xiàn)象[25]。有趣的是，盡管ALKBH5在卵巢中的作用尚不明確，與卵母細(xì)胞發(fā)生關(guān)系的研究更是少見，但是卻在小鼠睪丸中高表達(dá)，ALKBH5缺失會(huì)導(dǎo)致小鼠精子成熟停滯，最終導(dǎo)致不育[27]。這也體現(xiàn)了同一家族不同成員之間對(duì)作用細(xì)胞種類的特異性。

三、m6A甲基結(jié)合蛋白對(duì)卵母細(xì)胞發(fā)生的影響

m6A的甲基結(jié)合蛋白優(yōu)先與mRNA上的m6A結(jié)合，通過調(diào)控mRNA剪接和輸出以誘導(dǎo)其下游基因。

1.YTHDF1/2/3：通過調(diào)控卵母細(xì)胞成熟過程中的基因轉(zhuǎn)錄，保證卵母細(xì)胞具備維持早期合子正常發(fā)育的能力。在卵泡發(fā)育的各個(gè)階段，YTHDF2在卵母細(xì)胞和顆粒細(xì)胞中均有表達(dá)[28]。卵母細(xì)胞特異性缺失Ythdf2的雌性小鼠(Ythdf2mCKO)能夠正常排卵并形成黃體，當(dāng)使用孕馬血清(PMSG)和HCG促排卵后也可產(chǎn)生與野生型數(shù)量相當(dāng)?shù)腗II卵母細(xì)胞，然而，Ythdf2mCKO小鼠受精后正常的兩細(xì)胞期胚胎數(shù)量減少且胚胎內(nèi)還會(huì)出現(xiàn)微核或去核等胞質(zhì)分裂缺陷的情況[28]。相似的情況在Zhao等[29]對(duì)斑馬魚的研究中也有報(bào)道，缺失Ythdf2的斑馬魚會(huì)嚴(yán)重?fù)p害其胚胎的正常發(fā)育。深入分析Ythdf2mCKO小鼠發(fā)現(xiàn)，MII期卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組內(nèi)的基因表達(dá)失調(diào)，而GV期卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組內(nèi)的基因表達(dá)卻接近正常，說明在卵母細(xì)胞成熟過程中YTHDF2調(diào)控正常的基因轉(zhuǎn)錄，從而保證卵母細(xì)胞維持早期合子的正常發(fā)育[28]。Ivanova等[28]研究發(fā)現(xiàn)，缺失Ythdf2的小鼠在減數(shù)分裂和卵母細(xì)胞成熟過程中，導(dǎo)致YTHDF2調(diào)控的基因表達(dá)上調(diào)，從而擾亂了卵母細(xì)胞的正常成熟過程。

YTHDF1、YTHDF2和YTHDF3協(xié)同合作，通過影響m6A修飾mRNAs的翻譯和衰變，促進(jìn)細(xì)胞質(zhì)中mRNAs的代謝過程[28，30]，調(diào)節(jié)卵母細(xì)胞的m6A水平。

2.YTHDC1/2：YTHDC1/2通過阻止卵母細(xì)胞中出現(xiàn)選擇性聚腺苷酸化來維持pre-mRNA 3’UTR長(zhǎng)度的穩(wěn)定，從而利于卵母細(xì)胞成熟。YTHDC1定位于含有活性轉(zhuǎn)錄位點(diǎn)的核斑，最初稱為YT521-B。YTHDC1為減數(shù)分裂染色質(zhì)相關(guān)蛋白，可影響RNA核輸出等功能[31]。從GV期到MII期的小鼠卵母細(xì)胞中YTHDC1蛋白水平逐漸增加，表明YTHDC1由休眠的母體mRNA編碼，在卵母細(xì)胞成熟過程中被招募[32]。當(dāng)雌性小鼠Ythdc1基因失活，卵巢上表現(xiàn)為次級(jí)卵泡或竇狀卵泡缺乏，卵母細(xì)胞發(fā)育阻滯在初級(jí)卵泡階段[32]。Ythdc1缺失導(dǎo)致卵母細(xì)胞細(xì)胞核中原本與YTHDC1結(jié)合的pre-mRNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在加工過程中出現(xiàn)大量選擇性剪接缺陷，卵母細(xì)胞中選擇性聚腺苷酸化增加，pre-mRNA的3’UTR長(zhǎng)度改變[32]。pre-mRNA 3’UTR包含許多microRNA及RNA結(jié)合蛋白的靶點(diǎn)，3’UTR延長(zhǎng)或縮短將對(duì)翻譯效率、轉(zhuǎn)錄穩(wěn)定性和亞細(xì)胞轉(zhuǎn)錄本定位產(chǎn)生影響[33-34]。因此，卵母細(xì)胞中YTHDC1對(duì)于防止選擇性聚腺苷酸化、維持pre-mRNA 3’UTR長(zhǎng)度的穩(wěn)定、達(dá)到精確調(diào)節(jié)卵母細(xì)胞成熟起著重要作用。

YTHDC2主要在哺乳動(dòng)物的睪丸組織中高度特異性表達(dá)，參與精子的減數(shù)分裂，對(duì)精子發(fā)生起著重要調(diào)控作用[35]。目前，尚不清楚YTHDC2與卵母細(xì)胞發(fā)育的關(guān)系。

3.IGF2BP3：通過調(diào)節(jié)與染色體配對(duì)和同源重組相關(guān)分子的表達(dá)進(jìn)而影響初級(jí)卵母細(xì)胞的發(fā)育。Igf2bp3在魚類和哺乳動(dòng)物中高度保守。研究發(fā)現(xiàn)，青鳉魚卵巢內(nèi)IGF2BP3高表達(dá)，當(dāng)青鳉魚卵巢缺失性腺體細(xì)胞衍生因子(Gsdf)時(shí)，卵巢中IGF2BP3的表達(dá)顯著增加，表現(xiàn)為卵巢內(nèi)過量的初級(jí)卵母細(xì)胞不規(guī)則積累、呈現(xiàn)囊性[36]。Vg1RBP/Vera是Igf2bp3的同源基因。據(jù)報(bào)道，Vg1RBP/Vera對(duì)非洲爪蟾卵母細(xì)胞發(fā)生中的mRNA定位至關(guān)重要[37]。Igf2bp3在青鳉魚和非洲爪蟾中的表達(dá)模式類似，表明Igf2bp3也可能在卵母細(xì)胞mRNA的準(zhǔn)確定位上起重要作用，但具體的調(diào)控方式目前尚不清楚。

綜上所述，無論是m6A甲基轉(zhuǎn)移酶、去甲基化酶還是甲基結(jié)合蛋白都可能對(duì)卵母細(xì)胞的生長(zhǎng)、成熟有影響。在卵母細(xì)胞減數(shù)分裂過程中，卵母細(xì)胞mRNA甲基化狀態(tài)調(diào)節(jié)了細(xì)胞翻譯和細(xì)胞分裂過程[19]。在此期間，甲基轉(zhuǎn)移酶、去甲基化酶及結(jié)合蛋白作為不可分割的整體共同調(diào)控了卵母細(xì)胞內(nèi)mRNA的甲基化狀態(tài)。

四、展望

異常的m6A修飾水平可導(dǎo)致RNA功能失調(diào)，影響基礎(chǔ)生物學(xué)過程，進(jìn)而引發(fā)癌癥、卵母細(xì)胞發(fā)育障礙和代謝性疾病等[6，38]。女性在自然衰老或病理衰老后，卵巢內(nèi)m6A甲基化水平增高[25-26，39]。因此，深入研究m6A甲基化酶、去甲基化酶和結(jié)合蛋白各相關(guān)分子與卵母細(xì)胞生長(zhǎng)、成熟的關(guān)系，有可能尋找到臨床干預(yù)POI和治療卵巢早衰(POF)的分子靶標(biāo)，進(jìn)而達(dá)到改善生育能力、提高生活質(zhì)量的目的。