表達(dá)山羊SLAM 受體的重組腺病毒的構(gòu)建及在增強(qiáng)PPRV 感染羊源原代細(xì)胞中的應(yīng)用

陳合鳳，張 帥，王喜軍，王金良，溫志遠(yuǎn)，葛金英，陳偉業(yè)*，步志高,2*

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150069；2.江蘇高校動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 揚(yáng)州 225009）

小反芻獸疫（Peste des petits ruminants，PPR）是一種由PPR 病毒（PPRV）引起的急性、高度接觸性傳染病。PPRV 主要感染小反芻獸，如綿羊和山羊，其中山羊比綿羊更容易感染該病毒[1]，新生和幼小動物比成年動物更易受到其影響。OIE 將PPR列為必須通報的動物疫病，在我國被列為一類動物傳染病。該病于1942 年在非洲的科特迪瓦首次報告，目前該病主要發(fā)生在非洲（最南部國家除外）、阿拉伯半島、中亞和中東、東亞以及東南亞等地。PPR 于2007 年在我國西藏地區(qū)發(fā)生，這也是中國境內(nèi)首次暴發(fā)PPR 疫情。2013 年底，我國再次暴發(fā)該疫情，2014 年P(guān)PR 在我國22 個省、自治區(qū)、直轄市出現(xiàn)，造成了重大經(jīng)濟(jì)損失。2015 年，為有效保障養(yǎng)羊業(yè)穩(wěn)定發(fā)展，中國農(nóng)業(yè)部制定了《全國小反芻獸疫消滅計劃（2016-2020 年）》。

腺病毒載體（Adenovirus，Ad）由于安全性高、宿主范圍廣泛、病毒顆粒相對穩(wěn)定等優(yōu)點，已成為最常用的病毒載體之一[2]。尤其是5 型腺病毒載體（Ad-5），由于其E1 區(qū)缺失造成病毒復(fù)制缺陷，不會引起宿主損傷，已廣泛應(yīng)用于如狂犬病病毒、流感病毒、埃博拉病毒等諸多病毒以及寄生蟲疫苗的研究，并獲得良好免疫效果[3]。現(xiàn)已鑒定的PPRV 受體有信號淋巴細(xì)胞激活分子（Signalling lymphocyte ac?tivation molecule，SLAM）[4]和脊髓灰質(zhì)炎病毒受體4（Nectin4）[5]。SLAM 也稱作CD150，它是多種麻疹病毒屬病毒的細(xì)胞受體，麻疹病毒屬病毒的H 蛋白通過與SLAM 結(jié)合開啟其感染過程，CD150 主要在淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及樹突狀細(xì)胞等細(xì)胞中表達(dá)。有學(xué)者構(gòu)建了表達(dá)犬SLAM 受體的Vero 細(xì)胞系，野生型犬瘟熱病毒能夠在該細(xì)胞系中良好生長并且該細(xì)胞系可穩(wěn)定表達(dá)SLAM 受體，并可以增強(qiáng)PPRV 的感染與復(fù)制[6-7]。吳錦艷等利用慢病毒介導(dǎo)技術(shù)將山羊SLAM 基因整合到Vero 細(xì)胞中獲得了穩(wěn)定表達(dá)SLAM的Vero 細(xì)胞系，與野生型Vero 細(xì)胞相比，病毒在該細(xì)胞系中的病變周期明顯縮短[8]。

相關(guān)研究中，主要利用Vero 細(xì)胞分離和培養(yǎng)PPRV，但利用羊源細(xì)胞作為分離培養(yǎng)PPRV 的細(xì)胞及研究模型，則更利于PPRV 復(fù)制及其與宿主細(xì)胞相互作用的研究。然而目前羊源細(xì)胞系非常稀少，且沒有一種適用于PPRV 的有效分離與培養(yǎng)。羔羊原代腎細(xì)胞和肺臟細(xì)胞等可用于PPRV 的分離，但通常需要盲傳數(shù)代，且其敏感性不高，降低了PPRV 的分離效率，制約了其與宿主細(xì)胞相互作用的研究。如果羊原代細(xì)胞能夠表達(dá)SLAM 受體，則會提高其對病毒的易感性，且更適合用于PPRV 的分離培養(yǎng)及其它研究。由于穩(wěn)定表達(dá)SLAM 的原代細(xì)胞系不易制備，因此只能通過構(gòu)建表達(dá)其受體的腺病毒載體等手段來感染細(xì)胞，從而實現(xiàn)受體在細(xì)胞中的表達(dá)。

基于此，本研究構(gòu)建表達(dá)山羊SLAM（Goat SLAM，gSLAM）的重組腺病毒，將其感染羊源原代細(xì)胞并表達(dá)gSLAM 受體，以提高該細(xì)胞對PPRV 的易感性，為PPRV 的分離培養(yǎng)及與宿主細(xì)胞相互作用等研究提供重要的研究工具。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、質(zhì)粒和病毒Vero 細(xì)胞、293A 細(xì)胞、pShuttle-CMV 質(zhì)粒、不帶外源基因的腺病毒Ad、pIRES3-gSLAM 質(zhì)粒[9]、原代羔羊睪丸細(xì)胞（Lamb testicular，LT）、表達(dá)綠色熒光蛋白的重組rPPRV/GFP[7]，其親本病毒為PPRV Nigeria75/1 疫苗株，由本實驗室保存、制備或構(gòu)建；PPR 中國流行株P(guān)PRV/CN/HLJ/13 是在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所國家動物疫病防控高級別生物安全實驗室生物安全三級防護(hù)條件下分離和保存。

1.2 主要試劑Phanta Max Super-Fidelity DNA 聚合酶、質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒、ClonExpress MultiS One Step Cloning Kit、AceQ?U+ Probe Master Mix、DH5α 感受態(tài)細(xì)胞均購自南京諾唯贊生物科技有限公司；各種限制性內(nèi)切酶購自NEB 公司；大腸桿菌BJ5183 感受態(tài)細(xì)胞購自北京博邁德基因技術(shù)有限公司；Lipofectamine 3000 轉(zhuǎn)染試劑盒購自Invitro?gen 公司；質(zhì)粒大提試劑盒購自天根生化（北京）科技有限公司；Flag 單克隆抗體（MAb）、HRP 標(biāo)記的山羊抗鼠IgG（IgG-HRP）購自Thermo 公司；增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光顯影試劑購自默克公司。

1.3 引物的設(shè)計與合成根據(jù)pIRES3-gSLAM 質(zhì)粒序列設(shè)計引物gSLAM-F：CTAGAGATCTGGTACCGT CGACGCCGCCACCATGGACCACAAG/gSLAM-R：GCT TTAACAGAGAGAAGTTCGTGGCGCCGCTTCCCTTGTC GTCGTCGTCCTTGTAGACGGACTCGGGCAC，用于擴(kuò)增目的基因gSLAM。根據(jù)GenBank 登錄的mCherry 基因（MF169983.1）合成mCherry 基因，并設(shè)計引物mCherry-F：GCCACGAACTTCTCTCTGTTAAAGCAAG CAGGAGATGTTGAAGAAAACCCCGGGCCCATGGTGA GCAAGGGCGAG/mCherry- R： AGGCTCGAGCGGCCG CGTCGACCTACTTGTACAGCTCGTCCATG（斜體部分為Sal I 酶切位點），用于擴(kuò)增mCherry 目的基因片段。根據(jù)pShuttle-CMV 質(zhì)粒序列設(shè)計引物JD-F：CTAGAGATCTGGTACCGTC/JD-R：AGGCTCGAGCGG CCGCGTC，用于鑒定重組腺病毒。引物和基因均由吉林省庫美生物科技有限公司合成。

1.4 重組腺病毒載體pAd-gSLAM-mCherry 的構(gòu)建與鑒定以pIRES3-gSLAM 質(zhì)粒為模板，利用gSLAM-F/R 引物PCR 擴(kuò)增gSLAM 片段；以合成的mCherry 基因為模板，利用mCherry-F/R 引物PCR 擴(kuò)增mCherry 片段。pShuttle-CMV 質(zhì)粒經(jīng)Sal I 酶切，PCR 產(chǎn)物gSLAM 和酶切產(chǎn)物mCherry 純化回收后，利用ClonExpress MultiS One Step Cloning Kit 將上述兩個片段克隆至穿梭質(zhì)粒pShuttle-CMV（約7.5 kb），經(jīng)測序鑒定得到正確的重組穿梭載體pShuttlegSLAM-mCherry。將該載體經(jīng)Pme I 線性化后，轉(zhuǎn)化至含有pAdEasy-1 的BJ5183 感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行同源重組，在卡那霉素抗性的培養(yǎng)基上篩選，挑取單克隆，用Pac I 酶切鑒定后，得到重組腺病毒載體，命名為pAd-gSLAM-mCherry。

1.5 重組腺病毒rAd-gSLAM 的包裝、鑒定利用Lipofectamine 3000 轉(zhuǎn)染試劑將2.5 μg Pac I 酶切線性化的質(zhì)粒pAd-gSLAM-mCherry 轉(zhuǎn)染293A 細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后7 d 利用熒光顯微鏡觀察，待細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞病變（CPE）時收集細(xì)胞，反復(fù)凍融并劇烈震蕩細(xì)胞3 次后提取細(xì)胞總DNA，利用鑒定引物JD-F/R 經(jīng)PCR 鑒定后獲得的重組腺病毒命名為rAD-gSLAM。將收集到的病毒液再感染293A 細(xì)胞并傳代，取第3 代病毒滴定后用于后續(xù)試驗。

1.6 重組腺病毒感染Vero 細(xì)胞后外源基因表達(dá)的檢測以第3 代rAd-gSLAM（MOI 3）感染6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中密度約為90%的Vero 細(xì)胞，分別于感染后24 h 和120 h 在倒置熒光顯微鏡下觀察。感染48 h 后收獲細(xì)胞（Vero/rAd-gSLAM）及上清，經(jīng)SDS-PAGE后以Flag MAb（1∶1 000）為一抗， 山羊抗鼠IgGHRP（1∶2 000）為二抗，采用western blot 鑒定gSLAM蛋白的表達(dá)，設(shè)正常Vero 細(xì)胞和感染Ad 的Vero 細(xì)胞（Vero/Ad）為對照。

1.7 PPRV 在感染rAd-gSLAM 的Vero 細(xì)胞中復(fù)制能力的檢測及生長曲線的測定將rAd-gSLAM 以MOI 3 感染12 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中密度約90%的Vero 細(xì)胞，設(shè)正常Vero 細(xì)胞和感染Ad 的Vero 細(xì)胞為對照，24 h 后分別感染rPPRV/GFP 和PPRV/CN/HLJ/13，48 h 后在倒置熒光顯微鏡下觀察。分別于感染后24 h、48 h、72 h、96 h、120 h 收獲細(xì)胞及上清，反復(fù)凍融3 次后提取RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA 后做模板，經(jīng)qPCR 檢測PPRV N 基因的拷貝數(shù)[7]，分別根據(jù)拷貝數(shù)繪制rPPRV/GFP 和PPRV/CN/HLJ/13 的生長曲線。分別設(shè)Vero/Ad 和正常的Vero 細(xì)胞作對照。針對PPRV Nigeria75/1 株（X74443）和PPRV/CN/HLJ/13 株N 基因（本實驗室測序）設(shè)計qP?CR 探針及引物：探針N13-75-probe：FAM-5'-CA AGTATGAGAGATACCATGAACCGCCG-3'-Tamra， 引物為N13-75-f：5'-AACTGAGAAGGTGGGTTAAATAC AC-3'/N13-75-r：5'-ACAATATAGTTGTCAATGTCGC AGA-3'。反應(yīng)體系及反應(yīng)程序按照AceQ?U+ Probe Master Mix 說明書操作。利用Excel 軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，組間比較采用t 檢驗，p＜0.05 差異顯著，有統(tǒng)計學(xué)意義。

1.8 PPRV 在感染rAd-gSLAM 的原代LT 細(xì)胞中復(fù)制能力的檢測將rAd-gSLAM 以MOI 3 感染原代LT細(xì)胞，設(shè)正常LT 細(xì)胞和感染Ad 的原代LT 細(xì)胞為對照，24 h 后以MOI 0.1 分別感染rPPRV/GFP 和PPRV/CN/HLJ/13，72 h 后，在倒置熒光顯微鏡下觀察不同細(xì)胞的感染情況。

2 結(jié) 果

2.1 重組腺病毒載體pAd-gSLAM-mCherry 和重組腺病毒rAd-gSLAM 的鑒定經(jīng)測序鑒定結(jié)果顯示重組穿梭質(zhì)粒pShuttle-gSLAM-mCherry 正確構(gòu)建。Pme I 線性化的重組穿梭載體pShuttle-gLAM-mCher?ry 與BJ5183 細(xì)菌中的腺病毒骨架質(zhì)粒pAdEasy-1 同源重組，得到重組腺病毒載體pAd-gSLAM-mCher?ry，經(jīng)Pac I 酶切后得到約30 kb 和4.5 kb 大小的片段，表明重組腺病毒載體正確構(gòu)建（結(jié)果未顯示）。將重組腺病毒載體轉(zhuǎn)染293A 細(xì)胞，7 d 后經(jīng)熒光顯微鏡觀察到紅色熒光。待細(xì)胞出現(xiàn)CPE 后，提取DNA，經(jīng)PCR 鑒定可擴(kuò)增出約1 800 bp 大小的條帶，與預(yù)期相符（圖略），表明獲得了攜帶外源基因gSLAM 的重組腺病毒rAd-gSLAM。

2.2 重組腺病毒感染細(xì)胞及外源基因表達(dá)的檢測結(jié)果第3 代rAd-gSLAM 經(jīng)測定，其效價可達(dá)108.2TCID50/mL。將其以MOI 3 感染Vero 細(xì)胞后24 h，經(jīng)熒光顯微鏡觀察約95%以上細(xì)胞出現(xiàn)紅色熒光，感染120 h 后細(xì)胞仍然有紅色熒光但一直無CPE（圖1A），表明rAd-gSLAM 能夠感染Vero 細(xì)胞但不產(chǎn)生CPE。收獲感染48 h 的細(xì)胞經(jīng)western blot 鑒定。結(jié)果顯示，在約55 ku 附近出現(xiàn)特異性條帶，與預(yù)期相符（圖1B）。以上結(jié)果表明該重組腺病毒感染細(xì)胞后能夠表達(dá)gSLAM 蛋白。

2.3 PPRV 在 感染rAd-gSLAM 的Vero 細(xì) 胞 中復(fù) 制能力的檢測結(jié)果將rAd-gSLAM 以MOI 3 感染Vero細(xì)胞24 h 后分別感染rPPRV/GFP、PPRV/CN/HLJ/13，48 h 后經(jīng)熒光顯微鏡觀察可見，rPPRV/GFP 感染的Vero/rAd-gSLAM 細(xì)胞可觀察到較大量綠色熒光且形成明顯的細(xì)胞融合，而其感染的Vero、Vero/Ad細(xì)胞可觀察到較少量綠色熒光且無明顯細(xì)胞融合（圖2）；PPRV/CN/HLJ/13感染的Vero/rAd-gSLAM細(xì)胞中形成明顯的細(xì)胞融合且出現(xiàn)紅色熒光，而該病毒感染的Vero 細(xì)胞和Vero/Ad 細(xì)胞則無細(xì)胞融合（圖2）。表明感染rAd-gSLAM 的Vero 細(xì)胞表達(dá)SLAM受體后利于PPRV 的感染和復(fù)制。

2.4 PPRV 在 感染rAd-gSLAM 的Vero 細(xì) 胞 中生 長曲線的測定rPPRV/GFP、PPRV/CN/HLJ/13 感染Ve?ro/rAd-gSLAM 細(xì)胞后不同時間經(jīng)qPCR 檢測PPRV N基因拷貝數(shù)，根據(jù)Excel 繪制的生長曲線結(jié)果顯示，rPPRV/GFP 在Vero/rAd-gSLAM 細(xì)胞中的拷貝數(shù)與其在Vero 和Vero/Ad 對照細(xì)胞中的拷貝數(shù)在感染后各時間點差異均不顯著（p＞0.05）（圖3A）；PPRV/CN/HLJ/13 在感染Vero/rAd-gSLAM 細(xì)胞后24 h 的拷貝數(shù)即達(dá)到高峰，隨后下降，在72 h 最低，再小幅度上升；而其感染Vero 及Vero/Ad 細(xì)胞后的拷貝數(shù)分別在72 h 和96 h 達(dá)到高峰，且PPRV/CN/HLJ/13 在Vero/rAd-gSLAM 細(xì)胞中的拷貝數(shù)與其在Vero 和Vero/Ad 對照細(xì)胞中的拷貝數(shù)差異均顯著（p＜0.05）；其感染Vero/rAd-gSLAM 細(xì)胞后72 h 的拷貝數(shù)仍約為其感染Vero 及Vero/Ad 細(xì)胞的48 倍（圖3B）。結(jié)果表明gSLAM 的表達(dá)對PPRV/CN/HLJ/13 在Vero 細(xì)胞中的復(fù)制有明顯增強(qiáng)作用，但對rPPRV/GFP 的復(fù)制無明顯增強(qiáng)作用。

圖1 rAd-gSLAM 感染Vero 細(xì)胞后gSLAM 蛋白表達(dá)的鑒定結(jié)果Fig. 1 Identification of gSLAM protein expression in Vero cells infected with rAd-gSLAM

2.5 PPRV 在感染rAd-gSLAM 的LT 細(xì)胞中復(fù)制能力的檢測結(jié)果將rAd-gSLAM 感染LT 細(xì)胞后24 h，再感染rPPRV/GFP，72 h 后利用熒光顯微鏡觀察可見綠色熒光，且有明顯的細(xì)胞融合，而正常LT 細(xì)胞和LT/Ad 細(xì)胞在感染rPPRV/GFP 后無明顯的細(xì)胞融合出現(xiàn)，且僅可見零星細(xì)胞出現(xiàn)綠色熒光；PPRV/CN/HLJ/13 感染rAd-gSLAM 預(yù)先感染的LT 細(xì)胞72 h可見明顯的細(xì)胞融合和CPE（圖4，箭頭所指為細(xì)胞融合和CPE），而正常LT 細(xì)胞和LT/Ad 細(xì)胞感染該病毒后均未出現(xiàn)細(xì)胞融合和CPE。表明rAd-gSLAM感染LT 細(xì)胞后表達(dá)了gSLAM 受體，且PPRV 可以在表達(dá)gSLAM 的羊源原代細(xì)胞中感染和復(fù)制。

圖2 rAd-gSLAM 感染Vero 后對PPRV 感染和復(fù)制影響的檢測結(jié)果Fig. 2 Detection of the PPRV infection and replication in Vero cells after rAd-gSLAM infection

圖3 rPPRV/GFP（A）和PPRV/CN/HLJ/13（B）在Vero/rAd-gSLAM 中的生長曲線Fig. 3 Growth curve of rPPRV/GFP (A) and PPRV/CN/HLJ/13(B) in Vero/rAd-gSLAM

圖4 PPRV 在感染rAd-gSLAM 的LT 細(xì)胞中復(fù)制的鑒定結(jié)果Fig. 4 Observation of PPRV replication in LT cells infected with rAd-gSLAM

3 討 論

SLAM 為PPRV 的主要受體，對該受體展開研究對PPRV 感染機(jī)制的闡明意義重大。之前有報道通過構(gòu)建表達(dá)犬SLAM 的Vero 細(xì)胞系來提高PPRV 的感染和復(fù)制能力，但篩選單克隆細(xì)胞的過程比較繁瑣，耗時較長（2 個月以上），且該方法不適用于原代細(xì)胞[6]。吳錦艷等利用重組慢病毒表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建的Vero/SLAM 細(xì)胞具有明顯增強(qiáng)PPRV 復(fù)制的功能，但該研究的目的也是構(gòu)建細(xì)胞系，不適用于原代細(xì)胞[8]。重組慢病毒瞬時感染也可以在原代細(xì)胞中表達(dá)受體，但慢病毒感染譜比腺病毒窄，表達(dá)效率不如腺病毒，且慢病毒包裝繁瑣而不易制備，病毒滴度低，更適用于構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)外源基因的細(xì)胞系，而在原代細(xì)胞中瞬時表達(dá)病毒受體，腺病毒則更有優(yōu)勢。本研究構(gòu)建的表達(dá)gSLAM 的重組腺病毒rAd-gSLAM 屬于5 型復(fù)制缺陷型Ad，3周左右就能完成其構(gòu)建，并避免了構(gòu)建表達(dá)受體的不同細(xì)胞系的繁瑣步驟，同時還具備適用于原代細(xì)胞、感染率高、對感染細(xì)胞無影響、成本低、易于制備等優(yōu)點。本實驗構(gòu)建的重組腺病毒滴度能達(dá)到109TCID50/mL，不用濃縮純化即能獲得較高滴度的重組病毒，感染細(xì)胞后，可以使95%以上的細(xì)胞感染并表達(dá)gSLAM 受體。但腺病毒感染不同細(xì)胞存在不均一現(xiàn)象，導(dǎo)致不同細(xì)胞表達(dá)的受體量不同而對PPRV 感染均一性產(chǎn)生影響，在均一性上不如表達(dá)受體的細(xì)胞系[10]。

Vero 細(xì)胞、原代羔羊腎細(xì)胞和肺臟細(xì)胞等作為OIE 推薦的分離PPRV 的細(xì)胞，一般需要盲傳幾代，表明這幾種細(xì)胞對PPRV 的易感性較差，而且在傳代中病毒容易突變。而本研究結(jié)果表明，Vero 細(xì)胞感染rAd-gSLAM 后均可以提高PPRV 流行株的感染和復(fù)制能力，且感染后的Vero 細(xì)胞出現(xiàn)明顯融合現(xiàn)象，并且較大幅度提高了該株病毒的復(fù)制水平。但感染rAd-gSLAM 后的Vero 細(xì)胞對rPPRV/GFP 復(fù)制的增強(qiáng)作用不明顯，主要原因是由于該疫苗株就是PPRV 強(qiáng)毒株在Vero 細(xì)胞中適應(yīng)100 多代次獲得的[11]，其已經(jīng)完全適應(yīng)了Vero 細(xì)胞。流行株P(guān)PRV/CN/HLJ/13 感染Vero/rAd-gSLAM 細(xì)胞后，24 h 病毒拷貝數(shù)就能夠達(dá)到高峰，大幅度提高了該病毒的復(fù)制能力。同樣，感染rAd-gSLAM 后的原代LT 細(xì)胞，同樣也提高了PPRV 疫苗株和流行株的感染和復(fù)制能力，且LT 作為羊源細(xì)胞，更適用于PPRV 臨床樣品的分離與鑒定。由于原代LT 細(xì)胞不是PPRV的敏感細(xì)胞，本實驗僅經(jīng)顯微鏡就能觀察到PPRV感染gSLAM 受體表達(dá)的LT 細(xì)胞與感染未表達(dá)該受體LT 細(xì)胞的明顯不同，因此未采用熒光定量PCR檢測病毒拷貝數(shù)。

綜上，本研究構(gòu)建了表達(dá)gSLAM 的重組腺病毒，為PPRV 在羊源細(xì)胞中的生長、復(fù)制提供了重要的工具，為PPRV 在本動物體外感染與免疫機(jī)制的研究奠定了重要基礎(chǔ)。