蒲公英水提物聯(lián)合抗菌藥對含CTX-M基因多重耐藥大腸桿菌的體外抑菌效果研究

李 錚，李 崇，沈水寶，司紅彬

(廣西大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣西 南寧 530003)

大腸桿菌是常見的條件致病菌，也是畜禽腸道微生物的重要組成部分，由于養(yǎng)殖業(yè)的關(guān)系，大腸桿菌可以長期與抗菌藥物接觸使得其比其他細(xì)菌更容易產(chǎn)生耐藥性。這其中大腸桿菌最常攜帶的就是產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(Extended spectrum β-lactamases,ESBLs)耐藥基因[1]。超廣譜β-內(nèi)酰胺酶有很多種不同的類型，其中最主要的類型有：TEM型、SHV型、CTX-M型、OXA型和其他型。其中，CTX-M型是最新發(fā)現(xiàn)的也是傳播最廣的β-內(nèi)酰胺類藥物耐藥基因類型，從1989年該耐藥基因被首次發(fā)現(xiàn)，到2017年，已發(fā)現(xiàn)了超過190余種CTX-M的亞型在全球范圍傳播[2]。于是，治療攜帶CTX-M耐藥基因的致病性大腸桿菌成為養(yǎng)殖業(yè)的難題之一。

蒲公英(TaraxacummongolicumHand.-Mazz.)菊科，蒲公英屬多年生草本植物，中藥蒲公英是由蒲公英屬植物的全草經(jīng)炮制后制成的清熱解毒類中藥，呈干草狀。其味苦，性寒，無毒，入肝經(jīng)、胃經(jīng)，具有良好的抑菌抗炎、利膽保肝、降血糖、降血脂[3]、抗氧化、抗腫瘤[4]等作用。研究發(fā)現(xiàn)，蒲公英成分復(fù)雜，但其中有效的抑菌活性成分大致包括以下幾種：黃酮類、多糖類、酚酸類植物甾醇類、倍半萜內(nèi)酯類[5]等。目前關(guān)于蒲公英抑菌效果的研究有很多[5-7]，但是很少有關(guān)于蒲公英聯(lián)合抗菌藥物抑菌的報道。本試驗旨在研究蒲公英水提液聯(lián)合多種抗菌藥物對CTX-M型的產(chǎn)ESBLs大腸桿菌的體外抑菌效果，為中藥蒲公英的研究和大腸桿菌疾病的治療提供更多的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 中藥蒲公英干草，購自廣西太華藥業(yè)有限公司；受試菌株由廣西大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院中獸醫(yī)實驗室分離保存；林可霉素、氟苯尼考、左旋氧氟沙星、痢菌凈、加替沙星、阿奇霉素和鏈霉素等11種抗菌藥均在有效期內(nèi)，并根據(jù)需要配置成不同濃度的溶液；麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基、LB肉湯等，均購自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.2 蒲公英水提液的制備和抗菌藥物的配置 稱取干燥蒲公英中藥100 g至燒杯中，加10倍的蒸餾水浸泡過夜。然后煮沸1 h，紗布過濾，逐次加入8倍、6倍的蒸餾水重復(fù)上述步驟，3次濾液合并、抽濾、濃縮至100 mL，此時蒲公英的濃度約為1 g/mL。根據(jù)藥典用不同溶劑將阿莫西林、環(huán)丙沙星、左旋氧氟沙星、林可霉素、阿奇霉素、利福平、土霉素和鏈霉素配置成濃度為6 400 μg/mL的溶液；氟苯尼考配置成濃度為5 120 μg/mL的溶液；痢菌凈和加替沙星配置成濃度為3 200 μg/mL的溶液。

1.3 大腸桿菌的分離及基因型鑒定 將30%甘油保存的菌株接種到 LB試管肉湯中震蕩培養(yǎng)過夜，然后劃線接種到伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基和麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上，37 ℃ 培養(yǎng)16～18 h。參考孫燕杰等[1]設(shè)計的16S rDNA和CTX-M引物(見表1)進(jìn)行疑似大腸桿菌菌株的PCR及瓊脂糖凝膠電泳。PCR反應(yīng)體系：Mix 12.5 μL；去離子水8.5 μL；上、下游引物各1 μL；菌液模板2 μL。PCR擴(kuò)增條件：94 ℃，5 min；94 ℃,30 s；退火溫度見表1，30 s；72 ℃， 1 min；循環(huán)30次；72 ℃，10 min。16S rDNA送至武漢金凱瑞生物有限公司測序。

表1 16S rDNA與CTX-M引物序列與退火溫度Table 1 16S rDNA and CTX-M primer sequences and annealing temperature

1.4 菌懸液制備 從麥康凱培養(yǎng)基上挑取單個菌落于LB試管肉湯中，放入搖床37 ℃、220 r/min培養(yǎng)5 h，用LB肉湯培養(yǎng)基將菌懸液稀釋至0.5麥?zhǔn)媳葷岫取?/p>

1.5 蒲公英和抗菌藥物對含CTX-M大腸桿菌最小抑菌濃度的測定 采用微量肉湯稀釋法測定中藥蒲公英和11種抗菌藥對該大腸桿菌的最小抑菌濃度(Minimum inhibitory concentration,MIC)，過程及結(jié)果判斷嚴(yán)格按照美國臨床和實驗室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)標(biāo)準(zhǔn)(2017版)的方法進(jìn)行。

1.6 蒲公英和抗菌藥聯(lián)合誘導(dǎo)細(xì)菌傳代 將蒲公英水提液加入到LB肉湯中稀釋為亞抑菌濃度，即1/2 MIC，加入適量菌懸液使細(xì)菌濃度達(dá)到106CFU/mL。將上述混合物加入到96孔板中，再加入抗菌藥。使抗菌藥的最終濃度為2倍MIC，蒲公英水提液的終濃度為1/2 MIC，此即為第1代，按同樣的方法(不加菌懸液)配置第2、3代，其中細(xì)菌從前1代接種,記錄各代的MIC。

1.7 蒲公英和抗菌藥聯(lián)合微量棋盤稀釋法 將蒲公英和抗菌藥分別做豎向和橫向的倍比稀釋，然后合并，再加入同體積的106CFU/mL菌懸液。藥物的互相作用效應(yīng)通過計算其最小部分抑菌濃度指數(shù)(Fractional inhibitory concentration indices,FICI)來進(jìn)行判斷，判斷標(biāo)準(zhǔn)：當(dāng)FICI≤0.5，為協(xié)同效應(yīng)；當(dāng)0.52，為拮抗效應(yīng)。

2 結(jié)果

2.1 菌株形態(tài)特征 在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上該菌株的形態(tài)為：玫紅色圓形光滑菌落(見中插彩版圖1A)。在伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基上該菌的形態(tài)：株菌落中心為紫黑色，混合部分有綠色金屬光澤的圓形光滑菌落(見中插彩版圖1B)。菌株可認(rèn)定為疑似大腸桿菌菌株。

圖1 細(xì)菌在麥康凱培養(yǎng)基(A)和伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基(B)上的形態(tài)特征Fig.1 Morphological characteristics of bacteria on McConkey medium (A) and Eosin methylene blue medium (B)

2.2 菌株及基因型鑒定 PCR電泳結(jié)果顯示，16S rDNA和CTX-M基因的片段長度與預(yù)期相同(見圖2)，可確定該細(xì)菌含有CTX-M基因，同時，將16S rRNA測序結(jié)果于NCBI上進(jìn)行比對分析，最后確定該細(xì)菌為含有CTX-M基因的大腸桿菌。

圖2 大腸桿菌16S rRNA(A)及CTX-M(B)結(jié)果Fig.2 Results of Escherichia coli 16S rRNA (A) and CTX-M (B)M:DL-2 000 DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)； 1：空白對照； 2：受試大腸桿菌M:DL-2 000 DNA marker; 1:Blank control; 2:Tested E. coli

2.3 蒲公英及抗菌藥物對大腸桿菌的MIC、傳代及聯(lián)合作用效果 由表2可知，蒲公英對該大腸桿菌的MIC值為250 mg/mL。該大腸桿菌對所選的阿莫西林、左旋氧氟沙星、林可霉素、利福平、土霉素等的MIC均≥1 600 μg/mL；對環(huán)丙沙星、痢菌凈、加替沙星和阿奇霉素的MIC均≥200 μg/mL；但是對鏈霉素的MIC較小，為50 μg/mL。蒲公英和抗菌藥聯(lián)合誘導(dǎo)該大腸桿菌傳代發(fā)現(xiàn)，痢菌凈隨著傳代其MIC逐漸降低；阿莫西林、左旋氧氟沙星、氟苯尼考、阿奇霉素和利福平等隨著傳代其MIC只出現(xiàn)一次降低，且降低幅度不一；環(huán)丙沙星、加替沙星、土霉素和鏈霉素等隨著傳代其MIC出現(xiàn)升高現(xiàn)象。蒲公英和抗菌藥聯(lián)合棋盤發(fā)現(xiàn)，與傳代結(jié)果相似，痢菌凈、氟苯尼考、阿奇霉素和利福平等與蒲公英聯(lián)用對該大腸桿菌呈相加作用；阿莫西林、左旋氧氟沙星、加替沙星、林可霉素和土霉素等與蒲公英聯(lián)用對該大腸桿菌呈無關(guān)作用；環(huán)丙沙星和鏈霉素與蒲公英聯(lián)用對該大腸桿菌呈拮抗作用。

表2 抗菌藥的最小抑菌濃度及聯(lián)合蒲公英的傳代、棋盤結(jié)果Table 2 The minimum inhibitory concentration of antibacterial drugs and the results of the passage and checkerboard of the combination dandelion

3 討論

由于抗菌藥的大量使用和耐藥質(zhì)粒的快速傳播使得大腸桿菌的耐藥性也越來越嚴(yán)重，劉正明等[8]對內(nèi)蒙古地區(qū)羊源大腸桿菌的耐藥性研究和馮敏燕等[9]對山東省雞源大腸桿菌耐藥趨勢的研究，共同說明了大腸桿菌的耐藥性的嚴(yán)重不僅僅體現(xiàn)在耐藥的種類上，同樣也體現(xiàn)在抗菌藥的濃度上。

中藥在我國已經(jīng)有上千年的使用歷史，卻沒有發(fā)現(xiàn)存在細(xì)菌耐藥的現(xiàn)象，有著巨大的研究潛力，而清熱解毒藥的抑菌效果研究很早以前就已經(jīng)開始了，從1995年華娟等[10]用超聲提取法研究了50多種不同中藥對7種細(xì)菌的抑制效果；到2016年榮茜等[11]利用乙醇回流、超聲波等提取方法研究了25種中藥單獨和聯(lián)合使用抑制豬幽門螺旋桿菌的效果。這些研究都充分說明了中藥即使從西醫(yī)的角度研究，同樣具有可觀的效果。

蒲公英作為一種清熱解毒藥在本試驗中的MIC值為0.25 g/mL，在生產(chǎn)中直接應(yīng)用有限，但根據(jù)本實驗室研究思路，可考慮與抗菌藥物聯(lián)用達(dá)到增強(qiáng)抗菌藥物抑菌作用的效果，結(jié)果也顯示蒲公英在濃度為0.125 g/mL時與痢菌凈(濃度為6.25 μg/mL)、磺胺間甲氧嘧啶(濃度為25 μg/mL)、氟苯尼考(濃度為50 μg/mL)和利福平(濃度為800 μg/mL)聯(lián)用對大腸桿菌的抑制效果呈相加作用，同時，這4種抗菌藥聯(lián)用蒲公英水提液傳代可降低抗菌藥MIC，說明4種西藥聯(lián)用蒲公英水提液可有效增加抗菌藥的藥效或降低大腸桿菌的耐藥。