FQ-PCR法聯(lián)合咽拭子快速培養(yǎng)法在疑似肺炎支原體感染患兒診斷中的應(yīng)用價(jià)值

張美華，徐清芳，黃凱達(dá)

(1.駐馬店市第一人民醫(yī)院 檢驗(yàn)科，河南 駐馬店 463000；2.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院 檢驗(yàn)科，河南 鄭州 450000)

肺炎支原體(Mycoplasmapneumoniae，MP)為常見(jiàn)兒童呼吸道感染病原體，尤以兒童肺炎較為常見(jiàn)。調(diào)查顯示，社區(qū)兒童獲得性肺炎10%～30%由MP引發(fā)，但MP感染肺炎、其他病原菌感染肺炎臨床體征、癥狀等方面無(wú)特異性區(qū)別，故診斷難度較大，不利于臨床診療[1]。MP感染若未及時(shí)有效診治，隨病情進(jìn)展，可引起肺外感染，尋求一種高效的早期診斷方法，對(duì)防治MP感染有積極意義。直接檢出病原體為MP診斷金標(biāo)準(zhǔn)，然而MP培養(yǎng)、分離條件高，生長(zhǎng)緩慢，培養(yǎng)耗時(shí)長(zhǎng)，故臨床應(yīng)用明顯受限[2]。因此，尋求一種快速有效的檢測(cè)方法，早期明確有無(wú)MP感染，對(duì)指導(dǎo)臨床治療有重要價(jià)值。實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(fluorescence quantitative polymerase chain reaction，F(xiàn)Q-PCR)法、快速培養(yǎng)法為近年來(lái)興起的MP感染診斷方式，可快速測(cè)定咽拭子標(biāo)本中MP-DNA，具有快速、不受病程影響等優(yōu)勢(shì)，在MP所致肺炎鑒別中被廣泛應(yīng)用[3]。但單一檢測(cè)準(zhǔn)確度較低，易出現(xiàn)漏診、誤診現(xiàn)象，會(huì)延誤病情?；诖耍狙芯刻接慒Q-PCR聯(lián)合咽拭子快速培養(yǎng)法在疑似MP感染患兒診斷中的應(yīng)用價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2018年4月至2020年3月就診于駐馬店市第一人民醫(yī)院的100例疑似MP感染患兒，男63例，女37例，年齡6個(gè)月～10歲，平均(5.14±2.23)歲，病程2～13 d，平均(7.46±2.61)d，<1歲23例，1～6歲41例，>6歲36例?；颊呒覍僦獣员狙芯?，簽署知情同意書(shū)。本研究經(jīng)駐馬店市第一人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批通過(guò)。

1.2 選取標(biāo)準(zhǔn)(1)納入標(biāo)準(zhǔn)：①就診時(shí)存在不同程度發(fā)熱、咳嗽癥狀；②胸部X線顯示雙肺呈片狀陰影；③對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素效果好，對(duì)頭孢、青霉素等抗生素?zé)o效；④白細(xì)胞計(jì)數(shù)稍高或正常，血沉多增快。(2)排除標(biāo)準(zhǔn)：①入組前3 d接受大環(huán)內(nèi)酯類藥物治療；②全身感染、藥物過(guò)敏史；③心、肝、腎功能不全；④免疫缺陷、血液系統(tǒng)疾病。

1.3 標(biāo)本采集及檢測(cè)方法采集標(biāo)本：就診當(dāng)天，在無(wú)菌條件下由專業(yè)兒科護(hù)士取患兒咽拭子樣本，置于無(wú)菌生理鹽水，震蕩、密封，-20 ℃低溫保存待測(cè)。檢測(cè)方法：以FQ-PCR法、快速培養(yǎng)法測(cè)定MP，嚴(yán)格根據(jù)說(shuō)明書(shū)操作，快速培養(yǎng)法試劑盒購(gòu)自鄭州內(nèi)瑞特生物技術(shù)公司，F(xiàn)Q-PCR法試劑盒購(gòu)自廣州中山大學(xué)達(dá)安基因公司，儀器為實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增儀(杭州，博日l(shuí)ine gene)。血清學(xué)檢測(cè)：取患兒2 mL靜脈血，離心，取上清液，采用間接熒光免疫法測(cè)定MP-IgM；單份血清MP-IgM陽(yáng)性(雙份血清MP-IgM滴度增高>4倍)，滴度≥1∶80即可判定為MP感染。

1.4 聯(lián)合診斷標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性：FQ-PCR法、快速培養(yǎng)法診斷結(jié)果任一陽(yáng)性。陰性：二者診斷結(jié)果均為陰性。

1.5 觀察指標(biāo)(1)以血清學(xué)檢測(cè)為“金標(biāo)準(zhǔn)”，記錄FQ-PCR法、快速培養(yǎng)法及兩者聯(lián)合檢測(cè)結(jié)果。(2)比較快速培養(yǎng)法、FQ-PCR法及聯(lián)合檢測(cè)準(zhǔn)確度、特異度、靈敏度、陰性預(yù)測(cè)值、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值。(3)分析MP-IgM陰性、陽(yáng)性患兒MP-DNA拷貝數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 檢測(cè)結(jié)果FQ-PCR法、快速培養(yǎng)法及兩者聯(lián)合檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 FQ-PCR法、快速培養(yǎng)法及兩者聯(lián)合檢測(cè)結(jié)果(n)

2.2 診斷效能聯(lián)合檢測(cè)特異度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值與單一FQ-PCR法檢測(cè)和快速培養(yǎng)法檢測(cè)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；聯(lián)合檢測(cè)靈敏度、準(zhǔn)確度、陰性預(yù)測(cè)值高于單一FQ-PCR法檢測(cè)和快速培養(yǎng)法檢測(cè)(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 FQ-PCR法、快速培養(yǎng)法及兩者聯(lián)合檢測(cè)診斷效能比較(%)

2.3 MP-DNA拷貝數(shù)MP-IgM陰性患兒MP-DNA拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)值為(4.08±1.36)mL-1，陽(yáng)性患兒拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)值為(5.81±1.64)mL-1。陽(yáng)性患兒MP-DNA拷貝數(shù)高于陰性患兒(t=5.554，P<0.001)。

3 討論

MP是一種機(jī)體常見(jiàn)的呼吸道感染病原體，可引發(fā)多系統(tǒng)損傷。相關(guān)研究指出，MP潛伏期也存在傳染性，且近年來(lái)呈局部流行趨勢(shì)，嚴(yán)重影響患兒生活質(zhì)量[4]。細(xì)菌性、病毒性呼吸道感染僅根據(jù)臨床體征難以準(zhǔn)確區(qū)分，且MP感染患兒對(duì)抗生素不敏感，故易延誤治療時(shí)間，增加肺外并發(fā)癥發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。早期快速有效的MP感染診斷方式對(duì)臨床治療至關(guān)重要。

血清學(xué)檢測(cè)為現(xiàn)階段MP感染主要診斷方式，準(zhǔn)確率較高，對(duì)臨床鑒別MP感染、早期治療有重要指導(dǎo)價(jià)值，但MP-IgM常出現(xiàn)在感染后7 d，有一定的延后性，另外對(duì)于免疫缺陷患兒或免疫系統(tǒng)尚未發(fā)育完善的新生兒，血清學(xué)檢測(cè)具有明顯局限性[5]?？焖倥囵B(yǎng)法為近年來(lái)新興的MP直接檢測(cè)方法，培養(yǎng)液中含快速生長(zhǎng)因子、高營(yíng)養(yǎng)成分，樣本中僅有少量病原體就可實(shí)現(xiàn)快速繁殖，并于12～24 h得出結(jié)果，具有快速、簡(jiǎn)單、敏感等優(yōu)勢(shì)，但其特異度較低[6]。FQ-PCR法為體外擴(kuò)增特異DNA片段新技術(shù)，逐漸被應(yīng)用于早期MP感染檢測(cè)，可使極微量核酸片段于短時(shí)間內(nèi)擴(kuò)增到幾百萬(wàn)個(gè)拷貝，具有快捷、簡(jiǎn)便、靈敏度高、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)[7]。相較于常規(guī)PCR，F(xiàn)Q-PCR法增加可識(shí)別擴(kuò)增產(chǎn)物探針，同時(shí)輔以熒光標(biāo)記，應(yīng)用計(jì)算機(jī)掃描產(chǎn)物過(guò)程中熒光曲線，換算為DNA拷貝數(shù)，可準(zhǔn)確定量目標(biāo)，且操作方便，較短時(shí)間即可得到結(jié)果，能降低擴(kuò)增產(chǎn)物污染風(fēng)險(xiǎn)，減少假陽(yáng)性發(fā)生[8]。有研究指出，發(fā)病7 d內(nèi)FQ-PCR法診斷特異度、敏感度可達(dá)90%以上，高于血清檢測(cè)，然而隨病程延長(zhǎng)，血液檢查敏感度會(huì)逐漸升高，因此FQ-PCR法更適合早期快速診斷[9]。另有報(bào)道指出，F(xiàn)Q-PCR法、快速培養(yǎng)法在MP感染檢測(cè)中均有一定誤差，但二者檢測(cè)機(jī)制不同，聯(lián)合應(yīng)用可起互補(bǔ)作用，能取長(zhǎng)補(bǔ)短，互相佐證，提高診斷準(zhǔn)確性[10]。本研究結(jié)果顯示，快速培養(yǎng)法聯(lián)合FQ-PCR法檢測(cè)靈敏度、準(zhǔn)確度、陰性預(yù)測(cè)值較單一FQ-PCR法檢測(cè)及快速培養(yǎng)法檢測(cè)高，可見(jiàn)將咽拭子快速培養(yǎng)法、FQ-PCR法聯(lián)合應(yīng)用于疑似MP感染患兒診斷中，可提高靈敏度、準(zhǔn)確度、陰性預(yù)測(cè)值，有助于早期對(duì)癥治療，改善預(yù)后。

綜上，咽拭子快速培養(yǎng)法聯(lián)合FQ-PCR法在疑似MP感染患兒診斷中具有較高的靈敏度、準(zhǔn)確度、陰性預(yù)測(cè)值，且熒光拷貝數(shù)越高對(duì)診斷MP感染越有利，可為臨床明確MP感染和早期治療提供依據(jù)。