茵黃口服液的安全藥理學(xué)試驗(yàn)

李紫元，肖潔怡 , 龍小鈴，莫 藍(lán) , 梁偉燊，劉俊丹，邱文才，倫健熾，何永明，唐陸平

(佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院獸醫(yī)系，廣東 佛山 528000)

安全藥理學(xué)主要研究藥物在治療范圍或超出治療范圍劑量時(shí)，出現(xiàn)潛在的藥物不良影響[1]，是新藥臨床前安全性評(píng)價(jià)的重要組成部分。一般設(shè)計(jì)3個(gè)劑量組(其中低劑量組應(yīng)不低于臨床擬推薦劑量、高劑量組應(yīng)以不產(chǎn)生嚴(yán)重毒性反應(yīng)為限)，原則上應(yīng)與臨床擬用途徑一致，采用單次給藥[2]。心血管系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)是維持生命的重要系統(tǒng)，臨床前安全藥理學(xué)試驗(yàn)必需完成對(duì)這些系統(tǒng)的核心組合觀察[3]。茵黃口服液由茵陳和黃芩按2∶1比例組成，常規(guī)方法制備口服液，臨床擬用于治療畜禽藥物性急性肝損傷。本文參照《獸用中藥、天然藥物安全藥理學(xué)研究技術(shù)指導(dǎo)原則》對(duì)茵黃口服液的安全藥理學(xué)進(jìn)行試驗(yàn)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器 MC4000小動(dòng)物無(wú)創(chuàng)血壓分析儀，美國(guó)Hatteras公司；EMKA小動(dòng)物無(wú)創(chuàng)肺功能檢測(cè)系統(tǒng)，法國(guó)EMKA Technologies公司；YLS-1B多功能小鼠自主活動(dòng)記錄儀，山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院設(shè)備站；XZC-5C小鼠轉(zhuǎn)棒式疲勞儀，山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院設(shè)備站。

1.2 主要試劑和藥物 戊巴比妥鈉(進(jìn)口分裝)；茵陳(批號(hào)20170525)購(gòu)自北京本草方源藥業(yè)集團(tuán)有限公司；黃芩(批號(hào)70550601)購(gòu)自北京三和藥業(yè)有限公司。茵黃口服液小試產(chǎn)品，本實(shí)驗(yàn)室自制。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及飼喂 SPF級(jí)KM小鼠，體質(zhì)量(20±2)g。所有動(dòng)物雌雄各半，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)：SCXK(粵)2013-0002。高壓滅菌全價(jià)顆粒飼料，由廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供；給料方式自由攝取。飲用水，瓶裝蒸餾水，由動(dòng)物飲水瓶自由攝取。墊料為消毒木屑，由廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)管理的環(huán)境條件：屏障系統(tǒng)內(nèi)飼養(yǎng)，溫度20～25 ℃，濕度40%～70%，換氣次數(shù)10～ 20 次/h，從購(gòu)入日算作第1天，檢疫與馴化期共為3 d。期間對(duì)外觀、一般狀態(tài)進(jìn)行觀察，待穩(wěn)定后試驗(yàn)。

1.4 心血管系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)相關(guān)指標(biāo)測(cè)定 KM小鼠隨機(jī)分為4組，每組20只，雌雄各半，茵黃口服液按高劑量組[20 g/(kg·bw)]、中劑量組[10 g/(kg·bw)]、低劑量組[5 g/(kg·bw)]灌服，灌胃體積0.2 mL/(10 g·bw)，空白對(duì)照組灌服等體積的蒸餾水。分別使用MC4000無(wú)創(chuàng)血壓分析儀和EMKA無(wú)創(chuàng)肺功能分析儀記錄給藥前(-1 h)、給藥后(0、1、2 h和4 h)的血壓、脈搏、呼吸頻率、呼吸間隙和潮氣量等相關(guān)指標(biāo)[4-5]。

1.5 神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)指標(biāo)測(cè)定

1.5.1 對(duì)戊巴比妥鈉閾劑量催眠作用的影響 KM小鼠數(shù)量、分組及給藥方法同1.4，給藥50 min后，4組小鼠均腹腔注射50 mg/(kg·bw)閾劑量戊巴比妥鈉，出現(xiàn)翻正反射消失為入睡時(shí)間，從翻正反射消失至恢復(fù)時(shí)間為睡眠持續(xù)時(shí)間。記錄每只小鼠睡眠時(shí)間[6]。

1.5.2 對(duì)戊巴比妥鈉閾下劑量催眠作用的影響 KM小鼠數(shù)量、分組及給藥方法同1.4，給藥50 min后，4組小鼠均腹腔注射25 mg/(kg·bw)閾下劑量戊巴比妥鈉，小鼠翻正反射消失1 min以上為睡眠，記錄給藥后30 min內(nèi)睡眠小鼠只數(shù)。

1.5.3 對(duì)一般狀態(tài)、自主活動(dòng)的影響 KM小鼠數(shù)量、分組及給藥方法同1.4，在給藥后10、30 min和60 min，使用小鼠活動(dòng)記錄儀記錄小鼠10 min內(nèi)的活動(dòng)次數(shù)，并對(duì)小鼠生理狀態(tài)進(jìn)行觀察。

1.5.4 對(duì)機(jī)能協(xié)調(diào)運(yùn)動(dòng)的影響 篩選出在轉(zhuǎn)棒式疲勞儀上運(yùn)動(dòng)3 min(16 r/min)不墜落的KM小鼠80只，分組及給藥方法同1.4，于給藥后50 min，使用轉(zhuǎn)棒式疲勞儀(16 r/min)觀察小鼠機(jī)能協(xié)調(diào)運(yùn)動(dòng)(1 min和3 min內(nèi)的轉(zhuǎn)棒墜落率)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)收集整理采用Excel表格，采用IBM SPSS Statistics 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。先對(duì)資料作一般描述性分析，計(jì)算各計(jì)量資料的平均數(shù)、標(biāo)準(zhǔn)差，計(jì)數(shù)資料用百分?jǐn)?shù)(%)表示。計(jì)量資料先作正態(tài)性檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布及方差齊性采用單因素方差分析；非正態(tài)分布或方差不齊采用秩和檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn)。以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 茵黃口服液對(duì)心血管系統(tǒng)的影響 結(jié)果見(jiàn)表1。茵黃口服液給藥4 h后，高劑量組和低劑量小鼠的收縮壓、舒張壓顯著低于對(duì)照組(P<0.05)；小鼠脈搏相同時(shí)間點(diǎn)各組之間比較均不具有顯著性差異(P>0.05)。

2.2 茵黃口服液對(duì)呼吸系統(tǒng)的影響 結(jié)果見(jiàn)表2。茵黃口服液給藥后，各組相同時(shí)間點(diǎn)的呼吸頻率、潮氣量比較均沒(méi)有顯著性差異(P>0.05)。各組的呼吸曲線正常。

2.3 茵黃口服液對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的影響

2.3.1 對(duì)戊巴比妥鈉閾劑量催眠結(jié)果的影響 小鼠入睡時(shí)間，茵黃口服液高劑量組為(4.05±1.40) min、中劑量組為(9.4±8.1) min、低劑量組為(9.00±6.79) min、對(duì)照組為(11.47±11.27) min，高劑量組較對(duì)照組顯著減少(P<0.05)；睡眠維持時(shí)間，茵黃口服液高劑量組為(46.85±20.42) min、中劑量組為(38.26±19.22) min、低劑量組為(39.9±21.49) min、對(duì)照組為(32.58±23.09) min，高劑量組較對(duì)照組顯著延長(zhǎng)(P<0.05)。

2.3.2 對(duì)戊巴比妥鈉閾下劑量催眠結(jié)果的影響 閾下劑量催眠率，高劑量組為10%(2/20)、中劑量組為5%(1/20)、低劑量組為10%(2/20)、對(duì)照組為0%(0/20)，組間比較差異無(wú)顯著性(P>0.05)。

表1 茵黃口服液對(duì)小鼠收縮壓、舒張壓和脈搏的影響Table 1 Effect of Yinhuang oral liquid on systolic arterial pressure,diastolic arterial pressure and pulse in mice (n=20)

2.3.3 對(duì)一般狀態(tài)、自主活動(dòng)的結(jié)果 各組小鼠姿勢(shì)、步態(tài)均正常，活動(dòng)無(wú)異常，毛色光滑，無(wú)流涎、肌顫及瞳孔等變化。給藥前1 h和給藥后10、30 min和60 min的活動(dòng)次數(shù)，高劑量組分別為(206.8±40.0)次、(129.9±56.1)次、(144.1±51.7)次和(134.8±45.5)次；中劑量組為(196.8±26.5)次、(166.1±38.9)次、(151.6±39.0)次和(158.9±36.2)次；低劑量組為(198.1±22.2)次、(156.4±42.0)次、(153.0±36.8)次和(149.3±42.9)次；對(duì)照組為(192.7±39.5)次、(158.3±28.4)次、(142.8±32.1)次和(143.1±39.2)次。各組相同時(shí)間點(diǎn)自由活動(dòng)次數(shù)比較均無(wú)差異顯著性(P>0.05)。

2.3.4 對(duì)機(jī)能協(xié)調(diào)運(yùn)動(dòng)的結(jié)果 高劑量組小鼠1 min轉(zhuǎn)棒墜落率為10%(2/20)，對(duì)照組小鼠3 min轉(zhuǎn)棒墜落率為10%(2/20)，其余組別和時(shí)間均為0%。各組小鼠的轉(zhuǎn)棒墜落率相同時(shí)間點(diǎn)比較差異無(wú)顯著性(P>0.05)。

3 討論

3.1 茵黃口服液對(duì)心血管系統(tǒng)的影響 沈飛海等發(fā)現(xiàn)茵陳提取物灌胃對(duì)大鼠有一定的降血壓作用，其機(jī)制與顯著下調(diào)大鼠體內(nèi)的血管緊張素Ⅱ和血清NO的水平有關(guān)[7]。茵陳中的香豆素化合物，靜脈注射家兔，可顯著降低血壓，并且隨著用藥量的增加，血壓下降程度和時(shí)間也有增加和延長(zhǎng)[8]。黃芩苷有擴(kuò)張血管，降低血壓的作用，主要機(jī)制是通過(guò)阻滯平滑肌細(xì)胞膜上的電壓依賴型鈣通道和受體操縱型鈣離子通道使細(xì)胞內(nèi)的鈣離子濃度升高[9]。另有研究表明，黃芩苷有排鈉利尿的作用，減少外周血容量和心臟血輸出量，使得血壓下降。黃芩素不會(huì)影響正常大鼠的血壓，對(duì)高血壓大鼠有降壓作用[10]。推測(cè)用藥后4 h高劑量和低劑量組血壓下降與茵陳中的香豆素和黃芩中的黃芩苷等的降壓作用有關(guān)。中劑量組個(gè)別小鼠的血壓較高(導(dǎo)致標(biāo)準(zhǔn)差明顯偏高)，推測(cè)儀器通道本身存在的問(wèn)題抑或尾套血壓測(cè)試方法的問(wèn)題[11-12]，未能體現(xiàn)出降壓作用。是否如此，值得進(jìn)一步探索。

表2 茵黃口服液對(duì)小鼠呼吸頻率的影響Table 2 Effect of Yinhuang oral liquid on respiratory frequency of mice (n=20)

3.2 茵黃口服液對(duì)呼吸系統(tǒng)的影響 黃芩主入肺經(jīng)，長(zhǎng)于清肺熱，為治療肺熱咳喘之要藥；單用有效，即清金丸(《丹溪心法》)。黃芩對(duì)急性肺損傷有一定的治療作用[13]，黃芩苷可通過(guò)調(diào)節(jié)TH1/TH2和Th17/Treg等通路治療過(guò)敏性哮喘[14-15]。這提示黃芩對(duì)呼吸急促狀態(tài)下的呼吸頻率和潮氣量可能有一定的負(fù)向調(diào)節(jié)作用。茵黃口服液各劑量組的呼吸頻率、潮氣量、呼吸節(jié)律與空白對(duì)照組相同時(shí)間點(diǎn)比較，差異沒(méi)有顯著性，且均在正常范圍內(nèi)[16]，這提示茵黃口服液在20 g/(kg·bw)范圍內(nèi)給藥對(duì)正常動(dòng)物的呼吸系統(tǒng)無(wú)明顯影響。

3.3 茵黃口服液對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的影響 黃芩中的黃芩苷和黃芩素均有鎮(zhèn)靜作用，并且對(duì)神經(jīng)有一定的保護(hù)作用。黃芩苷對(duì)睡眠和覺(jué)醒有雙向調(diào)節(jié)作用：光照期會(huì)抑制IL-1的活性減少慢波睡眠(SWS)，黑暗期會(huì)增強(qiáng)GABA(A)受體活性來(lái)增加SWS和快速眼動(dòng)睡眠(REMS)[17]。黃芩素增加乙醚誘導(dǎo)的睡眠時(shí)間，藥理活性依賴于GABA的非苯二氮卓部位[18]。戊巴比妥鈉閾劑量催眠結(jié)果，茵黃口服液高劑量組小鼠的入睡時(shí)間顯著減少、睡眠維持時(shí)間顯著延長(zhǎng)；戊巴比妥鈉閾下劑量催眠結(jié)果，茵黃口服液各劑量組均有小鼠睡眠。這提示茵黃口服液可能具有鎮(zhèn)靜催眠作用，且其鎮(zhèn)靜催眠作用與方劑中的黃芩有關(guān)。

小鼠一般狀態(tài)、自主活動(dòng)的結(jié)果，同一時(shí)間點(diǎn)茵黃口服液各劑量組與對(duì)照組比較無(wú)差異顯著性(P>0.05)，但均較給藥前顯著減少，這與我們前期研究結(jié)果類(lèi)似[6]，原懷疑與測(cè)量時(shí)間選擇有關(guān)(傍晚-深夜)，本次試驗(yàn)排除此因素；懷疑與小鼠適應(yīng)周?chē)h(huán)境和灌胃應(yīng)激相關(guān)，需要做進(jìn)一步的研究證明。

茵黃口服液對(duì)心血管系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)安全藥理性研究表明，發(fā)現(xiàn)該方劑有一定的降壓作用，對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)有一定的鎮(zhèn)靜作用。